專利名稱：用于篩查多發畸形綜合征的組合探針的制作方法
用于篩查多發畸形綜合征的組合探針技術領域
本發明屬生物技術領域，涉及篩查多發畸形綜合征的探針，尤其涉及用于篩查多發畸形綜合征的多重連續探針擴增的組合探針。該探針可用于多發畸形綜合征初步篩查。
背景技術：
先天畸形(congenital malformation, CA)是指出生時即存在的形態或結構上的異常；包括單發畸形(如唇裂、多指等)和多發畸形(multiple congenital malformation, MCA)。研究發現，有多種多發畸形是在某一原因作用下特異地組合而產生，成為畸形綜合征。目前，醫學上已經識別診斷的畸形綜合征已達250余種；但由于多發畸形綜合癥表型存在明顯的特異性和不均衡性，僅依靠臨床達到準確診斷較為困難。
隨著對于MCA遺傳學病因的分子遺傳學檢測技術不斷發展；70年代，染色體G帶技術發現了顯微鏡下可見的染色體異常如缺失、重復、易位和倒置，但是傳統光學顯微鏡對于染色體結構異常的最大分辨率在5-10Mb，高分辨率顯帶技術也就在3-5Mb，故而其診斷率仍小于5%。
目前，醫學上通常采用檢測基因組拷貝數變異的方法診斷上述綜合征；該方法存在以下缺陷核型分析僅可以檢測到大于5Mb的重復/缺失；定量PCR，通量低，不適于多位點的篩查檢測；Array平臺的芯片檢測，成本明顯高于MLPA，不適用于大樣本量的篩查。
2004年兩個研究小組在Nature和Science幾乎同時發表論文,報道了人體內拷貝數變異(Copy number variations, CNVs)現象的存在,并因其在整個基因組中覆蓋的核苷酸總數遠遠超過SNP的總數，受到廣泛重視。所述CNVs廣泛的存在人類基因組，拷貝數的變化將影響一個較寬區域的基因組序列和很多可能基因的變化，故而CNVs在研究人類遺傳性疾病方面的巨大潛力。目前，有研究正在深入探討人類基因組CNVs變異情況與疾病的關系，大量研究表明，精神性疾病、神經性疾病、先天性疾病等存在CNV的異常。所述的CNVs 主要指介于Ikb和3Mb的DNA片段多態性，處于顯微鏡和高分辨率觀測范圍之間，屬于亞微觀范疇，目前檢測的技術方法較多，如熒光定量PCR、MLPA及以微陣列平臺為基礎的全基因組分析技術，其診斷率達到15%。
有關用于篩查多發畸形綜合征的多重連續探針擴增的探針的研制已引起本領域研究人員的關注。發明內容
本發明的目的是提供篩查多發畸形綜合征的探針，尤其涉及用于篩查多發畸形綜合征的多重連續探針擴增的組合探針。
本發明所述的探針能對發病率相對較高、病因為染色體結構重復或缺失、臨床變現為多發畸形的13個常見多發畸形綜合征進行早期篩查。所述的多發畸形綜合征包括， 1ρ36缺失綜合征、Sotos綜合征、18三體綜合征、CHARGE綜合征、Williams Beuren綜合征、 22qll缺失/重復綜合征、21三體綜合征、Smith Magenis綜合征、13三體綜合征、Cri duChat綜合征、Prader Willi綜合征、Wolf Hirschhorn綜合征和17q21. 31缺失綜合征。
具體而言，本發明的用于篩查多發畸形綜合征的多重連續探針擴增的組合探針， 其特征在于，其包括1ρ36缺失綜合征、Sotos綜合征、18三體綜合征、CHARGE綜合征、 Williams Beuren綜合征、22qll缺失/重復綜合征、21三體綜合征、Smith Magenis綜合征、13三體綜合征、Cri du Chat綜合征、Prader Willi綜合征、Wolf Hirschhorn綜合征和 17q21. 31缺失綜合征的關鍵基因或關鍵區域內的基因、或重復/缺失片段內兩端的基因， 以及滿足相應條件的探針序列和弓I物序列，和磷酸化標記。
本發明的組合探針可用于上述13個常見的發病率較高的多發畸形綜合征的早期篩查。
本發明中，所述的基因為病率相對較高、病因為染色體結構重復或缺失、臨床變現為多發畸形的綜合征及選擇的目的基因，為
(I) 1ρ36 缺失綜合征GABRD、SK1、TP73 ；
(2) Sotos 綜合征NSD1 ；
(3) 18 三體綜合征MC2R、DTNA, TCF4 ；
(4) CHARGE 綜合征CHD7 ；
(5) Williams Beuren 綜合征:CLIP2、ELN、UMKl ；
(6)22qll 缺失 / 重復綜合征SNAP29、TBXl、ZNF74 ；
(7) 21 三體綜合征KCNJ6、DYRK1A、RCANl ；
(8) Smith Magenis 綜合征RA1、MFAP4 ;
(9) 13 三體綜合征EDNRB、CENPJ、ERCC5、FREM2 ；
(IO)Cri du Chat 綜合征CTNND2、TERT ;
(Il)Prader Willi 綜合征0CA2、UBE3A、GABRB3 ；
(12) Wolf Hirschhorn 綜合征MSX1、WHSCl、LETMl ；
(13) 17q21. 31 缺失綜合征MAP3K14、MAPT。
本發明中，所述的探針采用化學方法合成。
本發明中，所選擇的目的基因序列在http://Renome. ucsc. edu/CR1-bin/hRBlat 獲得，并區別標記編碼區、SNP及重復序列。
本發明所述的組合探針均由左半序列和右半序列組成，左半序列5’端至3’端依次為左通用引物序列、左半探針序列；右半序列5’端至3’端依次為憐酸標記、右半探針序列、右通用引物序列；所述左、右探針序列與靶序列相同，并可在連接酶的作用下直接相連。
本發明中，所述的左、右序列滿足如下條件
(I)序列長度唯一性；
(2) GC含量在50 %左右；
(3) Tm 值彡 70 °C;
(4)在連接位點不含SNP ；
(5)無二級結構；
(6)在人類基因組內無相同重復序列；
(7)序列加通用引物，磷酸標記。
本發明中，所述序列的GC含量檢測、Tm值檢測采用Raw Probe軟件；二級結構的檢測http://mfold. rna. albany. edu在線進行:在人類基因組內是否為特異性序列，http:// genome, uses, edu/cg1-bin/hgBlat 在線進行檢測。
本發明中，所述的序列由SIGMA公司化學合成。
本發明合成后的序列，單個分裝，粉末試劑；按照每個序列所標記的nmol值，加TE 稀釋至100 μ M濃度儲存，取出10 μ I儲存液，加去離子滅菌水稀釋至I μ M作為工作液；將所有序列混合，加去離子滅菌水最終稀釋至lfmol/μ 1，制成工作濃度的探針混合液；
所述的探針混合液，用于多重連續探針擴增技術。
本發明中，所述試劑采用MRC公司的Ρ200探針空白試劑盒，操作步驟
1)DNA變性標記O. 2ml Eppendorf管或8聯管；加入5 μ I DNA，其中DNA總量在 150-200ng ;放入PCR儀，啟動MLPA程序98°C 5分鐘，使DNA樣本變性，冷卻至25°C，取出；
2)雜交反應制備雜交混合液，每個反應包括1. 5μ I的MLPA緩沖液(黃色)+1. 5 μ I探針(黑色)，充分混勻。在PCR儀到達25°C時，每管加3 μ I雜交混合液，混勻；繼續MLPA程序95°C I分鐘，后60°C雜交16-20小時。
3)連接反應制備連接混合液，每個反應包括3 μ I連接酶-65緩沖液A(透明色)+3 μ I連接酶-65緩沖液B (白色)+25 μ I去離子水，充分混勻；每個反應加I μ I連接酶-65(綠色)，輕柔混勻；繼續MLPA程序，在54 °C暫停；在PCR儀到達54°C時，每管加32 μ I 連接混合液，混勻；繼續MLPA程序54°C 15分鐘(連接)，98°C 5分鐘使連接酶失活，后在 15°C暫停；
4)PCR反應標記新的PCR 8聯管；制備PCR緩沖混合液，每個反應包括4 μ I SALSAPCR緩沖液(紅色)+26 μ I去離子水，充分混勻；在新的8聯管中，每管加入30 μ I PCR 緩沖混合液；于室溫下，將10 μ I連接產物加入相應的新8聯管中；制備聚合 酶混合液，每個反應包括2 μ I SALSA PCR引物(棕色)+2 μ I SALSA酶緩沖液(藍色)+5. 5 μ I去離子水+0. 5 μ I SALSA聚合酶(橘紅色)，輕柔混勻，使用前4°C保存。繼續MLPA程序，在60°C 暫停；在PCR儀到達60°C時，每管加10 μ I聚合酶混合液，混勻；立刻繼續MLPA程序35個循環95°C 30 秒、60°C 30 秒、72°C 60 秒，后 72°C 20 分鐘，在 15°C暫停；
5)毛細管電泳檢測PCR產物。
上述技術方案中，所有基本分子生物學操作均參照MRC公司的《Synthetic probe design》和《Protocol MLPA_v29》。
本發明的優點是；
提供用多重連續探針擴增技術的組合探針，針對發病率相對較高、由于染色體微結構重復或缺失、臨床變現為多發畸形的綜合征，如，1ρ36缺失綜合征、Sotos綜合征、18三體綜合征、CHARGE綜合征、WiIliams Beuren綜合征、22qll缺失/重復綜合征、21三體綜合征、Smith Magenis綜合征、13三體綜合征、Cri du Chat綜合征、Prader Willi綜合征、Wolf Hirschhorn綜合征和17q21. 31缺失綜合征,根據上述綜合征的已知關鍵基因、區域,進行臨床分子診斷篩查，其中的多重連接依賴式探針擴增法(Multiplex ligation dependent probe amplification, MLPA)能克服突光定量PCR的缺點，一次能夠分析40個序列，并具有更高的分辨率、靈敏度和可重復性；同時，所述的MLPA較微陣列平臺的檢測方法，更加經濟、快捷，針對性一次能夠分析多個序列，并具有更高的分辨率、靈敏度和可重復性的優點。同時，所述的多重連續探針擴增技術的組合探針較微陣列技術和FISH的檢測方法經濟、快捷，針對性更強，適合作為臨床的常規檢測方法。
本發明的組合探針，可用于上述13個常見的多發畸形綜合征的初步篩查。
為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明的用于篩查多發畸形綜合征的組合探針進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的范圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發明的范圍內。


圖1為本發明中探針序列模建圖，其中，1、4為通用引物序列，2、3為與靶序列結合部位；5為祀序列，1+2為左探針,3+4為右探針。
圖2為本發明中MLPA操作步驟PCR設定程序示意圖。
圖3為本發明中陰性病例檢測結果原始圖像，其中，
A中，淺色峰為每個位點正常人拷貝數水平，深色峰為病例拷貝數水平，檢測病例各位點拷貝數與正常對照相同；
B中，淺色點代表每個位點的拷貝數水平，上下兩條線分別為正常范圍的上界和下界，檢測病例各位點拷貝數均在正常范圍。
圖4為本發明中陽性病例檢測結果原始圖像，其中，
A中，淺色峰為每個位點正常人拷貝數水平，深色峰為病例拷貝數水平，21號染色體上3個位點(深色)，拷貝數高于正常對照；
B中，淺色點代表每個位點的拷貝數水平，上下兩條線分別為正常范圍的上界和下界，21號染色體上3個位點(深色)，拷貝數高于正常范圍上限。
具體實施方式

實施例1.設計探針序列
(I)多發畸形綜合征及其關鍵基因的選擇
參考 http://www.ncb1.nlm.nih.Rov/sites/GeneTests/Review db = GeneTests中常見多發畸形綜合征的描述，選擇發病率相對較高、病因主要為染色體部分重復/缺失的綜合征。并根據該描述及已發表的相關文獻報道，選擇關鍵基因或關鍵區域。若尚未明確關鍵基因或關鍵區域，選擇重復/缺失片段兩端各一、及中間位置3個基因，以代表該區段。
(2)設計探針序列
選擇的目的基因序列在http://Renome. ucsc. edu/CR1-bin/hRBlat獲得,并區別標記編碼區、SNP及重復序列。
針對每個目的基因，探針均由左半序列和右半序列組成，左半序列5’端至3’端依次為左通用引物序列、左半探針序列；右半序列5’端至3’端依次為憐酸標記、右半探針序列、右通用引物序列。左、右探針序列與目的基因的目的序列相同，并可在連接酶的作用下直接相連，見圖1。
左、右序列滿足如下條件1)序列長度唯一性；2)GC含量在50%左右；3)Tm值^ 700C ；4)在連接位點不含SNP ；5)無二級結構；6)在人類基因組內無相同重復序列。
序列GC含量檢測、Tm值檢測采用Raw Probe軟件，見圖3 ; 二級結構的檢測 http://mfold. rna. albany. edu在線進行，見圖4 ;在人類基因組內是否為特異性序列, http: //genome, uses, edu/cg1-bin/hgBlatR11IS 5。
(3)探針序列的合成
將設計好的序列，由SIGMA公司合成。
實施例2鑒定探針
(I)陰性病例對照
選擇正常人群,提取全基因組DNA后,進行MLPA實驗,米用Genemarker Demol. 97 版本軟件，進行數據分析。見圖3。
(2)陽性病例對照選擇I例Sotos綜合征、I例18三體綜合征、I例22qll缺失/ 重復綜合征、I例21三體綜合征、I例13三體綜合征、I例Cri du Chat綜合征、I例Prader Willi經Affymetrix 2. 7M芯片檢測驗證，明確診斷為相應綜合征患者作為陽性對照，提取全基因組DNA后,進行MLPA實驗,米用Genemarker Demo1. 97版本軟件,進行數據分析。見圖4。
實施例3檢測多發畸形病例
選取復旦大學附屬兒科醫院新生兒病房住院的59例多發畸形患兒，提取全基因組DNA后,進行MLPA實驗,采用Genemarker Demo1. 97版本軟件,進行數據分析。共發現陽性病例13例，發現率22. 03%為。分別為21三體7例，5pl5缺失2例，22qll重復I例、 缺失I 例，5q35缺失I例，15qll-ql3缺失I例。
權利要求
1.用于篩查多發畸形綜合征的組合探針，其特征在于，其包括1ρ36缺失綜合征、Sotos綜合征、18三體綜合征、CHARGE綜合征、Williams Beuren綜合征、22qll缺失/重復綜合征、21三體綜合征、Smith Magenis綜合征、13三體綜合征、Cri du Chat綜合征、Praderffilli綜合征、WolfHirschhorn綜合征和17q21. 31缺失綜合征的關鍵基因或關鍵區域內的基因、或重復/缺失片段內兩端的基因，以及滿足相應條件的探針序列和引物序列，和磷酸化標記。
2.根據權利要求1所述的用于篩查多發畸形綜合征的組合探針，其特征在于，所述的基因為(1)1ρ36 缺失綜合征=GABRD, SK1、TP73 ；(2)Sotos 綜合征=NSDl ；(3)18 三體綜合征MC2R、DTNA, TCF4 ；(4)CHARGE 綜合征CHD7 ；(5)Williams Beuren 綜合征:CLIP2、ELN、UMKl ； (6)22qll缺失 / 重復綜合征SNAP29、TBX1、ZNF74 ；(7)21 三體綜合征KCNJ6、DYRK1A、RCANl ；(8)Smith Magenis 綜合征RA I > MFAP 4 ；(9)13 三體綜合征EDNRB、CENPJ、ERCC5、FREM2 ；(10)Cridu Chat 綜合征:CTNND2、TERT ；(11)PraderWilli 綜合征:0CA2、UBE3A、GABRB3 ；(12)WolfHirschhorn 綜合征MSX1、WHSCl、LETMl ；(13)17q21. 31 缺失綜合征MAP3K14、MAPT。
3.根據權利要求1所述的用于篩查多發畸形綜合征的組合探針，其特征在于，所述的探針均由左半序列和右半序列組成，左半序列5’端至3’端依次為左通用引物序列、左半探針序列；右半序列5’端至3’端依次為磷酸標記、右半探針序列、右通用引物序列；所述左、右探針序列與靶序列相同，并可在連接酶的作用下直接相連； 所述的左、右序列滿足如下條件 (1)序列長度唯一性； (2)GC含量在50 %左右；(3)Tm 值彡 700C ； (4)在連接位點不含SNP； (5)無二級結構； (6)在人類基因組內無相同重復序列； (7)序列加通用引物，磷酸標記。
4.根據權利要求3所述的用于篩查多發畸形綜合征的組合探針，其特征在于，所述的探針采用化學方法合成。
全文摘要
本發明屬生物技術領域，涉及篩查多發畸形綜合征的探針，尤其涉及用于篩查多發畸形綜合征的多重連續探針擴增的組合探針。本發明選擇1p36缺失綜合征、Sotos綜合征、18三體綜合征、CHARGE綜合征、Williams Beuren綜合征、22q11缺失/重復綜合征、21三體綜合征、Smith Magenis綜合征、13三體綜合征、Cri du Chat綜合征、Prader Willi綜合征、WolfHirschhorn綜合征和17q21.31缺失綜合征的關鍵基因或關鍵區域內的基因、或重復/缺失片段內兩端的基因，根據所述基因的序列，選擇滿足相應條件的作為探針序列；在所述的探針左半序列5’端和右半探針3’端加通用引物序列，并加磷酸化標記，合成多重連續探針擴增的組合探針；該探針可用于多發畸形綜合征初步篩查。
文檔編號C12N15/11GK103014141SQ20111028892
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月26日 優先權日2011年9月26日
發明者周文浩, 楊琳, 馬端, 王慧君 申請人:復旦大學