專利名稱：人白血病融合基因bcr-abl的rt-pcr引物及其使用方法
人白血病融合基因BCR-ABL的RT-PCR引物及其使用方法技術領域
本發明屬生命科學和生物技術領域，特別是一種臨床檢驗技術的方法學改進，采用特異性反轉錄(reverse transcription, RT)引物，反轉錄人白血病融合基因BCR-ABL編碼的P210蛋白的mRNA，包括ABL激酶區序列在內的長度1. 5kb的片段。可以顯著提高了 RT-PCR的擴增成功率。
背景技術：
慢性粒細胞白血病CML是一種發生于造血干細胞的血液系統惡性克隆增生性疾病。95%的CML患者異常白細胞中含有一段染色體易位形成的被命名為“費城”的異常染色體。其形成機理為9號染色體的一段拼接到了 22號染色體上，這種拼接形成了一個新的異常的具有致癌效果的基因BCR-ABL。BCR-ABL基因的編碼蛋白具有異常的酪氨酸酶活性， 使調控細胞復制的信號傳導途徑一直處於活躍狀態，從而源源不斷地產生更多的異常白血細胞，骨髓正常控制的白血細胞的生成被破壞，形成CML病癥。
各國CML的發病率相對一致，約為1-2人/10萬。在兒童中，CML的發病率極低， 所占比例不超過兒童白血病的5%，成人中，CML占所有成人白血病的15%。CML病人在診斷后兩年內的死亡率為20%到30%，而后每年25%的病人死亡，他們在確診后的平均存活年數只有三到五年。CML大致可分為三個階段慢性期，加速期和暴發期。從初發階段到暴發期，骨髓內異常細胞數目一直上升，而且擴散至骨髓外。慢性期可潛伏4到5年，在這一階段，患者癥狀很輕，往往只在例常的血檢時才被檢測發現。加速期在6到18個月之間，這時白血球的擴增往往已難用常規療法控制。而在最后的暴發期，患者只能存活1到6個月。
格列衛是一種新型的治療CML的小分子化學藥物，活性成份為甲磺酸伊馬替尼， 廣泛用于治療慢性髓性白血病(CML)急變期、加速期或α-干擾素治療失敗后的慢性期患者。它直接定靶于導致CML的異常酪氨酸激酶BCR-ABL，通過抑制這個酶的活性從而抑制更多的癌細胞的產生，同時它能誘導已生成的癌細胞的凋亡。這種定靶的專一性使它的治療效率提高和副作用大大減小，95%的病人在服藥一到三個月之后就可見到藥效，癌細胞減少，血細胞數目可回到正常值。
研究發現對處于CML暴發期的病人，格列衛先有作用，而后疾病可能復發。據估計，大約有5%至10%的處在慢性階段的病人會對格列衛產生抗性，并且如果在較晚階段才開始治療CML，這個百分比則更高。其原因可能是因為BCR-ABL融合基因ABL激酶區序列發生突變，導致BCR-ABL蛋白發生變異，構象變化，格列衛不再能與變異的蛋白結合來抑制其活性。約80%的耐藥是由于BCR-ABL融合蛋白的ABL激酶區突變引起的，已報道的突變超過50種。
目前發現的ABL激酶區突變主要集中于ATP結合區(P環，第244 255氨基酸)、 Τ315、Μ351及活化區(Α環)四個區，不同突變位點引起的耐藥程度不同。部分突變患者可以對新型的激酶抑制劑達沙替尼(Dasatinib，BMS-354825)或尼羅替尼(Nilotinib，AMN 107)有治療反應，可作為格列衛的替代用藥。發生于P環的突變耐藥性強，如G250E、Y253H3及E25^(等突變耐藥程度都很高。目前報道的突變中，尤以T315I耐藥程度最高，是惟一報道對所有激酶抑制劑都耐藥的突變。這些高度耐藥的突變預后差，需盡早改用其他治療方案。而M351T、E355G、M244V等耐藥程度不高，可以通過提高劑量來抵抗耐藥。因此，在用格列衛化療前對患者的融合基因ABL激酶區進行測序，可以有效地為綜合定量監測和格列衛耐藥突變等情況做一個評估，根據每位患者的病情和疾病的發展，進行精確的個體化治療。Sanger測序法是目前公認的，運用于大多數臨床分子診斷項目的金標準，其特異性達到100%，是分子準段賴以開展的經典技術平臺。因此用采用Sanger測序法對BCR-ABL 融合基因編碼產物的激酶區序列進行突變檢測，具有穩定可靠，特異性好的優點，可有效避免假陽性的發生。為了給Sanger測序提供可靠的模板，首先必須針對該項目特點，建立一個穩定可靠的RT-PCR體系。該項目的RT-PCR部分在技術環節存在以下兩個難點1.該項目需要提取血液白細胞中的mRNA，由于臨床標本物流運輸中存在著眾多不可控因素，因此臨床檢驗中往往得不到質量優良的全血樣本，因此獲得的mRNA質量也會存在較大的樣本間差異。 2.由于融合基因拼接點離需要檢測的ABL激酶區較遠，因此RT-PCR需要擴增的片段較大， 約有1. 51Λ，故對反轉錄的過程要求較高。目前眾多的反轉錄試劑盒都推薦采用隨機引物對mRNA進行反轉錄。隨機引物又稱隨機擴增多態性DNA，一般是長度為六到九個堿基的核苷酸序列，每個堿基隨機選取四種堿基中的一種。用隨機引物對mRNA進行擴增可得到大量的非特異性cDNA片段，為之后的目的基因擴增提供模板。雖然隨機引物所得cDNA產物包含大量的片段信息，可供克隆各種基因組序列，但是隨機引物的特異性不佳，對于mRNA拷貝數低的一些基因，其反轉錄的效果不理想，很可能導致之后的PCR擴增失敗，或產生非特異性的產物。而針對目的基因mRNA 序列設計特異性的反轉錄引物，則可獲得更加純凈單一的反轉錄產物，因此比較適合用于一些的拷貝數目的mRNA的反轉錄。

發明內容
為了克服現有技術的上述缺陷，本發明針對人白血病融合基因BCR-ABL設計出 RT-PCR引物，根據該引物可以獲得純凈單一的反轉錄產物，顯著提高人白血病融合基因 RT-PCR的擴增成功率。一種人白血病融合基因BCR-ABL的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列為BCR_ex F :5，-TTCCGCTGACCATCAATAAG-3，ABL_ex R :5，-CGCATGAGTTCATAGACCTT-3，ABL_in F :5，-CGAGTTGGTTCATCATCATTCA-3，ABL_in R 5，-CCTTCTCTAGCAGCTCATACA-3，。本發明還提供了一種使用上述引物對人白血病融合基因BCR-ABL進行RT-PCR的方法，其特征在于包括以下步驟1)提取人血中白細胞mRNA ；2)用ABL_ex R進行RT反應，得反轉錄反應產物；3)以步驟2的反轉錄反應產物為PCR反應模板，以BCR_ex F和ABL_ex R為上下游引物進行第一輪PCR擴增，得擴增產物；4)取步驟3的擴增產物，以ABL_in F和ABL_in R為引物進行第二輪PCR擴增，得到擴增產物，用于測序檢測。進一步地，步驟3的PCR反應優選按以下條件進行擴增94°C 2min ；98°C 10s、 55°C 30s,68°C 110s、35 個循環；68°C 5min。步驟4的PCR反應優選按以下條件進行擴增94°C 2min ；98°C 10s、55°C 30s、 68°C 50s、35 個循環；68°C 5min。現有技術中，用隨機引物進行RT-PCR，擴增包含ABL激酶區序列的BCR-ABL cDNA 片段序列(全長1.51Λ)效果較差，容易導致PCR失敗或者產生非特異性擴增。為提高 RT-PCR的靈敏度，有效得到所需長度的片段，本發明設計了針對BCR-ABL基因序列(參考序列NM_004327. 3和NM_005157. 4)的特異性引物序列來替代原來的隨機引物反轉錄法。本發明根據BCR-ABL的常見斷裂點，在融合基因ABL片段第8外顯子序列上設計一反向引物作為特異性的反轉錄引物。反轉錄后再設計兩對引物作巢式PCR(nested-PCR)， 其中外側引物擴增片段長1. 51Λ，擴增片段范圍從BCR第13外顯子3’端至ABL的第8外顯子3’端，包含拼接點。內側引物以外側引物1.51Λ擴增產物為模板，擴增出一段包含14個常見ABL激酶區點突變位點的長約0. 7kb的片段，并用于測序檢測。RT-PCR擴增引物設計構思圖詳見附圖1。本發明對人白血病融合基因BCR-ABL進行RT-PCR的方法具體如下取一份人類白細胞RNA提取物(1-3 4力，采用4814寺異性反轉錄引物481^_^ R進行RT反應，反應后的產物取1 μ 1，以BCR_ex F和ABL_ex R為上下游引物進行第一輪PCR擴增，其產物再取1 μ 1 并作100倍稀釋后用ABL_in F和ABL_in R為引物作第二輪PCR，產物用于測序。本發明針對人白血病融合基因BCR-ABL設計出RT-PCR引物，根據該引物使用本發明的RT-PCR方法可以獲得純凈單一的反轉錄產物，可顯著提高人白血病融合基因RT-PCR 的擴增成功率。


圖1是本發明RT-PCR擴增引物設計構思圖。其中，實線箭頭表示RT引物及RT進行的方向，虛線箭頭和半箭頭分別表示外側和內側上下游引物。圖2是本發明采用特異性反轉錄引物與現有技術采用隨機引物相比較，外側引物 PCR結果圖。圖3是外側引物PCR產物用內側引物作第二輪PCR的結果圖。
具體實施例方式實施例1 本發明的人白血病融合基因BCR-ABL的RT-PCR引物如下表所示
權利要求
1. 一種人白血病融合基因BCR-ABL的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列為BCR_exF:5，-TTCCGCTGACCATCAATAAG-3'ABL_exR:5，-CGCATGAGTTCATAGACCTT-3’ABL_inF:5，-CGAGTTGGTTCATCATCATTCA-3’ABLinR:5，-CCTTCTCTAGCAGCTCATACA-3’。
2.一種使用權利要求1所述引物對人白血病融合基因BCR-ABL進行RT-PCR的方法，其特征在于包括以下步驟1)提取人血中白細胞mRNA；2)用ABL_exR進行RT反應，得反轉錄反應產物；3)以步驟2的反轉錄反應產物為PCR反應模板，以BCR_exF和ABL_ex R為上下游引物進行第一輪PCR擴增，得擴增產物；4)取步驟3的擴增產物，以ABL_inF和ABL_in R為引物進行第二輪PCR擴增，得到擴增產物，用于測序檢測。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3的PCR反應按以下條件進行擴增94 "C 2 min ；98 "C IOs,55 "C 30s,68 "C 110 s、35 個循環；68 "C 5 min。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟4的PCR反應按以下條件進行擴增94 "C 2 min ；98 V IOs,55 V 30s,68 °C 50s,35 個循環；68 V 5 min。
全文摘要
本發明公開了一種人白血病融合基因BCR-ABL的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列為BCR_exF5’-TTCCGCTGACCATCAATAAG-3’；ABL_exR5’-CGCATGAGTTCATAGACCTT-3’；ABL_inF5’-CGAGTTGGTTCATCATCATTCA-3’；ABL_inR5’-CCTTCTCTAGCAGCTCATACA-3’。本發明還公開了使用上述引物對人白血病融合基因BCR-ABL進行RT-PCR的方法，根據該方法可以獲得純凈單一的反轉錄產物，并利用巢式PCR達到定性檢測BCR-ABL的存在與否和擴增出可供測序的包含14個常見ABL激酶區點突變位點的片段，該方法可顯著提高人白血病融合基因RT-PCR的擴增成功率。
文檔編號C12N15/10GK102533740SQ201110264119
公開日2012年7月4日 申請日期2011年9月7日 優先權日2011年9月7日
發明者方國偉, 朱梁, 王文芳 申請人:杭州艾迪康醫學檢驗中心有限公司