專利名稱：核糖核酸酶的檢測方法及其應用和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學及分子診斷領域，具體而言，涉及一種受試者體液中核糖核酸酶的檢測方法、該方法在腫瘤檢測中的應用以及一種腫瘤檢測試劑盒。
背景技術：
早期診斷是疾病尤其是腫瘤治療中的一個關鍵環節。通常，人們通過測量血液中的每種腫瘤對應的物質(通常被稱為腫瘤標志物)來檢測各種腫瘤。所述的腫瘤標志物可定義為“在癌細胞產生的物質中或是在因體內正常細胞與癌細胞相互作用而產生的物質中，可通過對血液、組織和排泄物(尿液和糞便)等進行檢查從而用作為癌癥診斷或治療的標志物的物質”。
核糖核酸酶或稱RNA酶，是一大類包括數十個種類的、能夠將RNA底物水解成小分子核酸的酶。1958年，Miliarese首先提出血清RNase濃度與惡性腫瘤有密切關系。1970年， Reddi首次證實膜腺癌患者血清RNase異常升高(Reddi KK, Holland JF. Elevated serum ribonuclease in patients with pancreatic cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 1976, 73(7) :2308-10)。在胰腺癌診斷中，應用最多的是測定血清RNase的濃度，這是由該酶的組織來源的和在血清中的高濃度所決定的。實驗證明，RNase酶在胰腺和血清中的含量比其他組織器官高100倍以上，而且血清中提取的RNase在生物化學和免疫學特性與胰腺來源的 RNase非常類似，并且均可被RNase抑制劑所抑制。這些相同的特性表明，血清中的RNase 主要來源于胰腺。
為了檢測樣本中核糖核酸酶的活性或含量，研究人員在分析底物降解的基礎上， 建立了許多技術方案。早期的核糖核酸酶活性檢測是建立在Kunitz技術上(Kunitz M. A spectrophotometric method for the measurement of ribonuclease activity. J. Biol. Chem.，1946，164 :563-568)。在該技術中，他們向被檢測樣本中加入異質性的RNA樣本，通過分光光度法檢測RNA樣本在300nm吸收值的變化 ，計算樣本中核糖核酸酶的活性。除了以異質性的核糖核酸分子為底物，另一類核糖核酸酶檢測方法是以人工合成的核糖核酸分子為底物，例如寡聚核糖核酸分子。通常情況下，以人工合成的寡聚核糖核酸分子為底物的檢測技術具有更高的靈敏度和更好的特異性。其中的代表性技術是1991年由Witmer 等人建立的(Witmer MR, Falcomer CM, Weiner MP, Kay MS, Begley TP, Ganem B and Scheraga HA. U~3' -BCIP a chromogenic substrate for the detection of RNase A in recombinant DNA expression systems. Nucleic Acids Res. , 1991,19 :1-4)。該技術的主要特點是合成了核糖核酸酶底物U-3' -BCIP，該底物在核糖核酸酶的作用下會釋放一種報告基團，利用分光光度計在650nm條件下檢測報告基團的釋放情況，從而計算樣本中核糖核酸酶的活性和含量。這些不同的技術方案以及他們的改進方案雖然在一定程度上提高核糖核酸酶活性檢測的靈敏度和準確性，但均存在一定的缺陷，不適合作為一個通用的研究手段用于樣本核糖核酸酶活性的高通量檢測，在技術上還有較大的可改進的空間。
綜上所述，本領域迫切需要一種靈敏而特異的基于核糖核酸酶的疾病診斷尤其是腫瘤診斷標志物、以及相應的檢測技術。發明內容
為了開發可用于人類疾病尤其是腫瘤早期診斷的生物標志物、以及相應的檢測技術，提高人類疾病尤其是腫瘤檢測的靈敏度和特異性，發明人對核糖核酸酶降解雙鏈核糖核酸底物的過程及機制進行了廣泛而深入的研究，意外地發現絕大多數降解發生在雙鏈核糖核酸底物的兩個敏感位點CA/UG和UA/UA位點上。在這一研究結果的基礎上，完成了本發明。
—方面，本發明提供了一種核糖核酸酶的檢測方法，該方法包括以下步驟1)從受試者個體中獲得體液樣本；2)使所述體液樣本與雙鏈核酸接觸，使得所述雙鏈核酸能夠被所述體液樣本中可能存在的核糖核酸酶切割；3)檢測步驟2)中的接觸后的產物，從而檢測所述體液樣本中核糖核酸酶的含量；
其中，所述體液樣本為血液、血漿、血清、唾液、組織液和尿液樣本中的至少一種；
所述雙鏈核酸為能夠被核糖核酸酶切割的雙鏈核酸，其長度為7-30個堿基對，所述雙鏈核酸的第一單鏈的堿基序列中含有至少一個CA堿基序列或UA堿基序列，第二單鏈的堿基序列中含有與第一單鏈中CA堿基序列或UA堿基序列互補的UG堿基序列或UA堿基序列，所述雙鏈核酸的一端連接有能量供體基團，另一端連接有能量受體基團，且所述能量供體基團和能量受體基團之間能夠進行能量轉移。
根據本發明的一種實施方式，其中，所述雙鏈核酸的長度為7-30個堿基對，優選為 22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個堿基對；還可以優選為 7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20或21個堿基對，進 一步優選為9、10、11、12、13、14或15個堿基對，還可以進一步優選為7、8、9、10、11或12個堿基對。
根據本發明的一種實施方式，其中，所述雙鏈核酸的第一單鏈的堿基序列中含有至少一個CA堿基序列，所述雙鏈核酸的第二單鏈的堿基序列中含有與所述第一單鏈中CA 堿基序列互補的UG堿基序列。
根據本發明的一個實施方式，其中，所述雙鏈核酸的第一單鏈的堿基序列中含有至少一個UA堿基序列，所述雙鏈核酸的第二單鏈的堿基序列中含有與所述第一單鏈中UA 堿基序列互補的UA堿基序列。
根據本發明的一種實施方式，其中，所述雙鏈核酸的第二單鏈與第一單鏈完全互補，所述雙鏈核酸的第一單鏈的堿基序列優選為5’ -AUGAGCCUGAUUU、5’ -AUGAGCCUAAUUU、 5，-GGCUGCU、5，_GAAUGAGCU、5，_GAGUCAGCUAATCUU、5，-UGGUAUGAGCCUGAUUUUGAU 或 5，-AGC UGGUGGUACAGAUGAUCUUGCAUCGUC，進一步優選為 5’ -AUGAGCCUGAUUU。
根據本發明的一種實施方式，其中，所述雙鏈核酸中含有至少一個脫氧核糖核苷酸基團。
根據本發明的一種實施方式，其中，所述雙鏈核酸中含有至少一個修飾的核苷酸基團。
根據本發明的一種實施方式，其中，所述修飾的核苷酸基團為磷酸基團、核糖基團和堿基中的至少一種被修飾的核苷酸基團，其中，核糖基團被修飾的核苷酸基團為核糖基團的2’ -羥基被修飾的核苷酸基團，所述核糖基團被修飾的核苷酸基團優選為核糖基團的2’ -羥基被甲氧基或氟取代的核苷酸基團。
根據本發明的一種實施方式，其中，所述能量供體基團和所述能量受體基團位于雙鏈核酸的同一條核酸單鏈上，或者位于不同核酸單鏈上。優選所述能量供體基團和所述能量受體基團位于同一或不同單鏈的兩端。
根據本發明的一種實施方式，其中，所述能量供體基團為熒光供體基團，所述能量受體基團為熒光受體基團，其中，所述的熒光受體基團優選為熒光淬滅基團。
優選所述突光供體基團為選自突光素(fluorescein)基團、四氯突光素 (tetrachlorofiuorescein)基團、六氯突光素(hexachlorofIuorescein)基團、羅丹明 (rhodamine)基團、四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine)基團、花青染料(Cydye)、德克薩斯紅(Texas Red)基團、氟硼突光染料(Bodipy dye)基團和亞歷克薩突光染料(Alexa dye)基團中的至少一種,更優選為選自6-羧基突光素基團、5-四氯突光素基團、5_六氯突光素基團、6-羧基-X-羅丹明基團、N，N'-對羧芐基吲哚三菁基團和6-羧基四甲基羅丹明基團中的至少一種。
優選所述突光受體基團為選自氮代氧雜蒽(nitrogen-substituted xanthene)基團、取代或未取代的四偶氮苯基苯胺(substituted 4-(phenyldiazenyl)phenylamine)基團、取代或未取代的四偶氮苯基萘胺(substituted4_(phenyldiazenyl)naphthyIamine) 基團，更優選所述熒光受體基團為選自4-(4' - 二甲基對氨基偶氮苯)苯甲酸 (4-(4' -dimethylaminophenylazo)benzoic acid))基團、N, N'-雙甲基-N, N'-聯苯-4-(5-叔丁氧羰基戍胺)哌唳砜基羅丹明(N, N’ -dimethyl-N, N’ -diphenyl-4- ((5-t-butoxycarbony laminopenty I) minocarbony I) piper idiny lsulf onerhodamine)基團、4 ', 5' - 二硝基突光素(4' , 5' -dinitrofluorescein)基團、氨基哌唳酸(pipe-colic acid amide)基團、4-(4-硝化苯嗪基)苯胺(4-[4_nitrophenyldiazinyl]phenylamine)基團、 4-(4-硝化苯嗪基)萘胺(4- [4_nitrophenyldiazinyl]naphthylamine)基團中的至少一種。
本發明提供上述的檢測方法在腫瘤檢測中的應用。
根據本發明的一種實施方式，所述應用包括，I)根據上述檢測方法分別獲得來自于受試者的體液樣本和來自于健康對照個體的體液樣本中的核糖核酸酶的含量；2)比較來自于受試者的體液樣本和來自于健康對照個體的體液樣本中的核糖核酸酶的含量，來自于受試者的體液樣本中的核糖核酸酶的含量比來自于健康對照個體的體液樣本中的核糖核酸酶的含量低，表明該受試者異常；優選地，受試者體液樣本中的核糖核酸酶的含量比來自于健康對照個體的體液樣本中的核糖核酸酶的含量低30%以上，表明該受試者異常；進一步優選地,受試者體液樣本中的核糖核酸酶的含量比來自于健康對照個體的體液樣本中的核糖核酸酶的含量低50%以上，表明該受試者異常；最優選地，受試者體液樣本中的核糖核酸酶的含量比來自于健康對照個體的體液樣本中的核糖核酸酶的含量低70%以上，表明該受試者異常。
根據本發明的一種實施方式，所述健康對照個體的體液樣本中的核糖核酸酶的含量可以在需要預測受試者是否為異常時測得，更優選地，也可以預先檢測健康對照個體的體液樣本中的核糖核酸酶含量，設定其統計學上的取值范圍為正常核糖核酸酶含量范圍， 這樣，針對不同的受試者，只要測定該受試者體液樣本中的核糖核酸酶含量，然后以該正常核酸酶含量范圍為基準，比較受試者體液樣本中核酸酶含量的變化，即可進行特定腫瘤的早期預測或診斷。
其中，所述腫瘤優選為胃癌、結腸癌或肺癌。
另一方面，本發明還提供了一種腫瘤檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有本發明提供的雙鏈核酸；進一步還優選含有核糖核酸酶標準品。所述標準品即陽性對照品，是已知的具有核糖核酸酶活性的物質。
利用本發明所提供的核糖核酸酶檢測底物(即，雙鏈核酸)和檢測方法，能夠靈敏、準確地檢測來源于不同受試者體液中的核糖核酸酶的活性及含量。本發明提供的核糖核酸酶檢測方法不僅操作簡便，而且大大降低了檢測費用，對于多種疾病的早期檢測、療效評價、人群普查等大規模應用均具較高的使用價值。相對于現有技術而言，本發明提供的檢測方法具有明顯的技術優勢，主要包括以下幾個方面。
I)檢測穩定性相對于現有技術的核糖核酸酶的單鏈核酸底物，本發明提供的雙鏈核酸底物的穩定性更高，在實際應用中具有更為明顯的技術優勢。
2)高度特異性本發明是建立在對雙鏈核糖核酸底物中的核糖核酸酶切割敏感位點的基礎上完成的，利用所鑒定的核糖核酸酶切割敏感位點，本發明能夠實現核糖核酸酶的特異性檢測，從而提高了檢測的特異性和準確性。
3)定量檢測技術在本發明的兩個突出的技術特點，即，底物穩定性和高度特異性的基礎上，本發明提供的檢測方法能夠更加穩定地檢測樣本中核糖核酸酶的活性，并進一步計算出核糖核酸酶的含量，從而建立 了可行的核糖核酸酶定量檢測技術，是對現有檢測技術的一個重大發展和進步。
4)高通量檢測技術本發明提供的利用熒光能量共振轉移法檢測樣本中核糖核酸酶的活性和含量的方法操作簡單，適合于作為標準化的檢測方法而對大量樣本進行高通量、低成本的檢測。
5)廣泛的適用性本發明提供的雙鏈核酸底物及檢測方法可用于建立標準的核糖核酸酶檢測體系，及用于分析、比較樣本中或樣本間不同核糖核酸酶的活性及含量。
本發明提供了一種受試者體液中核糖核酸酶的檢測方法及其在腫瘤檢測中的應用，以及一種腫瘤檢測試劑盒。與現有技術相比，由于本發明提供的檢測底物更穩定和更特異，因此尤為適合于臨床檢測應用；另一方面，本發明建立了一種適合于高通量和大規模應用的定量檢測樣本中核糖核酸酶的方法，從而為疾病尤其是腫瘤的檢測提供了一種簡便、 高效的檢測技術。


圖1為本發明一種實施方式中RNase A處理前的反應體系在500-650nm范圍內的熒光光譜。
圖2為本發明一種實施方式中RNase A處理后的反應體系在500-650nm范圍內的突光光譜。
圖3為本發明一種實施方式中酶促反應時的檢測時間對熒光強度的曲線。
圖4為本發明一種實施方式中RNaseA濃度對K值的曲線。
圖5為本發明一種實施方式中健康對照個體與腫瘤個體樣本中核糖核酸酶含量
硫代磷酸修飾硼烷化磷酸鹽修飾
所述核糖修飾是指對核苷酸戊糖中V -羥基C -0H)的修飾。在核糖的 2'-羥基位置引入某些取代基如甲氧基或氟后，使血清中的核糖核酸酶不易識別小干涉核酸，由此增加了小干涉核酸的穩定性，使小干涉核酸具有更強的抵抗核酸酶水解的性能。對核苷酸戍糖中2'-輕基的修飾包括2'-氟修飾(2' -fiuro modification)、8的比較圖。
具體實施方式
本發明中，突光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer， FRET)是指，當一個熒光基團(又稱為熒光供體基團)的熒光光譜與另一個熒光基團(又稱為熒光受體基團)的激發光譜相重疊時，熒光供體基團的激發能誘發熒光受體基團發出突光，同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減的一種現象。FRET的產生及效率與熒光供體基團與熒光受體基團的空間距離緊密相關，該空間距離在7-10nm時FRET的效率最佳。隨著距離延長，FRET呈顯著減弱。熒光供體基團和熒光受體基團之間的FRET的效率，可以由E =l/l+(R/Ro)6反映。其中，R表示熒光供體基團和熒光受體基團之間的距離，Rtl表示福氏距離。在福氏距離R0處，熒光供體基團與熒光受體基團間的FRET效率為50%。福氏距離 R0依賴于供體發射譜和受體激發譜的重疊程度、以及供體和受體能量轉移的偶極子的相對方位。
應當理解，凡是具有熒光發射光譜和熒光激發光譜重疊的熒光基團，S卩，能夠發生 FRET現象的熒光基團組合均能應用于本發明。這些熒光基團組合包括但不限于本說明書中提到的各種熒光基團組合。
本發明中，對雙鏈核酸進行修飾的方式為本領域技術人員所公知。例如，本發明對雙鏈核酸進行的化學修飾為以下的一種或一種以上化學修飾的組合
(I)對雙鏈核酸的骨架結構中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；
(2)對雙鏈核酸的骨架結構中核糖的修飾；
(3)對雙鏈核酸的核苷酸殘基中堿基的修飾。
所述磷酸二酯鍵的修飾是指對磷酸二酯鍵中的氧進行修飾，包括硫代磷酸修飾 (Phosphorthioate)和硼燒化磷酸鹽修飾(Boranophosphate)。如下式所示分別用硫和硼燒置換磷酸二酯鍵中的氧。兩種修飾都能穩定核糖核酸分子的結構，保持堿基配對的高特異性和高親和力。
權利要求
1.一種核糖核酸酶的檢測方法，該方法包括以下步驟1)從受試者個體中獲得體液樣本；2)使所述體液樣本與雙鏈核酸接觸,使得所述雙鏈核酸能夠被所述體液樣本中可能存在的核糖核酸酶切割；3)檢測步驟2)中的接觸后的產物，從而檢測所述體液樣本中核糖核酸酶的含量； 其中，所述體液樣本為血液、血漿、血清、唾液、組織液和尿液樣本中的至少一種； 所述雙鏈核酸為能夠被核糖核酸酶切割的雙鏈核酸，其長度為7-30個堿基對，所述雙鏈核酸的第一單鏈的堿基序列中含有至少一個CA堿基序列或UA堿基序列，第二單鏈的堿基序列中含有與第一單鏈中CA堿基序列或UA堿基序列互補的UG堿基序列或UA堿基序列，所述雙鏈核酸的一端連接有能量供體基團，另一端連接有能量受體基團，且所述能量供體基團和能量受體基團之間能夠進行能量轉移。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其中，所述雙鏈核酸的長度為22、23、24、25、26、27、28、29或30個堿基對。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其中，所述雙鏈核酸的長度為7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或 21 個堿基對。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，其中，所述雙鏈核酸的長度為9、10、11、12、13、14或15個堿基對。
5.根據權利要求3所述的檢測方法，其中，所述雙鏈核酸的長度為7、8、9、10、11或12個堿基對。
6.根據權利要求1-5中任意一項所述的檢測方法，其中，所述雙鏈核酸的第一單鏈和第二單鏈完全互補，所述第一單鏈的堿基序列為5’ -AUGAGCCUGAUUU、5’ -AUGAGCCUAAUUU、5，-GGCUGCU、5，_GAAUGAGCU、5，_GAGUCAGCUAATCUU、5，-UGGUAUGAGCCUGAUUUUGAU 或 5，-AGCUGGUGGUACAGAUGAUCUUGCAUCGUC。
7.根據權利要求1-5中任意一項所述的檢測方法，其中，所述雙鏈核酸的第一單鏈和第二單鏈完全互補，所述第一單鏈的堿基序列為5’ -AUGAGCCUGAUUU。
8.根據權利要求1-7中任意一項所述的檢測方法，其中，所述雙鏈核酸中含有至少一個脫氧核糖核苷酸基團。
9.根據權利要求1-8中任意一項所述的檢測方法，其中，所述雙鏈核酸中含有至少一個修飾的核苷酸基團。
10.根據權利要求9所述的檢測方法，其中，所述修飾的核苷酸基團為磷酸基團、核糖基團和堿基中的至少一種被修飾的核苷酸基團。
11.根據權利要求10所述的檢測方法，其中，核糖基團被修飾的核苷酸基團為核糖基團的2’ -羥基被甲氧基或氟取代的核苷酸基團。
12.根據權利要求1-11中任意一項所述的檢測方法，其中，所述能量供體基團和所述能量受體基團位于同一條核酸單鏈上。
13.根據權利要求1-11中任意一項所述的檢測方法，其中，所述能量供體基團和所述能量受體基團位于不同核酸單鏈上。
14.根據權利要求1-13中任意一項所述的檢測方法，其中，所述能量供體基團為熒光供體基團，所述能量受體基團為熒光受體基團。
15.根據權利要求14所述的檢測方法，其中，所述熒光供體基團為選自6-羧基熒光素基團、5-四氯熒光素基團、5-六氯熒光素基團、6-羧基-X-羅丹明基團、N, N'-對羧芐基吲哚三菁基團和6-羧基四甲基羅丹明基團中的至少一種。
16.根據權利要求14所述的檢測方法，其中，所述熒光受體基團為選自4-(4’_二甲基對氨基偶氮苯)苯甲酸基團、N，N'-雙甲基-N，N'-聯苯-4-(5-叔丁氧羰基戊胺)-哌啶砜基羅丹明基團、4'，5' -二硝基熒光素基團、氨基哌啶酸基團、4-(4-硝化苯嗪基)苯胺基團和4-(4-硝化苯嗪基)萘胺基團中的至少一種。
17.權利要求1-16中任意一項所述的檢測方法在腫瘤檢測中的應用。
18.根據權利要求17所述的應用，其中，所述腫瘤為胃癌、結腸癌或肺癌。
19.根據權利要求17或18所述的應用，其中，受試者體液樣本中的核糖核酸酶的含量比來自于健康對照個體的體液樣本中的核糖核酸酶的含量低。
20.根據權利要求19所述的應用，其中，受試者體液樣本中的核糖核酸酶的含量比來自于健康對照個體的體液樣本中的核糖核酸酶的含量低30%以上。
21.根據權利要求19所述的應用，其中，受試者體液樣本中的核糖核酸酶的含量比來自于健康對照個體的體液樣本中的核糖核酸酶的含量低50%以上。
22.根據權利要求19所述的應用，其中，受試者體液樣本中的核糖核酸酶的含量比來自于健康對照個體的體液樣本中的核糖核酸酶的含量低70%以上。
23.一種腫瘤檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有權利要求1-16中任意一項所述的雙鏈核酸。
24.權利要求23所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還含有核糖核酸酶標準品。
全文摘要
本發明提供一種核糖核酸酶的檢測方法，該方法包括以下步驟1)從受試者個體中獲得體液樣本；2)使所述體液樣本與雙鏈核酸接觸，使得所述雙鏈核酸能夠被所述體液樣本中可能存在的核糖核酸酶切割；3)檢測步驟2)中的接觸后的產物，從而檢測所述體液樣本中核糖核酸酶的含量。此外，本發明還提供了該檢測方法的應用和腫瘤檢測試劑盒。利用本發明所提供的核糖核酸酶檢測底物和檢測方法，能夠靈敏、準確地檢測來源于不同腫瘤患者血清核糖核酸酶的活性及含量，不僅操作簡便，而且大大降低了檢測費用，對于多種疾病的早期檢測、療效評價、人群普查等大規模應用均具較高的使用價值。
文檔編號C12Q1/68GK103014132SQ201110280179
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月20日 優先權日2011年9月20日
發明者不公告發明人 申請人:蘇州瑞博生物技術有限公司