專(zhuān)利名稱(chēng)：J亞群禽白血病病毒基因檢測(cè)用引物組、檢測(cè)方法和快速檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及J亞群禽白血病病毒基因的生物學(xué)鑒定，具體涉及一種J亞群 禽白血病病毒基因檢測(cè)用引物組、檢測(cè)方法和快速檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
目前對(duì)于禽白血病國(guó)內(nèi)外尚未有效的疫苗和藥物進(jìn)行防制，控制該病
的主要手段是通過(guò)對(duì)雞群定期進(jìn)行禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus, ALV)檢測(cè)，及時(shí)淘汰帶毒陽(yáng)性雞，通過(guò)頻度檢測(cè)來(lái)凈化和清除雞群中的 ALV。
根據(jù)病毒在不同遺傳型雞胚成纖維細(xì)胞上的宿主范圍、不同病毒間的 干擾情況及病毒囊膜中和抗原特性，可將ALV分成A、 B、 C、 D、 E和J 亞群6亞群。A亞群和B亞群病毒為臨床上常見(jiàn)的外源性病毒，E亞群為 極普遍的非致瘤性內(nèi)源性病毒，而C、 D亞群病毒在臨床上相對(duì)罕見(jiàn)，外 源性J亞群禽白血病病毒(ALV-J)則是最新被鑒定的新亞群。在各種外源 性ALV亞群中，目前以ALV-J亞群對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的危害性最大，并出現(xiàn)了 髓細(xì)胞瘤型和血管瘤型等多種病理表現(xiàn)型，在臨床表現(xiàn)上還容易與網(wǎng)狀內(nèi) 皮細(xì)胞增殖綜合征、馬立克氏病等腫瘤性疾病相混淆。
目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于ALV-J的檢測(cè)方法主要有ELISA、間接免疫熒光試 驗(yàn)、常規(guī)PCR等，其中以ELISA法在臨床上應(yīng)用最廣，其主要原因是該法 操作相對(duì)簡(jiǎn)便，有商品化的檢測(cè)試劑盒可以利用，國(guó)內(nèi)外一些大型種禽場(chǎng) 多采用該方法進(jìn)行種禽群的檢測(cè)和凈化。但是目前的ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)對(duì)象是ALV的群特異性抗原，由 于內(nèi)源性ALV群特異性抗原的存在，故ELISA檢測(cè)有一定的假陽(yáng)性。ELISA 檢測(cè)的另一個(gè)不足之處在于目前國(guó)內(nèi)使用的禽白血病檢測(cè)試劑盒均是國(guó)外 進(jìn)口，其價(jià)格非常昂貴。
ALV-J常規(guī)PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)也己經(jīng)建立，但其操作復(fù)雜，對(duì) 設(shè)備儀器有專(zhuān)門(mén)的要求，適于在實(shí)驗(yàn)室條件下使用，而難以在基層推廣利 用。鑒于我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)正面臨較大的禽白血病威脅，需要建立一種快速、簡(jiǎn) 便的ALV-J檢測(cè)方法，以推動(dòng)和促進(jìn)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)對(duì)J亞群禽白血病的凈化 與防控。
等溫?cái)U(kuò)增(Isothermal Amplification)核酸快速檢測(cè)技術(shù)是病原核酸檢測(cè) 技術(shù)上的長(zhǎng)足進(jìn)步，現(xiàn)已建立起來(lái)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)具有很多 的優(yōu)越性，LAMP主要是利用4種不同的特異性引物(引物F3、引物B3、引 物FIP和引物BIP)識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)段，在聚合酶和等溫條件下高效、 快速、特異地?cái)U(kuò)增靶序列，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，通常是采用染色劑對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn) 行分析。LAMP中所用到的聚合酶通常都選用具有鏈置換特性的DNA聚合酶， 如BstDNA聚合酶。對(duì)LAMP來(lái)說(shuō)，4種特異性引物的設(shè)計(jì)是其關(guān)鍵所在。
LAMP因其自身的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)己被用于病原微生物的檢測(cè)和傳染性疾病的診 斷，如嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)、新城疫病毒(NDV)、 I型艾滋病病毒(HIV-1)的檢測(cè)、分支桿菌屬檢測(cè)、腺病毒性結(jié)膜炎檢測(cè)、 真菌檢測(cè)等，現(xiàn)尚未見(jiàn)有LAMP用于ALV-J基因檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)J亞群禽白血病病毒基因的引物組。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供用上述引物組快速、高效、特異性檢測(cè)禽白 血病病毒J亞群基因的檢測(cè)方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供根據(jù)上述檢測(cè)方法制備的快速檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下方案予以實(shí)現(xiàn)的
一、 本發(fā)明的J亞群禽白血病病毒基因檢測(cè)用引物組，是基于環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增技術(shù)，根據(jù)已公開(kāi)的J亞群禽白血病病毒基因序列，選取J亞群禽白血病 病毒基因的特異性序列，然后分析設(shè)計(jì)出的，能專(zhuān)一性鑒別J亞群禽白血病病 毒基因的特異性引物組，通過(guò)LAMP來(lái)鑒定J亞群禽白血病病毒基因，該引 物組由如下四條引物組成
外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； 內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示； 內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示； 其中，R為G或A， Y為T(mén)、 U或C。
二、 本發(fā)明的快速檢測(cè)方法，是采用上述引物組，對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，陽(yáng)性反應(yīng)顯示梯狀帶，或 向反應(yīng)產(chǎn)物加顯色劑，根據(jù)顏色變化判斷反應(yīng)結(jié)果。
上述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)參考教科書(shū)以及常用LAMP試劑盒中的反應(yīng)體 系和反應(yīng)條件均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，具體操作時(shí)可選擇如下反應(yīng)條件和反應(yīng)體系
LAMP反應(yīng)體系(總25ul): FIP和BIP各lul， F3和B3各0.25ul， BSTDNA 聚合酶lul， 10X反應(yīng)緩沖液2.5ul， dNTP 8ul，甜菜堿2ul，硫酸鎂lul，待檢DNA樣品(含陽(yáng)性對(duì)照品)lul，補(bǔ)水至25ul。上述各組分添加量為最佳
上述10X反應(yīng)緩沖液是本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行Bst DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng) 時(shí)常用的反應(yīng)試劑，可采用試劑盒中搭配Bst DNA聚合酶的10X反應(yīng)緩沖 液，通常可包括如下組分200mMpH8.8的Tris-HCl、 100mM的KCl、 100mM 的(NH4)2S04、 20mM的MgS04和l。/。 Triton X-100 (1 XTritonX-100是Triton X-100占反應(yīng)液的體積百分比為1X)。
上述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件可采用本領(lǐng)域人員操作環(huán)介導(dǎo)等溫
擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)的常規(guī)反應(yīng)條件，優(yōu)選恒溫反應(yīng)溫度為63 65°C，恒溫反應(yīng)時(shí)間 為45 90min。
上述檢測(cè)方法中，顯色劑可選擇SYBR Green I或EvaGreen其中一種常用 的熒光染料，優(yōu)選SYBR Green I。
本發(fā)明的檢測(cè)方法，應(yīng)設(shè)置一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和一個(gè)陰性對(duì)照，用來(lái)和 LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，從而判斷待測(cè)樣品是否含有J亞群 禽白血病病毒基因。
LAMP反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和顯色劑顯 色反應(yīng)檢測(cè)
(1) 將反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在陰陽(yáng)性對(duì)照成立條件下，如果 LAMP產(chǎn)物呈現(xiàn)特征性梯狀帶，則為陽(yáng)性，說(shuō)明待測(cè)樣品含有J亞群禽白血病 病毒基因；如果LAMP產(chǎn)物無(wú)特征性梯狀帶，則為陰性，說(shuō)明待測(cè)樣品不含有 J亞群禽白血病病毒基因。
(2) 將LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBRGrcen I熒光染料，在陰陽(yáng)性對(duì)照成立條件下，如果反應(yīng)管顏色發(fā)生變化，最終為黃色，則為陽(yáng)性，說(shuō)明待測(cè)樣品含
有禽白血病病毒J亞群基因；如果反應(yīng)管無(wú)顏色變化，呈現(xiàn)SYBR Green I熒 光染料的橘紅色，則為陰性，說(shuō)明待測(cè)樣品不含有J亞群禽白血病病毒基因。
三、根據(jù)上述的檢測(cè)方法，本發(fā)明還提供一種快速檢測(cè)試劑盒，該試劑盒 包含
a. J亞群禽白血病病毒基因檢測(cè)用引物組外引物F3，其核苷酸序列如 SEQIDNO:l所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；內(nèi)引物 FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其中，R為G或A， Y為T(mén)、 U或C，內(nèi)外引物的使用濃度均 為25pM/ul;
b. 陰陽(yáng)性對(duì)照攜帶J亞群禽白血病病毒基因的質(zhì)粒DNA作為陽(yáng)性對(duì) 照，提供使用濃度為100ng/ul;去離子水作為陰性對(duì)照。
c. 顯色劑可選擇SYBR Green I或EvaGreen其中一種常用的熒光染料，優(yōu) 選SYBRG證I。
該試劑盒操作時(shí)，只需要將待測(cè)樣品DNA與上述檢測(cè)用引物組進(jìn)行常規(guī) 的LAMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入顯色劑，同時(shí)做陰陽(yáng)性對(duì)照，在對(duì)照成立條 件下，如果反應(yīng)產(chǎn)物的顯色結(jié)果和陽(yáng)性對(duì)照的顯色結(jié)果一致，則為陽(yáng)性，說(shuō)明 待測(cè)樣品中含有J亞群禽白血病病毒基因，如果反應(yīng)產(chǎn)物的顯色結(jié)果和陰性對(duì) 照的顯色結(jié)果一致，則為陰性，說(shuō)明待測(cè)樣品中不含有J亞群禽白血病病毒基 因。 —
上述檢測(cè)試劑盒還包含
a. Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段，提供使用濃度為8U/ul;b.反應(yīng)液含有10X反應(yīng)緩沖液、5M/L的甜菜堿、100mM/L的硫酸鎂和 2.5mM/L的dNTP混合物，所述10X反應(yīng)緩沖液、甜菜堿、硫酸鎂和dNTP混合 物的體積比為2.5:2:1:8;所述10X反應(yīng)緩沖液含有200mM pH 8.8的Tris-HCl、 1 OOmM KC1 、 1 OOmM (NH4)2S04、 20mM MgS04和1 % Triton X-100;
C.穩(wěn)定劑可選擇一種常用的穩(wěn)定液，優(yōu)選石蠟油，防止反應(yīng)產(chǎn)物蒸發(fā)污 染環(huán)境。
25ul反應(yīng)體系中上述各確定濃度組分的添加量FIP和BIP各lul， F3和 B3各0.25ul， BSTDNA聚合酶lul， IOX反應(yīng)緩沖液2.5ul， dNTP混合物8ul， 甜菜堿2ul，硫酸鎂lul，待檢DNA樣品(含陽(yáng)性對(duì)照品)lul，補(bǔ)水至25ul。 混勻，本發(fā)明試劑盒中還可以在最后加入穩(wěn)定劑，如石蠟油以防污染環(huán)境。 63。C水浴45 90min。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
1. 引物設(shè)計(jì)是LAMP技術(shù)的關(guān)鍵所在，對(duì)于引物設(shè)計(jì)有許多的要求，如各 個(gè)引物之間的距離、Tm值以及引物末端穩(wěn)定性等，因此從200~300個(gè)堿基的 靶序列中設(shè)計(jì)四條符合要求的引物存在很大的難度。本發(fā)明根據(jù)靶基因序列設(shè) 計(jì)了一種J亞群禽白血病病毒基因檢測(cè)用引物組，能特異性識(shí)別靶序列上的六 個(gè)獨(dú)立區(qū)域，在^W DNA聚合酶的作用下啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA 區(qū)啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu) 的莖-環(huán)DNA混合物，由于LAMP技術(shù)只有在四條引物完全識(shí)別靶序列六個(gè) 結(jié)合區(qū)的情況下才能順利進(jìn)行，所以本發(fā)明的引物組在很大程度上減少了擴(kuò)增 反應(yīng)的背景影響，大大改善了 J亞群禽白血病病毒基因檢測(cè)的特異性；
2. 本發(fā)明的快速檢測(cè)方法其檢測(cè)靈敏度高，擴(kuò)增模板僅需IO拷貝或更少，比常規(guī)PCR檢測(cè)高1 2數(shù)量級(jí)；
3. 本發(fā)明的快速檢測(cè)方法采用LAMP技術(shù)，不需通過(guò)溫度循環(huán)變化來(lái) 擴(kuò)增，從而免除變溫過(guò)程耗費(fèi)的時(shí)間，它在45 90min就能將幾個(gè)拷貝的 靶基因高效擴(kuò)增，且反應(yīng)條件溫和，不需精確的儀器以及凝膠成像系統(tǒng)，只 需一臺(tái)普通水浴鍋，也不需要特殊試劑，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、 容易污染及檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)；
4. 本發(fā)明的快速檢測(cè)試劑盒擴(kuò)增快速且高效，在不到1小時(shí)即可完成擴(kuò)增， 且產(chǎn)率高，而且采用顯色反應(yīng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，陰陽(yáng)性結(jié)果顯色差異顯著， 可肉眼直接觀察，易于判定，驗(yàn)證率高，更加明顯可靠；
5. 本發(fā)明的快速檢測(cè)試劑盒操作簡(jiǎn)單，對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低， 可建立成本低廉的快速篩選體系，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。


圖1為L(zhǎng)AMP檢測(cè)禽白血病病毒J亞群基因的特異性試驗(yàn)?zāi)z電泳圖； 其中，M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker， l為揚(yáng)州Js-nt株，2為廣東分離
樣品株SCAU-0901， 3為廣東分離樣品株SCAU-CHN， 4為質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照，
1 4均為J亞群，5為GD08株(A亞群)，6為CD08 (B亞群)，7為E1 (E亞群)，
8為E2 (E亞群)，9為E3 (E亞群)，NC為陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā) 明做任何限定。
實(shí)施例l J亞群禽白血病病毒基因檢測(cè)用引物組的制備 本實(shí)施例將NCBI中已公開(kāi)的ALV-J原型株HPRS-103的前病毒全基因序列，與國(guó)內(nèi)外15株已公開(kāi)的ALV全基因序列進(jìn)行同源性比較，從而確 定J亞群禽白血病病毒前病毒基因組的特異序列區(qū)，選擇特異序列區(qū)大小
在300bp左右，根據(jù)該特異序列區(qū)設(shè)計(jì)出可用于LAMP反應(yīng)的，對(duì)J亞群
禽白血病病毒基因具有高特異性的引物組
外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； 內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示； 內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示； 其中，R為G或A， Y為T(mén)、 U或C。 實(shí)施例2 J亞群禽白血病病毒基因快速檢測(cè)方法
本實(shí)施例選擇樣品為臨床送檢疑似禽白血病感染的樣品，按照 OMEGA公司SQ Tissue組織DNA試劑盒抽提細(xì)胞DNA，具體操作過(guò)程 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，制備DNA模板，-20°(:保存?zhèn)溆谩?br> 將實(shí)施例1設(shè)計(jì)的引物組送去上海英俊生物有限公司合成，然后將四 條引物分別稀釋成25 pM/ul。
LAMP反應(yīng)體系(總25ul): FIP和BIP各lul， F3和B3各0.25ul， BSTDNA聚合酶8U， 10X反應(yīng)緩沖液2.5ul， dNTP8ul，甜菜堿2.0ul，硫 酸鎂1.0ul，待檢DNA樣品(含陰陽(yáng)性對(duì)照品)1.0ul，補(bǔ)水至25ul。混勻， 加石蠟油以防污染環(huán)境。63。C水浴鍋水浴45min完成LAMP反應(yīng)。
向上述反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBR Green I熒光染料，反應(yīng)液顏色發(fā)生變 化，最終為黃色，說(shuō)明本實(shí)施例樣品含有禽白血病病毒J亞群基因。
本實(shí)施例中所用的甜菜堿、BstDNA聚合酶大片段、硫酸鎂、dNTP和IOX反應(yīng)緩沖液均為市售，或者LAMP試劑盒配有的。
實(shí)施例3 LAMP法檢測(cè)J亞群禽白血病病毒基因的特異性試驗(yàn) 本實(shí)施選擇已經(jīng)鑒定具有J亞群禽白血病病毒基因的3個(gè)樣品作為陽(yáng)性
實(shí)驗(yàn)組揚(yáng)州Js-nt株、廣東分離樣品株SCAU-0901和廣東分離樣品株
SCAU-C麗；
本實(shí)施例選擇已經(jīng)鑒定不具有禽白血病病毒J亞群基因的5個(gè)樣品作為 陰性實(shí)驗(yàn)組GD08 (A亞群)、CD08 (B亞群)、El (E亞群)、E2 (E亞群) 和E3 (E亞群)。
同時(shí)本發(fā)明還設(shè)立兩個(gè)陰陽(yáng)性對(duì)照。
本發(fā)明對(duì)上述陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組、陰性實(shí)驗(yàn)組和陰陽(yáng)性對(duì)照分別進(jìn)行LAMP擴(kuò) 增，所用引物為實(shí)施例1制備所得引物組，LAMP反應(yīng)體系為總體系25ul， 含有內(nèi)引物FIP和BIP各l.Oul、外引物F3和B3各0.25ul、 Bst DNA聚合 酶1.0ul、 IOX反應(yīng)緩沖液2.5ul、甜菜堿2.0ul、硫酸鎂l.Oul、 dNTP 8ul、 DNA模板l.Oul和去離子水7.0ul;所述IOX反應(yīng)緩沖液含有200mMpH8.8 的Tris-HCl、 100mM的KC1、 100mM的(NH4)2S04、 20mM的MgS04和1% Triton X-100 。 63 。C恒溫反應(yīng)45min。
將各LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物均分為兩部分， 一部分進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如圖 l所示，陽(yáng)性樣品的LAMP擴(kuò)增結(jié)果(1、 2、 3、 4)中核酸電泳條帶呈現(xiàn)梯 狀分布，與理論結(jié)果相符，陰性對(duì)照未見(jiàn)特異性帶出現(xiàn)，同樣地陰性試驗(yàn) 組也均無(wú)特異性條帶出現(xiàn)，由此說(shuō)明本發(fā)明的LAMP檢測(cè)用引物組以及檢 測(cè)方法具有較高的特異性。
各LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的另外一部分分別加入SYBR Green I熒光染料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照以及陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組的反應(yīng)液顏色均發(fā)生變化，最終為黃色; 而陰性對(duì)照組以及陰性實(shí)驗(yàn)組的反應(yīng)液顏色均未發(fā)生變化，依然為橘紅色。 顏色反應(yīng)的結(jié)果和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果保持一致，這進(jìn)一步說(shuō)明
本發(fā)明的LAMP檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高，且顏色反應(yīng)能準(zhǔn)確快速地判斷樣品中
是否含有J亞群禽白血病病毒基因。
實(shí)施例4 J亞群禽白血病病毒基因檢測(cè)試劑盒
本實(shí)施例J亞群禽白血病病毒基因檢測(cè)試劑盒的制備
(1) 采用DNA合成儀合成如下序列引物，內(nèi)外引物濃度均為25pM/ul。內(nèi) 外引物置于一容器；
外引物F3，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示； 外引物B3，其核苷酸序列如SEQIDN0:2所示； 內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示； 內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；
(2) 購(gòu)置DNA聚合酶B^DNA聚合酶置于容器，提供使用濃度為8 IU/ul;
(3) 購(gòu)置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；
(4) 購(gòu)置顯色液SYBR Green I，置于容器；
(5) 購(gòu)置陰陽(yáng)性對(duì)照提取含J亞群禽白血病病毒基因的質(zhì)粒DNA，置 于一容器,提供使用濃度為100ng/ul;去離子水作為陰性對(duì)照，置于一容器；
(6)反應(yīng)液含有10X反應(yīng)緩沖液、5M/L的甜菜堿、100mM/L的硫酸鎂 禾口2.5mM/L的dNTP，所述10X反應(yīng)緩沖液、甜菜堿、硫酸鎂和dNTP的體積比 為2.5:2:1:8;所述10X反應(yīng)緩沖液含有200mM pH 8.8的Tris-HCl、 100mM的 KC1、 100mM的(NH4)2S04、 20mM的MgS04和l。/。 Triton X-100;(7)將上述7個(gè)容器裝成試劑盒，封裝。
本實(shí)施例選擇SCAU-0901株接種的DF-1細(xì)胞為樣品，按照OMEGA公司 DNA試劑盒抽提細(xì)胞DNA，具體操作過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，制備 DNA模板。
采用上述制備所得試劑盒對(duì)樣品中是否含有J亞群禽白血病病毒基因進(jìn)
行快速檢測(cè)
向反應(yīng)管中加入FIP和BIP各lul， F3和B3各0.25ul， BST DNA聚合 酶lul， IOX反應(yīng)緩沖液2.5ul， dNTP 8ul，甜菜堿2ul，硫酸鎂lul，待檢 DNA樣品(含陽(yáng)性對(duì)照品)lul，補(bǔ)水至25ul。混勻，加石蠟油以防污染環(huán) 境。63'C水浴鍋水浴45min完成LAMP反應(yīng)。
向上述反應(yīng)產(chǎn)物中加入SYBR Green I熒光染料，反應(yīng)液顏色未發(fā)生 變化，依然為橘紅色，陽(yáng)性對(duì)照加入燃料后顏色發(fā)生變化，顯示為黃色， 說(shuō)明本實(shí)施例樣品不含J亞群有禽白血病病毒基因。
14J亞群禽白血病病毒基因檢測(cè)用引物組、檢測(cè)方法和快速檢測(cè)試劑盒序列表 SEQUENCE LISTING
<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120〉 J亞群禽白血病病毒基因檢測(cè)用引物組、檢測(cè)方法和快速檢測(cè)試劑盒
<130〉
〈160〉 4
<170〉 Patentln version 3. 5
<210> 1
<211> 19
<212〉 DNA <213>人工序列
<400> 1
ggraaggtga gcaagaagg 19
<210〉 2
<211〉 20
<212> DNA <213>人工序列
<400> 2
ygtcttattt gcccaggtga 20
<210〉 3
<2U> 39
<212> 腿 <213〉人工序列
〈400〉 3
rtaacctctc gayggcagca ctctaagaag aagccgcca 39
<210> 4
<211〉 40
<212> DNA <213〉人工序列
<400> 4
atttcygttg tcccaggggt gcccacacgt ttcctggttg 40
權(quán)利要求
1、一種J亞群禽白血病病毒基因檢測(cè)用引物組，其特征在于該引物組由如下四條引物組成外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示；內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示；內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO4所示；其中，R為G或A，Y為T(mén)、U或C。
2、 一種J亞群禽白血病病毒基因檢測(cè)方法，其特征在于該方法是利用權(quán)利 要求1所述引物組通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)來(lái)鑒定待測(cè)樣品是否含有J亞群禽 白血病病毒特異基因。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng) 條件為恒溫反應(yīng)溫度為63 65匸，恒溫反應(yīng)時(shí)間為45 90min。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反 應(yīng)體系為總體系25ul，含有內(nèi)引物FIP和BIP各l.Oul、外引物F3和B3 各0.25ul、 BstDNA聚合酶1.0ul、 10X反應(yīng)緩沖液2.5ul、甜菜堿2.0ul、 硫酸鎂1.0ul、 dNTP8ul、 DNA模板1.0ul和去離子水7.0ul;所述IOX反應(yīng) 緩沖液含有200mM pH 8.8的Tris-HCl、 100mM的KC1、 100mM的 (NH4)2S04、 20mM的MgSCU和1% Triton X-100。
5、 一種J亞群禽白血病病毒基因快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒包含a.權(quán)利要求l所述J亞群禽白血病病毒基因檢測(cè)用引物組，F(xiàn)IP、 BIP、 F3和 B3，各25pMM;b. 陽(yáng)性對(duì)照品攜帶J亞群禽白血病病毒基因的質(zhì)粒DNA， 100ng/ul;c. 顯色劑SYBR Green I或EvaGreen。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述試劑盒，其特征在于該試劑盒還包含a. Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段，8U/ul;b. 反應(yīng)液含有10X反應(yīng)緩沖液、5M/L的甜菜堿、100mM/L的硫酸鎂和 2.5mM/L的dNTP，所述10X反應(yīng)緩沖液、甜菜堿、硫酸鎂和dNTP的體積比為 2.5:2:1:8;所述10X反應(yīng)緩沖液含有200mM pH 8.8的Tris-HCl、 100mM的 KC1、 100mM的(NH4)2S04、 20mM的MgSO^ni% Triton X-100。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于該試劑盒還包含液體石蠟油。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種J亞群禽白血病病毒基因檢測(cè)用引物組、檢測(cè)方法和快速檢測(cè)試劑盒，該引物組由外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP這四條引物組成，其核苷酸序列如SEQ ID NO1～4所示，其中，R為G或A，Y為T(mén)、U或C。本發(fā)明采用上述引物組，在優(yōu)化的最佳體系下對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，陽(yáng)性反應(yīng)在瓊脂糖凝膠電泳中顯示梯狀帶，同時(shí)在反應(yīng)產(chǎn)物中加入顯色劑，陽(yáng)性反應(yīng)會(huì)發(fā)生明顯的顏色變化。本發(fā)明的引物組和試劑盒均可高效高特異性地檢測(cè)J亞群禽白血病病毒基因，在不足1h即可完成擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)成本低、耗時(shí)短、產(chǎn)率高，特異性高，且陰陽(yáng)性結(jié)果顯色差異顯著，驗(yàn)證率高，更加明顯可靠。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101586168SQ20091004039
公開(kāi)日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者濤 任, 明 廖, 張小桃, 曹偉勝, 羅開(kāi)健 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)