專利名稱：用于指導氟脲嘧啶類藥物個體化治療的基因組合的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因技術領域，涉及一組用于指導氟脲嘧啶類藥物個體化治療的基因組合。
背景技術：
氟脲嘧啶類藥物(5-FU)是目前治療腸癌的主要化療藥物，亦用于乳腺癌、消化道腫瘤(包括原發性和轉移性肝癌和胰腺癌)、卵巢癌和原發性支氣管肺癌的輔助化療和姑息治療。其作用機理為在體內先轉變為5-氟-2-脫氧尿嘧啶核苷酸，后者抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻斷脫氧尿嘧啶核苷酸轉變為脫氧胸腺嘧啶核苷酸，從而抑制DNA的生物合成。此外，還能摻入RNA，通過阻止尿嘧啶和乳清酸摻入RNA而達到抑制RNA合成的作用。 氟脲嘧啶類藥物為細胞周期特異性藥，主要抑制S期瘤細胞。此類藥物在殺死腫瘤細胞的同時，也不可避免地殺傷了正常組織細胞，引起較為嚴重的毒副作用。主要表現為惡心、食欲減退或嘔吐；口腔粘膜炎或潰瘍；腹部不適或腹瀉；周圍血白細胞減少，長期應用可導致神經系統毒性。DPYD (二氫吡啶脫氫酶)DPD 酶(Dihydropyrimidinedehydrogenase)廣泛分布于各種組織，是氟脲嘧啶類藥物在肝臟和其他細胞中代謝失活的限速酶，約80% -90%的 5-FU在肝臟中被分解代謝為無活性代謝物(二氫氟尿嘧啶，FHU)。DPD酶是由DPYD基因所編碼，DPYD基因的突變會引起DPD酶活性的下降并減少氟脲嘧啶類藥物合成代謝生成核苷類似物的分解代謝排出體外的量。DPYD至少有20種與酶活性下降有關的突變，其中約50% 的已知無功能等位基因與IVS14+1G/A點突變有關，稱為DPYDMA ；在中國人群中，DPYD*5A 和DPYD*9A的變異較高，DPYD*5A I543V和A1627G位點的突變率較多，其中A1627G位點的突變率為30%左右；DPYD*9A的C29R和T85C的突變率較多。這些位點的突變會使人體內 DPD酶活性下降或缺失，無法代謝氟脲嘧啶類藥物，造成毒副作用增加。因此，DPYD突變型腫瘤患者在接受化療時，應避免或減量使用氟脲嘧啶類藥物，并嚴密監視藥物的毒副作用。MTHFR(亞甲基四氫葉酸還原酶)MTHFR(Methylenetetrahydrofolate reductase)是葉酸代謝的限速酶，它會不可逆的催化5，10-亞甲基四氫葉酸(5，10-MTHF) 轉變為5，10-甲基四氫葉酸，其中5，IO-MTHF作為胸苷酸合成的重要原料，與DNA合成和修復有密切關系。5-FU進入人體后，在胸苷激酶的催化下轉化為5-氟-2-脫氧尿甘酸，后者可通過兩種作用機制發揮抗癌作用。其一是直接摻入RNA或DNA ；其二是以TS為作用靶點，5-氟-2-脫氧尿苷酸與5，IO-MTHF和TS形成一種穩定的共價絡合物，是胸苷酸合成反應受阻，從而干擾DNA的合成和修復。研究證實MTHFR的多態性位點C677T和AU98C會影響MTHFR酶活性。即MTHFR基因編碼的酶活性隨677位點C/C、C/T、T/T基因型的改變呈遞減趨勢，隨著1298位點A/A、A/C、C/C呈遞增趨勢。MTHFR酶活性的降低會直接影響5， IO-MTHF向5-甲基四氫葉酸的轉化，導致體內5，10-MTHF濃度升高，高濃度的5，10-MTHF會進一步增加5-FU的生物利用度，從而提高5-FU的抗癌效果。TS(胸苷酸合成酶)在正常細胞代謝情況下，TS(thymidylate synthetase)催化脫氧尿苷酸(dUMP)轉變成脫氧胸苷酸(dTMP)，當5-FU進入體內即被活化成氟脲嘧啶脫氧核苷酸(FdUMP)，FdUMP代替dUMP與TS結合，使TS失活，不能合成dTMP，從而影響DNA合成，該途徑也是5-FU發揮抗癌作用的主要途徑。TS的基因多態性使TS蛋白的功能和表達存在差異，造成不同患者用5-FU治療的療效差別很大。該基因5’非翻譯區中增強子區存在1個^bp的核苷酸片段重復多態，其重復次數包括2次OR)、3次(3R)或更多次數，根據這種多態性可將TS基因分為2R/2R(2R純合子)、3R/3R(3R純合子)和2R/3IU2R/3R雜合子)三類，3R/3R基因型患者對5-FU的化療有效率低于2R/2R、2R/3R基因型。其機制認為TS基因5’ -UTR多態性影響了正常組織和腫瘤組織的TS mRNA表達，3R/3R基因型患者的TS mRNA表達，3R/3R基因型患者的TS mRNA表達明顯高于2R/2R、2R/3R組，導致前者有較高的TS蛋白表達，使FdUMP不能有效地抑制TS，從而影響腫瘤細胞DNA的合成，導致5-FU 治療療效差、TS的表達水平與5-FU的敏感性及患者的預后呈負關系。GSTPl催化谷胱甘肽與多種毒性復合物(包括氟脲嘧啶類藥物)結合，形成低毒高水溶性物質排出細胞外。許多用于抗腫瘤的成神經細胞瘤高風險化學療法的藥物是GSTPl 的潛在底物。變異的等位基因導致GSTPl活性的降低，GSTPl外顯子5的第313位堿基存在AL/G單核苷酸多態，導致發生Ile-Val改變，能夠顯著降低GSTPl的活性，從而化療藥的清除率降低和藥物對腫瘤作用時間的延長。藥物代謝和效應的個體化差異臨床上，同樣藥物的劑量對病人甲有效，對病人乙可能不起作用，對病人丙則可能有副作用。在藥物療效與副作用方面，病人的反應差異很大。因此，在對腫瘤病人進行化療時，如果先對其相關基因位點進行檢測，再根據其基因突變情況進行治療，就可以對病人實施個體優化治療。因此，通過檢測病人腫瘤組織中的 DPY腫2A、DPYD*5A、DPYD*9A、MTHFR、TS、GSTPl基因位點的突變情況，對擬采用氟脲嘧啶類藥物治療的病人進行藥物敏感指導，可以使療效達到最大，副作用降到最低。現有臨床用藥方法的缺陷在很多疾病的治療過程中，常發生用藥不當而導致副作用或因劑量不足無法達到治療目的。因此針對這些病患的基因型進行個體化用藥具有特別重要的意義。以前，醫生如果需要調整病人的用藥，需要長時間觀察，病人也需要做大量的檢測。這種調整用藥的過程程序復雜，費時，延誤治病時機。本發明的有益之處是(1)本發明的篩選方法是一種對人體無害的檢測方法；(2) 本發明通過檢測病人腫瘤組織中的DPYDMA、DPYD*5A、DPYD*9A、MTHFR、TS、GSTP1基因位點的突變情況，對擬采用氟脲嘧啶類藥物治療的病人進行藥物敏感指導，可以使療效達到最大，副作用降到最低。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對目前腫瘤的治療過程中，氟脲嘧啶類藥物的療效及毒副作用在不同病人中的明顯差異，提供一種方便、快捷的輔助臨床醫生制定個體化用藥方案的基因組合及其應用方法。本發明的目的是提供一組用于指導氟脲嘧啶類藥物個體化治療的基因組合，包括DPYD*2A，DPYD*5A，DPYD*9A，MTHFR, TS, GSTPl 基因。本發明的另一個目的是提供該基因組合在指導氟脲嘧啶類藥物個體化治療中的應用。
基于上述目的，本發明采用以下技術方案針對上述基因的特異性位點設計引物，各基因引物序列如表1所示。表 權利要求
1.一組用于指導氟脲嘧啶類藥物個體化治療的基因組合，其特征在于該基因組合包含DPYD*2A，DPYD*5A，DPYD*9A，MTHFR, TS, GSTPl 基因。
2.根據權利要求1所述的基因組合，其特征在于針對DPYD*2A位點設計的正向引物序列為CATTGTGACAAATGTTTCCC(SEQ ID No. 1)，反向引物序列為ATCAGCAAAGCAACTGGCA(SEQ ID No. 2)；針對DPYD*5A位點設計的正向引物序列為TCTGCCAAGCCTGAACTAC (SEQ ID No. 3)，反向引物序列為:AGAGAAAGTTTTGGTGAGGG (SEQ ID No. 4)；針對 DPYD*9A 位點設計的正向引物序列為CTGTCTTTAGAGTATCCTGGC (SEQ ID No. 5)，反向引物序列為CACGGCTGTACTTTAATACC (SEQ ID NO. 6)；針對MTHFR位點設計的正向引物序列為 AGGACAGTGTGGGAGTTTGG(SEQ ID No. 7)，反向引物序列為GAAAAGCTGCGTGATGATGA(SEQ ID NO. 8)；針對TS位點設計的正向引物序列為GTGGCTCCTGCGTTTCCCCC (SEQ ID No. 9)， 反向引物序列為GGCTCCGAGCCGGCCACAGGCATGGCGCGG (SEQ ID NO. 10)；針對 GSTPl 位點設計的正向引物序列為:CTGCTGTGTGGCAGTCTCTC (SEQ ID No. 11)，反向引物序列為: CCGTTACTTGGCTGGTTGAT(SEQ ID NO. 12)。
3.如權利要求2所述的引物序列在檢測其相應的基因突變中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于檢測方法如下4. 1提取病人腫瘤組織基因組DNA ；4.2以待測腫瘤組織基因組DNA為模板，用權利要求2所述的擴增引物進行PCR擴增；4. 3PCR擴增產物凝膠電泳分析；4.4PCR擴增產物測序。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述步驟(4.2)中PCR反應體系每20 μ 1組成如下待測病人腫瘤組織基因組DNA 50 lOOng，Taq酶0. 125 μ 1，上下游引物(10 μ Μ) 各1μ 1，dNTP (2. 5πιΜ)2μ 1，10XPCR緩沖液(含Mg2+) 2 μ 1，余下為無菌蒸餾水。
6.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述步驟(4.2)中用于檢測DPYD*2A的PCR擴增反應條件是95°C預變性2min，隨后95°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸30sec， 進行40個循環，最后72°C延伸7min，4°C保存。
7.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述步驟(4.2)中用于檢測DPYD*5A的PCR擴增反應條件是95°C預變性2min，隨后95°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸30sec， 進行40個循環，最后72°C延伸7min，4°C保存。
8.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述步驟(4.2)中用于檢測DPYD*9A的PCR擴增反應條件是95°C預變性2min，隨后95°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸30sec， 進行40個循環，最后72°C延伸7min，4°C保存。
9.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述步驟(4.2)中用于檢測MTHFR的PCR擴增反應條件是95°C預變性anin，隨后95°C變性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec, 進行40個循環，最后72°C延伸7min，4°C保存。
10.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述步驟(4.2)中用于檢測TS的PCR擴增反應條件是95°C預變性2min，隨后95°C變性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸30sec，進行40個循環，最后72°C延伸7min，4°C保存。
11.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述步驟(4.2)中用于檢測GSTPl的PCR擴增反應條件是95°C預變性2min，隨后95°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin，進行40個循環，最后72°C延伸7min，4°C保存。
12.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述步驟(4)中測序PCR擴增的反應條件為95°C預變性％iin，隨后95°C變性30sec，50°C退火15sec，進行35個循環，最后60°C延伸％iin，4°C保存。
全文摘要
本發明屬于基因技術領域，提供一組用于指導氟脲嘧啶類藥物個體化治療的基因組合，包括DPYD*2A，DPYD*5A，DPYD*9A，MTHFR，TS，GSTP1。本發明通過檢測病人腫瘤組織中的DPYD*2A，DPYD*5A，DPYD*9A，MTHFR，TS，GSTP1基因位點的突變情況，對擬采用氟脲嘧啶類藥物治療的病人進行藥物敏感指導，以使療效達到最大，副作用降到最低。
文檔編號C12Q1/68GK102329863SQ20111026158
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月6日 優先權日2011年9月6日
發明者樓敬偉 申請人:上海寶藤生物醫藥科技有限公司