專利名稱：一種耐高溫木聚糖酶的高產菌株及利用該菌發酵產耐高溫木聚糖酶的方法及得到的酶的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術與工程領域，尤其是一種耐高溫木聚糖酶的高產菌株及利用該菌發酵產耐高溫木聚糖酶的方法及得到的酶。
背景技術：
木聚糖酶(1，4_β-D-xylanase ;EC3. 2. 1.8)是一種重要的工業用酶，在造紙工業、食品、能源、飼料以及環境等領域中顯示了廣闊的應用前景，特別是在紙漿生物漂白中的巨大應用潛力早已引起各界的高度關注。木聚糖酶處理各種漿料的作用是降解漿料中的木聚糖，使漿料中半纖維素的含量降低，并使纖維素細胞壁結構變得松弛，同時使與漿中殘余木素連接的半纖維素降解，形成脫木素或有利于脫木素的狀態。通過木聚糖酶的預處理， 不僅可以提高紙漿的白度，降低打漿的能耗，改善漿料的強度性能，而且，可以減少后繼工序漂劑的用量，降低廢液的毒性，減輕環境污染。目前，以無元素氯和全無氯漂白工藝為代表的紙漿綠色清潔漂白已經成為世界各國造紙業紙漿漂白發展的必然趨勢，木聚糖酶酶法助漂新工藝已在歐洲和北美的30余家大型紙廠得到應用，成為生物技術在造紙工業應用最成功的一例。其中，加拿大已有約10 % 的硫酸鹽法紙漿廠采用了該項新工藝。丹麥諾維信公司和美國山道斯化學公司等多家酶制劑廠商，紛紛推出了專門用于紙漿處理的木聚糖酶和纖維素酶新產品，但到目前為止，工業上用于紙漿漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最適反應溫度大多在50°C左右，眾所周知， 紙漿蒸煮和漂白基本都是在高溫和強堿的條件下進行的，使得現有的低溫酸性木聚糖酶產品在此領域的應用受到了極大的限制，另外，在飼料和食品領域，木聚糖酶應用在飼料的造粒和食品的焙烤工序中，仍然要求所用的木聚糖酶在高溫條件下能夠保持較高的酶活，因此，研究開發耐高溫的木聚糖酶產品將會帶來良好的經濟效益和社會效益。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種在高溫下有良好的穩定性，適合造紙、食品和飼料等多個工業領域的應用的耐高溫木聚糖酶的高產菌株，以及利用該菌發酵產高溫木聚糖酶的方法。本發明實現目的的技術方案如下一種耐高溫木聚糖酶的高產菌株，分類命名為坎皮納斯類芽孢桿菌 Gl-IPaenibacillus campinasensis G1-1，菌種保藏號CGMCC No. 5023，保藏日期2011 年 7月1日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。—種耐高溫木聚糖酶的高產菌株發酵產耐高溫木聚糖酶的方法，按3%的接種量將該菌的液體種子接種于發酵產酶培養基中，37°C，ISOrpm搖瓶培養4 獲得含耐高溫木聚糖酶的發酵液；
所述發酵產酶培養基的成分為wt % =NaNO3O. 5，K2HPO4O. 3、MgSO4 · 7H20 0. 03、 MnSO4 · H2O 0. 002、FeSO4 · 7H20 0. 002、CaCl2 · 2H20 0. 002、樺木木聚糖 0. 5，ρΗ7· 0。而且，該耐高溫木聚糖酶分離步驟如下(1)發酵液4°C下、8000rpm、離心lOmin，取上清液；(2)向發酵上清液中緩慢加入硫酸銨，使硫酸銨飽和度達到70%，4°C鹽析過夜；(3)將鹽析過夜的發酵上清液4°C下、8000rpm、離心lOmin，取沉淀，用pH7. O的 PBS緩沖液溶解沉淀，得到耐高溫木聚糖酶粗酶液，備用；(4) Octyl Sepharose Fast Flow疏水相互作用層析將粗酶液硫酸銨飽和度調到 40%，進行疏水相互作用層析，柱型φ2.6χ 18cm;平衡液含40%飽和度硫酸銨的0. 02mol/ L PBS緩沖液(ρΗ7. 0)；流速2mL/min，上樣后用飽和度為40% 0%的硫酸銨線性洗脫，收集活性組分，待下一步分離用；(5) Sephadex G-75 凝膠過濾層析柱型(pl.6><50cm;平衡液0. 02mol/L PBS 緩沖液(pH8.0)；流速0. 5mL/min。收集活性組分，待下一步分離用；(6) Q-Sepherose 強陽離子交換層析柱型φ2.6><IOcm;平衡液0. 02mol/L PBS 緩沖液(pH8. 0)；流速2mL/min，上樣后用含0 1. OM NaCl的平衡緩沖液進行線性洗脫，收集活性組分，備用；(7)將上一步得到的耐高溫木聚糖酶樣品進行透析除鹽，然后冷凍抽干，得到耐高溫木聚糖酶干粉。一種耐高溫木聚糖酶，由權利要求2或3所述得到的耐高溫木聚糖純酶。而且，所述耐高溫木聚糖酶的相對分子量為41. 3KDa。而且，所述耐高溫木聚糖酶的最適作用溫度為60°C。而且，所述耐高溫木聚糖酶的最適作用pH7. 0。本發明的優點和積極效果如下1、本發明提供了一種耐高溫木聚糖酶的高產菌株，經菌種鑒定后，命名為坎皮納斯類芽孢桿菌Gl-I，并對純化后的木聚糖酶進行了酶學性質研究，發現該酶相對分子量為 41. 3KDa，最適作用溫度及pH分別為60°C和7. 0 ；在40°C 70°C和pH 5. 0 9. 0范圍內酶活保持相對穩定。2、本發明的木聚糖酶在高溫下有良好的穩定性，適合造紙、食品和飼料等多個工業領域的應用，具有廣闊的應用前景。


圖1本發明產木聚糖酶菌種初篩平板；圖2本發明篩選到的P. campinasensis Gl-I和與其16s rRNA序列最相近的12 個菌種構建的系統進化樹；圖3本發明中P. campinasensis Gl-I的生長及產酶曲線；圖4本發明中木聚糖酶的SDS-PAGE圖(a)及其酶譜圖(b)其中a :1、蛋白Marker，2、發酵上清液，3、Octyl-Sepharose疏水相互作用層析后酶液，4、分離純化后酶液，b :1、發酵上清液，2、分離純化后酶液；圖5本發明的耐高溫木聚糖酶最適作用溫度；
圖6本發明的耐高溫木聚糖酶的溫度穩定性；圖7本發明的耐高溫木聚糖酶最適作用pH ；圖8本發明的耐高溫木聚糖酶pH穩定性。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明的技術內容做進一步說明；下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。本發明提供的產耐高溫木聚糖酶的菌種是從天津廣聚源造紙廠的棉桿堆料中分離得到的，通過考察其形態特征、生理生化特征和16s rRNA序列特征，將其鑒定為坎皮納斯類芽孢桿菌(Paenikicillus campinasensis)，命名為G1-1，保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號為CGMCC NO. 5023。一、菌種形態、生理生化特征及16s rRNA序列比對結果本菌種細胞呈桿狀，有芽孢，革蘭氏陽性，屬好氧菌，在瓊脂平板上形成白色不透明、表面干燥的圓形菌落。其生理生化特征見表1。根據其16s rRNA序列比對，選出與其序列最相近的12株已知菌種，構建系統進化樹，進一步確定了其進化地位。表 1 Paenibacillus campinasensis Gl-I 的生理生化特征
權利要求
1.一種耐高溫木聚糖酶的高產菌株，其特征在于分類命名為坎皮納斯類芽孢桿菌 Gl-IPaenibacillus campinasensis G1-1，菌種保藏號=CGMCC No. 5023，保藏日期2011 年 7月1日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
2.一種利用如權利要求1所述的耐高溫木聚糖酶的高產菌株發酵產耐高溫木聚糖酶的方法，其特征在于按3%的接種量將該菌的液體種子接種于發酵產酶培養基中，37°C， ISOrpm搖瓶培養4 獲得含耐高溫木聚糖酶的發酵液；所述發酵產酶培養基的成分為 wt% =NaNO3O. 5,K2HPO4O. 3、MgS04 ·7Η20 0. 03,MnSO4 ·Η20 0. 002、FeSO4 · 7Η20 0. 002、CaCl2 · 2Η20 0. 002、樺木木聚糖 0· 5，ρΗ7· 0。
3.根據權利要求2所述方法得到的耐高溫木聚糖酶的分離純化，其特征在于該耐高溫木聚糖酶分離步驟如下(1)發酵液4°C下、8000rpm、離心lOmin，取上清液；(2)向發酵上清液中緩慢加入硫酸銨，使硫酸銨飽和度達到70%，4°C鹽析過夜；(3)將鹽析過夜的發酵上清液4°C下、8000rpm、離心lOmin，取沉淀，用pH7.0的PBS緩沖液溶解沉淀，得到耐高溫木聚糖酶粗酶液，備用；(4)OctylSepharose Fast Flow疏水相互作用層析將粗酶液硫酸銨飽和度調到 40%，進行疏水相互作用層析，柱型φ2.6χ 18cm;平衡液含40%飽和度硫酸銨的0. 02mol/ L PBS緩沖液(pH7. 0)；流速2mL/min，上樣后用飽和度為40% 0%的硫酸銨線性洗脫，收集活性組分，待下一步分離用；(5)Sephadex G-75凝膠過濾層析柱型:(pl.6><50cm;平衡液:0. 02mol/L PBS緩沖液 (pH8. 0)；流速0. 5mL/min。收集活性組分，待下一步分離用；(6)Q-Sepherose強陽離子交換層析柱型φ2.6χ 10cm;平衡液0. 02mol/L PBS緩沖液 (PH8.0)；流速2mL/min，上樣后用含0 1.0M NaCl的平衡緩沖液進行線性洗脫，收集活性組分，備用；(7)將上一步得到的耐高溫木聚糖酶樣品進行透析除鹽，然后冷凍抽干，得到耐高溫木聚糖酶干粉。
4.一種耐高溫木聚糖酶，其特征在于由權利要求2或3所述得到的耐高溫木聚糖純酶。
5.根據權利要求4所述的耐高溫木聚糖酶，其特征在于所述耐高溫木聚糖酶的相對分子量為41. 3KDa。
6.根據權利要求4所述的耐高溫木聚糖酶，其特征在于所述耐高溫木聚糖酶的最適作用溫度為60°C。
7.根據權利要求4所述的耐高溫木聚糖酶，其特征在于所述耐高溫木聚糖酶的最適作用pH7. 0。
全文摘要
本發明公開了一種耐高溫木聚糖酶的高產菌株及利用該菌株發酵產耐高溫木聚糖酶的方法，并闡述了該酶的部分酶學性質。經菌種鑒定，將該菌命名為坎皮納斯類芽孢桿菌G1-1(Paenibacillus campinasensis G1-1)，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號為CGMCC No.5023。該菌種發酵得到的耐高溫木聚糖酶，經分離純化得到單一組分，其相對分子量為41.3KDa，最適作用溫度及pH分別為60℃和7.0；在40℃～70℃和pH 5.0～9.0范圍內酶活保持相對穩定。本坎皮納斯類芽孢桿菌木聚糖酶適合造紙、食品和飼料等多個工業領域的應用，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N9/42GK102321558SQ201110282029
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月22日 優先權日2011年9月22日
發明者劉逸寒, 王建玲, 王春霞, 路福平, 鄭宏臣 申請人:天津科技大學