專利名稱：一種復合酶制劑及其用于提取植物多糖的應用和方法
技術領域：
本發明涉及一種復合酶制劑及其用于提取植物多糖的應用和方法，特別是涉及一種從中藥桑葉中提取桑葉多糖的方法。
背景技術：
天然多糖是一類重要的生物活性物質，具有多方面的生物活性和保健功能，可作為各種藥物和保健品的有效成分，對于預防和治療包括癌癥在內的多種疾病都具有巨大的潛力。常見的植物多糖有銀耳多糖、苦瓜多糖、黃芪多糖、茶多糖、香菇多糖、靈芝多糖、銀杏多糖、連翹多糖等。由于植物類中藥成分十分復雜且很多貴重有效成分含量很低，為微量甚至痕量， 因此，如何快速有效地從中藥材中提取分離和純化低含量成分，并保持較高的活性已成為中藥開發中的關鍵工序。但傳統的提取分離方法(如煎煮法、浸漬法、滲濾法、回流法等) 存在有效成分提取率不高、雜質清除率低等問題，這些根本問題制約著中藥開發的進程。因此，需要尋找一種具有反應特異性高、快速、高效、反應條件溫和且易于控制的提取植物多糖的方法。桑葉異名鐵扇子，為桑科桑屬Morus alba L.的樹葉。桑屬植物具有降血糖、降血壓、抗菌和抗病毒等多種生物活性。現代藥理研究證明桑葉可抑制血糖升高，具有預防和治療糖尿病的作用。除此之外，桑葉還具有祛風清熱、涼血明目的功效，主治風濕發熱、頭痛、 目赤、口渴、肺熱咳嗽、風痹等。具有藥性平和無毒副作用等特點，已經被國家衛生部正式歸入“既是食品又是藥品”之列。桑葉多糖作為桑葉中的有效成分之一，經過現代藥理研究表明其具有降血糖作用，對大鼠四氧嘧啶型糖尿病具有治療作用，因此提取、分離、純化桑葉多糖成分制成各種中成藥的前景十分廣闊。

發明內容
本發明的目的在于提供一種復合酶制劑，并將其應用在提取植物多糖，尤其是桑葉多糖中，進一步給出了具體的操作方法，該方法能在溫和的條件下對植物有效成分進行高選擇性轉化，不僅可以克服工業中常用的醇水提取方法中有效成分提取率低、工序復雜等問題，提高提取體系澄清度、改變藥材質地，還可以在提取中改變原有天然成分的結構， 增加提取物的生理活性，具有潛在的工業應用價值。為實現該目的，本發明采用以下技術方案—種復合酶制劑，其特征在于包括以下重量份的組分纖維素酶1-5份果膠酶 1-5份蛋白酶 2-12份所述蛋白酶選用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶中的至少一種。上述復合酶制劑用于提取植物多糖的應用。
上述復合酶制劑用于提取植物多糖的方法，其特征在于包括以下步驟(1)取植物材料，粉碎，加入蒸餾水，煮沸后冷卻備用；(2)取復合酶制劑加入適當蒸餾水，置于水浴鍋里40-60°C條件下活化10-30分鐘；(3)將步驟(2)與步驟(1)得到的溶液混合均勻，調節pH至4. 0-6. 0，在40_60°C 條件下酶解0. 5-2.0小時；(4)煎煮酶解液，控制加熱溫度，保持溶液在微沸的狀態；(5)離心，取上清液過濾，將濾液濃縮，得到植物多糖浸膏。所述植物為桑葉的條件下，應用上述酶制劑提取桑葉多糖包括以下步驟(1)取桑樹經風干的桑葉，粉碎，加入蒸餾水，煮沸后冷卻備用；(2)取復合酶制劑加入適當蒸餾水，置于水浴鍋里40-60°C條件下活化10-30分鐘；(3)將步驟(2)與步驟(1)得到的溶液混合均勻，調節pH至4.0-5.5，在40_551 條件下酶解0. 5-2.0小時；(4)煎煮酶解液，控制加熱溫度，保持溶液在微沸的狀態；(5)離心，取上清液過濾，將濾液濃縮，得到桑葉多糖浸膏。上面提到的提取植物多糖和進一步的提取桑葉多糖的方法中，所述植物粉碎至 40-100目，植物材料與加入的蒸餾水的質量比為1 10-30。所述的復合酶制劑與蒸餾水的質量比為1 5-15。步驟O)中所述的復合酶制劑添加量為步驟(1)植物材料添加量的1_4%。步驟中所述的浸提時間為1-2小時。本發明選用此種酶制劑的原理是纖維素酶可以分解植物纖維素；果膠酶可以破壞植物細胞壁；蛋白酶可以除去提取物中的蛋白質，提高提取物的純度。因為植物類細胞結構相同，三種結合，適用于植物的細胞內多糖的提取，具有較廣的應用范圍。與現有技術相比，本發明具有以下優點(1)本發明采用復合酶法提取植物多糖，反應條件溫和，能保持天然產物的構象， 不破壞其立體結構和生物活性，有利于保持有效成分原有的藥效。(2)本發明選用復合酶不僅能夠去除體系內雜質，提高提取液的澄清度，同時又提高了中藥有效成分的提取率。(3)本發明對復合酶的配比、提取時間、提取溫度、加酶量、PH值進行了優化組合， 實現了植物多糖提取得率的最大化。(4)本發明復合酶制劑用于提取植物多糖的方法中，步驟(4)具有滅活酶制劑，同時又進行了水提的功效，在采用酶提和水提結合的條件下，提高了活性成分的得率。(5)采用本發明從藥用植物桑葉中提取桑葉多糖，桑葉多糖提取率大于70mg/g， 而一般的水提醇提法，提取率一般僅為20-30mg/g，因此酶提法提取得率高。(6)本發明工藝簡單、操作方便、投資少、不會產生噪音和污染，適應工藝生產應用。
具體實施方式
實施例1(1)取桑樹經風干的桑葉，粉碎至100目，取該粉末9g，加入蒸餾水180ml，煮沸后冷卻備用；(2)取復合酶制劑纖維素酶0. 02g，果膠酶0. 02g，木瓜蛋白酶0. 05g，加入蒸餾水 0. 9g，40°C水浴30分鐘；(3)將步驟(2)與步驟(1)得到的溶液混合均勻，調節pH至5.0，在50°C條件下酶解1小時；(4)煎煮酶解液，控制加熱溫度，保持溶液在微沸的狀態，2小時；(5)離心，取上清液過濾，將濾液濃縮，得到桑葉多糖浸膏。采用苯酚硫酸法測定多糖含量，桑葉多糖提取率為71. 63mg/g。實施例2(1)取桑樹經風干的桑葉，粉碎至100目，取該粉末10g，加入蒸餾水200ml，煮沸后
冷卻備用；(2)取復合酶制劑纖維素酶0. 04g，果膠酶0. 04g，木瓜蛋白酶0. lg，加入蒸餾水 0. 9g，40°C水浴30分鐘；(3)將步驟(2)與步驟(1)得到的溶液混合均勻，調節pH至5.0，在50°C條件下酶解30分鐘；(4)煎煮酶解液，控制加熱溫度，保持溶液在微沸的狀態，2小時；(5)離心，取上清液過濾，將濾液濃縮，得到桑葉多糖浸膏。采用苯酚硫酸法測定多糖含量，桑葉多糖提取率為70. 53mg/g。實施例3:(1)取桑樹經風干的桑葉，粉碎至100目，取該粉末20g，加入蒸餾水400ml，煮沸后冷卻備用；(2)取復合酶制劑0. 2g，其中纖維素酶果膠酶木瓜蛋白酶=2 2 5，加入蒸餾水2g，40°C水浴30分鐘；(3)將步驟⑵與步驟(1)得到的溶液混合均勻，調節pH至5. 0，在45°C條件下酶解1小時；(4)煎煮酶解液，控制加熱溫度，保持溶液在微沸的狀態，2小時；(5)離心，取上清液過濾，將濾液濃縮，得到桑葉多糖浸膏。采用苯酚硫酸法測定多糖含量，桑葉多糖提取率為75. 54mg/go實施例4(1)取桑樹經風干的桑葉，粉碎至60目，取該粉末10g，加入蒸餾水300ml，煮沸后冷卻備用；(2)取復合酶制劑纖維素酶0. 09g，果膠酶0. 09g,中性蛋白酶0. 18g，加入蒸餾水 1.8g，60°C水浴10分鐘;(3)將步驟⑵與步驟(1)得到的溶液混合均勻，調節pH至5. 5，在60°C條件下酶解1小時；(4)煎煮酶解液，控制加熱溫度，保持溶液在微沸的狀態，1小時；(5)離心，取上清液過濾，將濾液濃縮，得到桑葉多糖浸膏。
采用苯酚硫酸法測定多糖含量，桑葉多糖提取率為66. 67mg/g。實施例5 連翹多糖(1)取風干的連翹葉，粉碎至100目，取該粉末10g，加入蒸餾水100ml，煮沸后冷卻(2)取復合酶制劑(纖維素酶果膠酶木瓜蛋白酶=1:2: 5)0. 4g，加入蒸餾水4g，40°C水浴20分鐘；(3)將步驟⑵與步驟(1)得到的溶液混合均勻，調節pH至4. 0，在40°C條件下酶解1小時；(4)煎煮酶解液，控制加熱溫度，保持溶液在微沸的狀態，2小時；(5)離心，取上清液過濾，將濾液濃縮，得到連翹多糖浸膏。采用苯酚硫酸法測定多糖含量，連翹多糖提取率為64. 32mg/g。實施例6 銀杏多糖(1)取風干的銀杏葉，粉碎至40目，取該粉末10g，加入蒸餾水200ml，煮沸后冷卻(2)取復合酶制劑(纖維素酶果膠酶堿性蛋白酶=2:3: 5)0. 4g，加入蒸餾水6g，45°C水浴30分鐘；(3)將步驟(2)與步驟(1)得到的溶液混合均勻，調節pH至4. 5，在45°C條件下酶解0.5小時；(4)煎煮酶解液，控制加熱溫度，保持溶液在微沸的狀態，2小時；(5)離心，取上清液過濾，將濾液濃縮，得到連翹多糖浸膏。采用苯酚硫酸法測定多糖含量，銀杏多糖提取率為65. 01mg/g。實施例7 銀耳多糖(1)取干燥的銀耳，粉碎至100目，取該粉末10g，加入蒸餾水200ml，煮沸后冷卻備用；(2)取復合酶制劑(纖維素酶果膠酶木瓜蛋白酶=1:5: 2)0. 16g，加入蒸餾水1. 6g，45°C水浴30分鐘；(3)將步驟⑵與步驟(1)得到的溶液混合均勻，調節pH至4. 5，在45°C條件下酶解0.5小時；(4)煎煮酶解液，控制加熱溫度，保持溶液在微沸的狀態，2小時；(5)離心，取上清液過濾，將濾液濃縮，得到銀耳多糖浸膏。采用苯酚硫酸法測定多糖含量，銀耳多糖提取率為60. 37mg/g。實施例8 苦瓜多糖(1)取干燥的苦瓜，粉碎至80目，取該粉末10g，加入蒸餾水300ml，煮沸后冷卻備用；(2)取復合酶制劑(纖維素酶0.04g，果膠酶0.04g，中性蛋白酶0.06g，堿性蛋白酶0. 04g,加入蒸餾水1. 8g，50°C水浴30分鐘；(3)將步驟(2)與步驟(1)得到的溶液混合均勻，調節pH至6.0，在50°C條件下酶解1. 5小時；(4)煎煮酶解液，控制加熱溫度，保持溶液在微沸的狀態，2小時；
(5)離心，取上清液過濾，將濾液濃縮，得到苦瓜多糖浸膏。采用苯酚硫酸法測定多糖含量，苦瓜多糖提取率為63. 33mg/g。實施例9 黃芪多糖(1)取中藥材黃芪，粉碎至100目，取該粉末10g，加入蒸餾水150ml，煮沸后冷卻備用；(2)取復合酶制劑(纖維素酶果膠酶堿性蛋白酶=5:5: 12)0.22g，加入蒸餾水3. 3g，60°C水浴30分鐘；(3)將步驟⑵與步驟(1)得到的溶液混合均勻，調節pH至5. 0，在60°C條件下酶解1. 5小時；(4)煎煮酶解液，控制加熱溫度，保持溶液在微沸的狀態，2小時；(5)離心，取上清液過濾，將濾液濃縮，得到黃芪多糖浸膏。采用苯酚硫酸法測定多糖含量，黃芪多糖提取率為68. 91mg/g。實施例10 香菇多糖(1)取干燥的香菇，粉碎至100目，取該粉末10g，加入蒸餾水250ml，煮沸后冷卻備用；(2)取復合酶制劑(纖維素酶果膠酶木瓜蛋白酶=1:5: ll)0.34g，加入蒸餾水3. 4g，45°C水浴20分鐘；(3)將步驟⑵與步驟(1)得到的溶液混合均勻，調節pH至5.0，在45°C條件下酶解2小時；(4)煎煮酶解液，控制加熱溫度，保持溶液在微沸的狀態，2小時；(5)離心，取上清液過濾，將濾液濃縮，得到香菇多糖浸膏。采用苯酚硫酸法測定多糖含量，香菇多糖提取率為70. 06mg/g。
權利要求
1.一種復合酶制劑，其特征在于包括以下重量份的組分 纖維素酶1-5份果膠酶 1-5份蛋白酶 2-12份
2.權利要求1所述的一種復合酶制劑，其特征在于所述蛋白酶選用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶中的至少一種。
3.權利要求1所述的復合酶制劑用于提取植物多糖的應用。
4.權利要求1所述的復合酶制劑用于提取植物多糖的方法，其特征在于包括以下步驟(1)取植物材料，粉碎，加入蒸餾水，煮沸后冷卻備用；(2)取復合酶制劑加入適當蒸餾水，置于水浴鍋里40-60°C條件下活化10-30分鐘；(3)將步驟(2)與步驟(1)得到的溶液混合均勻，調節pH至4.0-6.0，在40-601條件下酶解0. 5-2.0小時；(4)煎煮酶解液，控制加熱溫度，保持溶液在微沸的狀態；(5)離心，取上清液過濾，將濾液濃縮，得到植物多糖浸膏。
5.權利要求1所述的復合酶制劑用于提取植物多糖的方法，其特征在于所述植物為桑葉，包括以下步驟(1)取桑樹經風干的桑葉，粉碎，加入蒸餾水，煮沸后冷卻備用；(2)取復合酶制劑加入適當蒸餾水，置于水浴鍋里40-60°C條件下活化10-30分鐘；(3)將步驟⑵與步驟(1)得到的溶液混合均勻，調節pH至4.0-5.5，在40-551條件下酶解0. 5-2.0小時；(4)煎煮酶解液，控制加熱溫度，保持溶液在微沸的狀態；(5)離心，取上清液過濾，將濾液濃縮，得到桑葉多糖浸膏。
6.權利要求4或5所述的復合酶制劑用于提取植物多糖的方法，其特征在于步驟(1) 中所述的植物粉碎至40-100目，植物材料與加入的蒸餾水的質量比為1 10-30。
7.權利要求4或5所述的復合酶制劑用于提取植物多糖的方法，其特征在于步驟(2) 中所述的復合酶制劑與蒸餾水的質量比為1 5-15。
8.權利要求4或5所述的復合酶制劑用于提取植物多糖的方法，其特征在于步驟(2) 中所述的復合酶制劑添加量為步驟(1)植物材料添加量的1_4%。
9.權利要求4或5所述的復合酶制劑用于提取植物多糖的方法，其特征在于步驟(4) 中所述的浸提時間為1-2小時。
全文摘要
本發明提供了一種復合酶制劑及其用于提取植物多糖的應用和方法，屬于酶制劑的應用領域。本發明的技術方案是提供一種復合酶制劑，包括以下重量份的組分纖維素酶1-5份，果膠酶1-5份，蛋白酶2-12份，本發明還給出了將此復合酶制劑用于提取植物多糖，尤其是桑葉多糖的應用，并給出了具體的操作步驟，最終實現了植物多糖提取率60mg/g以上。本發明的有益效果是反應條件溫和，能保持天然產物的構象，不破壞其立體結構和生物活性，有利于保持有效成分原有的藥效；能夠去除體系內雜質，提高提取液的澄清度，提高了中藥有效成分的提取率；對反應條件進行了優化組合，實現了提取得率的最大化。
文檔編號C12N9/42GK102304501SQ201110255909
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月1日 優先權日2011年9月1日
發明者劉宇, 劉敏堯, 劉曉津, 劉海慶, 劉靚, 董曉芳 申請人:天津濱海諾奧酶工程技術有限公司