專利名稱：一種分離戊糖片球菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離戊糖片球菌的方法，尤其是一種適應于從動物胃腸道中分離戊糖片球菌的方法。
背景技術：
片球菌屬拉丁學名為Pediococcus Claussen，細胞呈球形且永不延長，直徑為 1. 2-2. 0微米；在適宜條件下，分裂以直二個方向形成四聯，單個細胞罕見，不形成鏈狀；革蘭氏染色陽性；不運動，不產芽孢；兼性厭氧，有的菌株在有氧時會抑制生長；最適生長溫度為 25-40°C。戊糖片球菌(/^i/iococc^s /^/^osace^s)是片球菌中的一種，菌落圓形、乳白色、 光滑、凸起、邊緣整齊、不透明、革蘭氏染色陽性。中國農業部已經批準戊糖片球菌可以作為飼料添加劑中的微生物菌種用于飼料和養殖業中。一般用于分離戊糖片球菌的方法為倒平板法，將固體培養基滅菌后倒入平皿中，冷卻后將含有戊糖片球菌的樣品稀釋液涂抹在培養基表面上，然后置于常規生化培養箱中培養。由于戊糖片球菌屬于兼性厭氧菌，氧氣太多的情況下會抑制戊糖片球菌的生長，因此，該方法可能降低戊糖片球菌的分離機率，此外， 該方法分離過程中，其它非戊糖片球菌一樣也可以在培養基上生長，從而增加了后續鑒定工作的工作量。

發明內容
本發明的目的是在于提供了一種分離戊糖片球菌的方法，方法易行，操作簡便，將所要分離的樣品稀釋液和3毫升培養基混合后，倒入平皿中，待凝固后，再倒入25毫升培養基，人為形成一個厭氧環境，分離出的細菌克隆中為戊糖片球菌的幾率為100%，該方法更準確，并顯著減少工作量。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施 一種分離戊糖片球菌的方法，其步驟是
A、將配制的MRS固體培養基調節pH6. 0-6. 6后，置于滅菌鍋115 °C滅菌13-18分鐘，自然冷卻到40-45 0C0B、將待分離的樣品用無菌雙蒸水以體積比1:10混合，渦旋一分鐘后靜置4-6分鐘。C、移取上清1毫升進行10倍倍比稀釋，然后分別取10-3、10_4、10-5三個稀釋度各 100微升樣品，分別和3毫升上述制備的液態MRS固體培養基混合后，加入不同的玻璃平皿 (直徑80毫米)中，輕輕搖動培養皿，使培養基和樣品混合物均勻分布在培養皿底部；
D、待混合物其凝固后，再加入25毫升左右液態MRS固體培養基，凝固后置于生化培養箱中29-31°C恒溫培養46-50小時。最后，戊糖片球菌將在培養皿底部被分離出來。為從樣品中更準確的篩選出戊糖片球菌(Fediococcus pen tosaceus )，發明了一種分離戊糖片球菌的方法，運用該方法成功分離得到了戊糖片球菌。
所述MRS固體培養基為 組成成份重量份牛肉蛋白粉 8-12 魚肉汁 8-12 酵母浸出汁粉 3-7 葡萄糖18-22
醋酸鈉3-7
檸檬酸二銨1-3
吐溫 800. 08- 0. 2
硫酸鎂0. 48- 0. 68 硫酸錳0. 18- 0. 38 瓊脂粉13-17 蒸溜水800-1200。該方法無需厭氧培養相關器皿，也不需要二氧化碳培養箱。通過將培養基置于樣品之上，構建一個適合戊糖片球菌生長的兼性厭氧環境，為戊糖片球菌的分離找到一種簡單、方便的方法。分離出的細菌克隆中為戊糖片球菌的幾率為100%，該方法更準確，并顯著減少了工作量。


圖1為一種分離戊糖片球菌的方法流程示意圖。
具體實施例方式實施例1
以下實施例用于說明本發明，但不用于限制本發明的范圍。下面結合附圖對本發明作進一步詳細描述 一種分離戊糖片球菌的方法，其步驟是
A、MRS固體培養基配制培養基配方為(重量份):牛肉蛋白粉10、魚肉汁10、酵母浸出汁粉5、葡萄糖20、醋酸鈉5、檸檬酸二銨2、硫酸鎂0. 58、硫酸錳0.觀、瓊脂粉15，加1毫升吐溫80，溶解于蒸溜水1000中，調節pH值為6或6. 2或6. 3或6. 4或6. 6后，置于滅菌鍋 115 °C滅菌13或14或15或16或17分鐘，自然冷卻到40或42或43或44或45 °C。B、樣品準備取1毫升豬腸道食糜，用無菌雙蒸水以體積比1:10混合，渦旋1分鐘后靜置3或4或5或6或7分鐘。C、MRS培養基與樣品混合移取上清1毫升進行10倍倍比稀釋，然后分別取10_4、 10_3、IO-5三個稀釋度各100微升樣品，分別和3毫升上述制備的液態MRS固體培養基(培養基溫度為40-45 V )混合后，加入不同的玻璃平皿(直徑80毫米)中，輕輕搖動培養皿，使培養基和樣品混合物均勻分布在培養皿底部；
D、分離培養待混合物凝固后，再加入25毫升左右液態MRS固體培養基(培養基溫度為40-45 0C )覆蓋在MRS培養基與樣品的混合物之上，凝固后，用封口膜將平皿密封，倒置于生化培養箱中四或30或31°C恒溫培養46或47或48或49或50小時，在培養皿底部，出現乳白色、圓形、光滑、凸起、邊緣整齊、不透明的菌落，初步判斷為戊糖片球菌，再通過 16S rDNA測序方法對生長出來的菌落克隆進行16S rDNA測序，然后在NCBI數據庫中運用 BLASTN軟件進行序列比對，對所分離的戊糖片球菌細菌進行進一步的確認。
用該方法分離戊糖片球菌，無需厭氧培養相關器皿，也不需要二氧化碳培養箱。通過將培養基置于樣品之上，構建一個適合戊糖片球菌生長的兼性厭氧環境，為戊糖片球菌的分離找到一種簡單、方便的方法。分離出的細菌克隆中為戊糖片球菌的幾率為100%，該方法更準確，并顯著減少工作量。目前還沒有專門針對戊糖片球菌的分離方法，戊糖片球菌的分離一般依照乳酸桿菌分離方法進行分離鑒定，因此，該方法對戊糖片球菌的分離具有重要的指導意義和現實需求。
權利要求
1.一種分離戊糖片球菌的方法，其步驟是A、將配制的MRS固體培養基調節pH6.0-6. 6后，置于滅菌鍋115 °C滅菌13-18分鐘，自然冷卻到40-45 V ；B、將待分離的樣品用無菌雙蒸水以體積比1 10混合，渦旋一分鐘后靜置4-6分鐘；C、移取上清1毫升進行10倍倍比稀釋，然后分別取10-3、10_4、10-5三個稀釋度各100微升樣品，分別和3毫升上述制備的液態MRS固體培養基混合后，加入不同的玻璃平皿中，搖動培養皿，使培養基和樣品混合物均勻分布在培養皿底部；D、待混合物其凝固后，再加入25毫升液態MRS固體培養基，凝固后置于生化培養箱中恒溫培養46-50小時，戊糖片球菌將在培養皿底部被分離出來。
2.根據權利要求1所述的一種分離戊糖片球菌的方法，其特征在于所述的MRS固體培養基為牛肉蛋白粉8-12克魚肉汁 8-12克酵母浸出汁粉3-7克葡萄糖18-22克醋酸鈉3-7克檸檬酸二銨 1-3克吐溫 80 0. 08-0. 2 克硫酸鎂0. 48- 0. 68克硫酸錳0. 18- 0. 38克瓊脂粉13-17克蒸溜水800-1200克。
全文摘要
本發明公開了一種分離戊糖片球菌的方法，其步驟是A、將配制的MRS固體培養基調節pH后，置于滅菌鍋滅菌，自然冷卻；B、將待分離的樣品用無菌雙蒸水混合，渦旋后靜置；C、移取上清進行稀釋，分別取10-3、10-4、10-5三個稀釋，分別和制備的液態MRS固體培養基混合后，加入玻璃平皿中，搖動培養皿，使培養基和樣品混合物分布在培養皿底部；D、凝固后，再加入MRS固體培養基，凝固后置于生化培養箱中培養，戊糖片球菌將在培養皿底部被分離出來。方法易行，操作簡便，將所要分離的樣品稀釋液后，倒入平皿中，待凝固后，再倒入培養基，形成一個厭氧環境，分離出的細菌克隆中為戊糖片球菌的幾率為100%，該方法更準確，并顯著減少工作量。
文檔編號C12N1/02GK102329750SQ20111028161
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月21日 優先權日2011年9月21日
發明者印遇龍, 姚康, 李麗立, 李鳳娜, 李鐵軍, 王升平, 黃瑞林 申請人:中國科學院亞熱帶農業生態研究所