專利名稱：一種人類主要組織相容性復合體ⅰ類分子相關基因a基因測序分型方法及試劑盒的制作方法
一種人類主要組織相容性復合體丨類分子相關基因A基因測序分型方法及試劑盒
技術領域：
本發明涉及測序分型方法，特別是涉及人類主要組織相容性復合體I類分子相關基因A(major histocompatibility complex class I chain related gene A,MICA)的測序分型方法。
背景技術：
人類主要組織相容性復合體I類分子相關基因A基因(MICA基因)位于人第6號染色體的短臂HLA-III類基因區，屬于非經典HLA-I類基因家族的功能基因。 MICA基因全長11722bp(NM_000247)，編碼1382bp的轉錄物。整個基因包括6 ^
外顯子(外顯子1 6)，外顯子1編碼L前導肽，外顯子2 構域，外顯子5編碼跨膜(TM)區，外顯子6編碼胞質區。
表1 MICA基因各外顯子及內含子長度
4分別編碼細胞外α 1 3結
權利要求
1.一種人類主要組織相容性復合體I類分子相關基因A基因測序分型的方法，其特征在于，所述測序為雙向測序，并還可以包括第1和第6外顯子的測序。
2.權利要求1所述的方法，其步驟為提取樣品基因組DNA;設計PCR引物對樣品進行基因組DNA的PCR擴增；設計測序引物對所獲得的PCR擴增產物進行雙向測序，分別對其中第1、2、3、4、5、6外顯子進行正、反向雙向測序；或者先對第2至第5外顯子基因序列測序，根據結果再決定對第1至第6外顯子測序；根據測序結果進行分型。
3.權利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴增中用到了三對PCR擴增引物，其中第一對PCR擴增引物為第1外顯子PCR擴增引物，其上游引物位于人類主要組織相容性復合體I類分子相關基因A基因的5'-啟動子區域，包含了部分5’-啟動子區，下游引物位于人類主要組織相容性復合體I類分子相關基因A基因的第1內含子區域；第二對PCR擴增引物為第2至第5外顯子的PCR擴增引物，其上游引物位于第1內含區域，下游引物位于第5內含子區域；第三對PCR擴增引物為第6外顯子的PCR擴增引物，其上游引物位于第5內含子區域， 下游引物位于3'-非翻譯區UTR。
4.權利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR擴增中用到的引物序列分別為擴增第一外顯子的上游引物MICA-PCR-1-F1和下游引物MICA-PCR-1-R1，具體序列為SEQID NO :1 禾口 SEQ ID NO 2 ；擴增第2至第5外顯子的上游引物MICA-PCR-2345-F10和下游引物 MICA-PCR-2345-R10，具體序列為:SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 ；擴增第6外顯子的上游引物MICA-PCR-6-F4和下游引物MICA-PCR-6-R4，，具體序列為 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO :6。
5.權利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR擴增反應體系為基因組 DNA IOOng1 μ .10 χ Pfu Buffer2. 5 μ dNTP (2. 5mM)2. 5 μ PCR 正向引物(10 μΜ)0. 5μ PCR 反向引物(10 μΜ)0. 5μΙ PfuUltra fusion HS DNA polymerase (5 /μΟ 0. 5μΙ加 ddH20 至25 μ 或所述PCR擴增反應體系為
6.權利要求4或5任一所述的方法，其特征在于第1外顯子的PCR擴增片斷長度為 47^p，第2至第5外顯子的PCR擴增片斷長度為2M9bp，第6外顯子的PCR擴增片斷長為 570bp。
7.權利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR測序擴增中用到的測序引物包括 第一外顯子正向測序引物MICA-Seq-1-F，其序列為SEQ ID NO :7，反向測序引物MICA-kq-1-R，其序列為SEQ ID NO 8 ；第二外顯子正向測序引物MICA-Seq-2-F，其序列為SEQ ID NO :9，反向測序引物 MICA-kq-2-R，其序列為:SEQ ID NO 10 ；第三外顯子正向測序引物MICA-Seq-3-F,其序列為SEQID NO 11，反向測序引物 MICA-kq-3-R，其序列為:SEQ ID NO 12 ；第四外顯子正向測序引物MICA-Seq-4-F，其序列為SEQ ID NO:13，反向測序引物 MICA-Seq-4-R，其序列為:SEQ ID NO :714 ；第五外顯子反向測序引物MICA-Seq-5-R，其序列為SEQ ID NO:15，反向測序引物 MICA-kq-5-R，其序列為:SEQ ID NO 16 ；第六外顯子正向測序引物MICA-Seq-6-F，其序列為SEQ ID NO:17。反向測序引物 MICA-kq-6-R，其序列為SEQ ID NO :18。
8.權利要求7所述的方法，其特征在于所述測序反應體系為
9.具有SEQID NO :1至SEQ ID NO :18任一項所示序列的核甘酸。
10.一種用于權利要求1所述方法的試劑盒，包括SEQ ID NO :1和SEQ ID Ν0:2，和或 SEQ ID NO :3 禾口 SEQ ID NO :4，和或 SEQ ID NO :5 禾口 SEQ ID NO :6 的序列，以及一種或多種選自SEQ ID NO :7至SEQ ID NO 18的測序引物。
全文摘要
本發明涉及一種人類主要組織相容性復合體I類分子相關基因A基因測序分型方法及試劑盒，本發明的具體方法為提取樣品基因組DNA；設計PCR引物對樣品進行基因組DNA的PCR擴增；設計測序引物對所獲得的PCR擴增產物進行雙向測序，分別對其中第1、2、3、4、5、6外顯子進行正、反向雙向測序；根據測序結果進行分型。該方法可以解決目前MICA基因進口商品化測序試劑盒僅有單向測序試劑盒，避免單向測序堿基信號強度不一致及不能清晰反應突變存在的缺點，解決MICA模棱兩可基因分型結果，獲得第1和第6外顯子堿基序列。
文檔編號C12N15/11GK102352409SQ20111028242
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月21日 優先權日2011年9月21日
發明者徐筱娉, 楊寶成, 鄧志輝, 高素青 申請人:深圳市血液中心