專利名稱：防治黃瓜白粉病和霜霉病的菌株chs55的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治溫室大棚黃瓜白粉病和霜霉病的生防菌株CHS55，屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，專用于黃瓜葉部的霜霉病和白粉病無公害防治。
背景技術(shù)：
黃瓜霜霉病和白粉病是溫室大棚黃瓜葉部最常發(fā)生的兩種真菌病害它們的病原菌都為專性寄生菌，且對寄主植物的專化選擇性很強(qiáng)，其孢子囊可隨風(fēng)雨、黃瓜甲蟲、農(nóng)器具等進(jìn)行傳播，都是一種主要的氣傳病害。隨著我國溫室大棚面積急劇增加，反季節(jié)黃瓜大棚栽培種植大批量出現(xiàn)，使得其病菌一年四季可以侵染黃瓜；發(fā)病嚴(yán)重時，全葉呈黃褐色干枯，最后導(dǎo)致植株干枯早死，縮短收瓜期，嚴(yán)重影響黃瓜產(chǎn)量，損失可達(dá)20%到60%，此病害是溫室大棚影響黃瓜產(chǎn)量的主要制約因素之一。此病害農(nóng)民主要是依照經(jīng)驗(yàn)來噴施化學(xué)藥劑，一周噴施一次化學(xué)藥劑，但抗性產(chǎn)生的速度非常快，目前不少商家把目光轉(zhuǎn)移到綠色、生態(tài)產(chǎn)品生物農(nóng)藥上，但大多處于實(shí)驗(yàn)室研究開發(fā)階段，登記注冊的微乎其微。且因兩種病原菌是活體寄生菌，大多完成簡單的室內(nèi)測定試驗(yàn)，在我國主要黃瓜栽培區(qū)進(jìn)行日光溫室或者露天試驗(yàn)藥效廣譜性測試的生防研究微乎其微。綜上所述，開發(fā)新的、更為高效和安全的微生物殺菌劑控制黃瓜霜霉和白粉病的發(fā)生是提高社會生產(chǎn)總量的需要，同時更是農(nóng)業(yè)安全可持續(xù)發(fā)展的需要，符號社會發(fā)展需求。

發(fā)明內(nèi)容
1技術(shù)問題針對現(xiàn)有技術(shù)中沒有對黃瓜霜霉病有較高防效的生防制劑的現(xiàn)狀，提供一種防治黃瓜霜霉病的單一生防菌菌株及其菌劑，該菌劑對其防效可達(dá)到60%以上。2技術(shù)方案防治溫室大棚黃瓜霜霉病的生防菌株CHS55，為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，于2011年7月1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO. 4738，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所。生防菌株CHS55用于制備生防菌劑的方法為所述生防菌株CHS55接種到LB培養(yǎng)液中32°C培養(yǎng)250rpm振蕩培養(yǎng)，12 16小時后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養(yǎng)液來調(diào)零；2)當(dāng)培養(yǎng)至OD值在0.5 0.8之間時，將種子菌液以1 500體積比加入裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的200L發(fā)酵罐中，32°C 250rpm振蕩培養(yǎng)20 M小時，發(fā)酵液pH值維持在7. 0，溶氧量20%，通氣量5-7m7小時，罐壓0. 05-0. IKPa,然后6000rpm離心lOmin，每1000ml培養(yǎng)液獲得13 16g濕菌，每克濕菌含4X101(I IO15個菌體，取濕菌與菌體保藏液按Ig 40ml
3配成菌劑，成品中活菌總濃度為IXio9 lX1012CFU/ml。其中1)種子培養(yǎng)液LB配方氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為 7.2 ；2)發(fā)酵培養(yǎng)液配方麥芽糖1. 2g/L，玉米粉3. 2g/L，黃豆粉3. 2g/L，胰蛋白胨 2. Og/L，二水氯化鈣0. 5g/L，一水硫酸錳0. 5g/L，磷酸氫二鉀1. Og/L,調(diào)節(jié)pH值為7. 0 ；3)菌體保藏液為0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0. 001mol/L的TweeMO 非離子型表面活性劑。菌劑稀釋100-1000倍后在黃瓜移栽后4葉期開始進(jìn)行噴霧處理或者噴灌處理，在天氣因子適合黃瓜霜霉病流行前期，10d/7d 一個間隔周期使用一次，對黃瓜霜霉病的防效可分別達(dá)到為62. 31%和65. 79%。在溫室試驗(yàn)中后期發(fā)現(xiàn)，其對白粉病控制有較強(qiáng)的作用，防效可達(dá)到70%以上，且其粗蛋白提取液對黃瓜霜霉病防效可達(dá)到70. 33%。3有益效果本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在本發(fā)明是專門針對黃瓜葉部兩種病害霜霉病和白粉病病開發(fā)的生防制劑。由于是生物制劑，完全沒有因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于溫室大棚蔬菜的無公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少其他化學(xué)農(nóng)藥的用量， 這不僅可為農(nóng)民節(jié)省開支，而且減少化學(xué)藥劑的殘留，有利于蔬菜的出口。溫室實(shí)驗(yàn)表明該菌制劑能顯著降低黃瓜霜霉病的發(fā)生。該菌劑可以稀釋100倍后在黃瓜種子出苗后噴霧，或者在移栽時灌根/噴霧處理。在溫室條件下對于黃瓜霜霉病可以達(dá)60%，且其粗蛋白提取液對黃瓜霜霉病防效可達(dá)到70. 33% ；在溫室試驗(yàn)中后期發(fā)現(xiàn)，其對白粉病控制有較強(qiáng)的作用，防效可達(dá)到70%以上。
四
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1CHS55生防菌劑的制備本發(fā)明涉及一種防治溫室大棚黃瓜霜霉病的生防菌株CHS55，該菌株為2009年在揚(yáng)州某黃瓜大棚的黃瓜健康土壤分離得到。1)將所述生防菌株CHS55接種到LB培養(yǎng)液中32°C培養(yǎng)250rpm振蕩培養(yǎng)，12 16小時后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養(yǎng)液來調(diào)零；2)當(dāng)培養(yǎng)至OD值在0.5 0.8之間時，將種子菌液以1 500體積比加入裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的200L發(fā)酵罐中，32°C 250rpm振蕩培養(yǎng)20 M小時，發(fā)酵液pH值維持在7. 0，溶氧量20%，通氣量5-7m7小時，罐壓0. 05-0. IKPa,然后6000rpm離心lOmin，每1000ml培養(yǎng)液獲得13 16g濕菌，每克濕菌含4X101(I IO15個菌體，取濕菌與菌體保藏液按Ig 40ml 配成菌劑，成品中活菌總濃度為IXlO9 lX1012CFU/ml。其中1)種子培養(yǎng)液LB配方氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為 7.2 ；2)發(fā)酵培養(yǎng)液配方麥芽糖1. 2g/L，玉米粉3. 2g/L，黃豆粉3. 2g/L，胰蛋白胨 2. 0g/L, 二水氯化鈣0. 5g/L，一水硫酸錳0. 5g/L，磷酸氫二鉀1. 0g/L,調(diào)節(jié)pH值為7. 0 ；
3)菌體保藏液為0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0. 001mol/L的TweeMO 非離子型表面活性劑。實(shí)施例2黃瓜霜霉病溫室防效試驗(yàn)黃瓜移栽后四葉期，用生防菌CHS55 (107CFU/mL)噴霧處理黃瓜葉片，5d后接種黃瓜霜霉病菌(Psedoperonspora cubensis)孢子囊懸浮液，接種濃度為IO5個孢子囊/ml，對照處理組為清水對照。每個處理組M株黃瓜苗，四次重復(fù)。第IOd對照組發(fā)病，調(diào)查病級數(shù)，計算病害嚴(yán)重度和防效。(參考文獻(xiàn)NY/T 1156. 7-2006農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺菌劑第7部分防治黃瓜霜霉病試驗(yàn)盆栽法)霜霉病病原菌 Pseudoperonospora cubensis (Berkely et Curtis) Rosto wzew, 公知公用，見參照文獻(xiàn)“湯鈿.葡萄霜霉病離體接種方法的研究[J]微生物學(xué)通報，1994， (06).，，。病菌孢子囊懸浮液制備方法(參考文獻(xiàn)杜興蘭.葡萄霜霉病和白粉病生物防治的研究[D]河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008)傍晚采集發(fā)病嚴(yán)重的新鮮黃瓜霜霉病病葉(近幾天未施過農(nóng)藥)，用冰壺帶回實(shí)驗(yàn)室，沖去葉面上的雜物和原有的抱子囊，用浸水的脫脂棉包住葉柄，置于18°C培養(yǎng)箱中黑暗保濕培養(yǎng)，24h后待長出新鮮孢子囊。用無菌水刷取新長出的孢子囊，雙層紗布過濾，12000rpm 15min離心，棄去上清液，用滅菌水稀釋至IO5個孢子囊/ ml，在18°C培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2-3h，待有大量游動孢子囊出現(xiàn)時使用。數(shù)據(jù)顯示，CHS55對黃瓜霜霉病防效為57. 27%。表1 溫室中生防菌劑CHS55對黃瓜霜霉病生防效果(噴霧處理IOd)
處理病害嚴(yán)重度％生防效果％CHS558.61±2.30b57.27Control20.15±4.24a實(shí)施例3對黃瓜白粉病的溫室試驗(yàn)防效黃瓜移栽后四葉期，用生防菌CHS55 (107CFU/mL)噴霧處理黃瓜葉片，控制室溫和室內(nèi)相對濕度85%，IOd后可見白粉病發(fā)生，對照處理組為清水對照。每個處理組M
株黃瓜苗，四次重復(fù)。第IOd對照組發(fā)病，調(diào)查病級數(shù)，計算病害嚴(yán)重度和防效。(參考文獻(xiàn)NY/T 1156. 4-2006農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺菌劑第4部分防治小麥白粉病試驗(yàn)盆栽法)黃瓜白粉病病原菌為子囊菌亞門的單絲殼白粉菌屬 [Sphaerothecafuliginea (Schl.) Poll = S. cucurbitae (Jacz.) Zhao]，其無性階段歸半知菌亞門的粉孢屬[Oidium sp.]，見參照文獻(xiàn)“張雪輝.室內(nèi)黃瓜白粉病防治方法研究[J]. 河北師范大學(xué)學(xué)報，2005，(02). ”。分生孢子懸浮液的制備(杜興蘭.葡萄霜霉病和白粉病生物防治的研究[D]河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008))采集黃瓜植株葉片上新鮮的分生孢子.用無菌水沖洗，制成分生孢子懸浮液(8*104個/mL)。從分生孢子懸浮液制備至完成接種應(yīng)限定在池內(nèi)。分級標(biāo)準(zhǔn)參考中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)(農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則(一)殺菌劑防治黃瓜自粉病，GBFF17980. 30-2000)
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0級無病斑；1級病斑面積占整片葉面積的5%以下；3級病斑面積占整片葉面積的6% -10% ；5級病斑面積占整片葉面積的11^-20% 7級病面積占整片葉面積的 21% 40% :9級病斑面秋占整片葉面積的40%以上表2 溫室中生防菌劑CHS55對黃瓜白粉病生防效果(噴霧處理IOd)
權(quán)利要求
1.一種防治溫室大棚黃瓜霜霉病的生防菌株CHS55，為地衣芽孢桿菌iMcillus licheniformis),予2價Y年 只1日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO. 4738，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所。
2.用權(quán)利要求1所述防治溫室大棚黃瓜霜霉病的生防菌株CHS55制備的生防菌劑。
3.權(quán)利要求1所述生防菌株CHS55用于制備生防菌劑的方法1)將權(quán)利要求1所述生防菌株CHS55接種到LB培養(yǎng)液中32°C培養(yǎng)250rpm振蕩培養(yǎng)，12 16小時后在超凈工作臺中分別取樣測600 nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養(yǎng)液來調(diào)零；2)當(dāng)培養(yǎng)至OD值在0.5 0. 8之間時，將種子菌液以1 :500體積比加入裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的200L發(fā)酵罐中，32°C 250 rpm振蕩培養(yǎng)20 M小時，發(fā)酵液pH值維持在7. 0，溶氧量 20%，通氣量 5-7 m3/小時，罐壓 0.05-0.1 KPa，然后 6000 rpm 離心 10 min，每 1000 ml 培養(yǎng)液獲得13 16 g濕菌，每克濕菌含4 X 101° IO15個菌體，取濕菌與菌體保藏液按1 g :40ml配成菌劑，成品中活菌總濃度為IXlO9 IXlO12 CFU/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中1)種子培養(yǎng)液LB配方氯化鈉10g/L,胰蛋白胨10 g/L,酵母浸粉5 g/L，調(diào)節(jié)pH 值為7. 2 ；2)發(fā)酵培養(yǎng)液配方麥芽糖1.2g/L,玉米粉3. 2 g/L,黃豆粉3. 2 g/L,胰蛋白胨 2.0 g/L, 二水氯化鈣0.5 g/L，一水硫酸錳0.5 g/L,磷酸氫二鉀1. 0 g/L，調(diào)節(jié)pH值為 7. 0 ；3)菌體保藏液為0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0.001 mol/L的Tween20非離子型表面活性劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治溫室大棚黃瓜白粉病和霜霉病的菌株CHS55，屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域。CHS55菌株在LB培養(yǎng)液32℃250rpm振蕩培養(yǎng)18-20h，然后4000rpm離心15min，取濕菌與本實(shí)驗(yàn)室的菌體保藏液按1∶40(g/ml)配成菌劑，成品中活菌總濃度為1×109～1×1012CFU/mL。稀釋100-1000倍后在黃瓜移栽后4葉期開始進(jìn)行噴霧處理或者噴灌處理，在天氣因子適合黃瓜霜霉病流行前期，10d/7d一個間隔周期使用一次，對黃瓜霜霉病的防效可分別達(dá)到為62.31%和65.79%。在溫室試驗(yàn)中后期發(fā)現(xiàn)，其對白粉病控制有較強(qiáng)的作用，防效可達(dá)到70%以上，且其粗蛋白提取液對黃瓜霜霉病防效可達(dá)到70.33%。
文檔編號C12N1/20GK102399712SQ20111026213
公開日2012年4月4日 申請日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者王勇明, 許泉, 鄭麗, 郭堅華 申請人:南京農(nóng)大生物源農(nóng)藥創(chuàng)制有限公司