專利名稱：一種判別螺旋藻品系能否應用于大規模養殖生產的方法
技術領域：
本發明屬于螺旋藻開發應用的技術，特別涉及一種判別螺旋藻品系能否應用于大規模養殖生產的方法。
背景技術：
螺旋藻(Spirulina)，是一種光合放氧、呈規則螺旋形的原核絲狀微藻，系藍藻門 (Cyanophyta)g (Oscillatoriales) >(Oscillatoriaceae)白勺一 fM [ Κ Χ. 植物學研究，1997，15(4) 369-374]，因其富含優質蛋白和多種生物活性物質而受到國內外的極大關注，目前已在大量研究的基礎上形成了龐大的螺旋藻產業，并應用于食品、生物醫藥保健、飼料、精細化工等領域。該屬中的鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)是國內外在商業化養殖生產與開發中應用最廣泛的品種。值得指出的是，眾多的實驗研究與長期的生產實踐表明，鈍頂螺旋藻種下有許多品系，它們對溫度、光質、光照強度，以及培養液的鹽度、PH和營養成分等環境因子的要求與適應性存有顯著差異[水生生物學報，1999，23(1) 59-64]。目前國內外幾乎都采用開放或半封閉、跑道型循環式培養池這一較粗放的養殖生產模式，許多環境因子，特別是溫度和光照強度，難以人為調控，有些鈍頂螺旋藻品系在實驗室或生產小試中雖然表現出優良的生產性能，但進入生產池后，因難以適應環境因子的較大變化而無法應用于大規模生產。因此，選育品性兼優的品系一直是螺旋藻養殖生產與開發中最重要的環節與技術要點之一。目前國內外鑒別螺旋藻品系優劣的常規方法是，先在實驗室作多種環境因子交叉組合培養試驗，根據所測定的生長曲線、光合放氧、生化組成等指標作初步篩選；再依次轉接到室外約5m2、50m2及500m2的培養池中于不同季節與氣候及營養條件下進行養殖小試、 中試與生產性試驗，進而篩選出優良藻株。這一方法雖然實用，但程序繁瑣、工作量大、周期長、成本高。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足之處，建立既實用，又簡便、耗時少、低成本的螺旋藻品系優劣的鑒別新方法，以滿足當前國內外螺旋藻產業不斷發展的實際需要。本發明是在長期研究螺旋藻分子遺傳學背景，特別是螺旋藻細胞骨架蛋白基因 ftsZ的基礎上，建立起一種判別螺旋藻品系能否應用于大規模養殖生產的新方法。我們通過設計特定的引物，利用PCR等分子生物學方法克隆并測定了 5株鈍頂螺旋藻品系(分別為Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp_18、Sp-37)的ftsZ基因序列，進而利用生物信息學及分子系統分類學等分析顯示，依據ftsZ基因序列的差異位點數和相似程度，這5株品系被分成有顯著差異的兩大類。即Sp-4、Sp-12和Sp-17為一類；Sp-18和Sp-37為另一類。長期的實驗研究與生產實踐表明，這5株鈍頂螺旋藻品系在溫度、光照等環境因子能自動調控的實驗室培養試驗中均表現優良，但只有Sp-4、Sp-12、Sp-17這三株品系在實際生產養殖中表現優良，Sp-18和Sp-37因適應能力差而不能用作生產良種。由此可見，ftsZ基因序列特征與螺旋藻生產性狀存在著相關性。因此，應用ftsZ基因序列可以作為鑒別螺旋藻生產性狀優劣的分子標記，即被鑒別品系的ftsZ基因序列若與Sp-4、Sp-12、Sp-17的聚成一類，則可能生產性狀優良；若與Sp-18、Sp-37的聚成一類，則可能不可應用于生產。具體地，為解決技術問題，本發明提供的判別螺旋藻品系能否應用于大規模養殖生產的方法，是對被鑒定螺旋藻品系的ftsZ基因進行測序，并與已知鈍頂螺旋藻品系 Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp-18、Sp-37 —起進行基于ftsZ基因序列的差異位點數分析及系統發生樹構建；如果被鑒別螺旋藻品系與Sp-4、Sp-12和Sp-17的ftsZ基因序列聚成一類，表示被鑒定螺旋藻品系生產性狀優良能夠應用于大規模養殖生產；如果被鑒別螺旋藻品系與 Sp-18、Sp-37的ftsZ基因序列聚成一類，則表示被鑒定螺旋藻品系適應能力差不能應用于大規模養殖生產。該方法具體包括以下步驟(I)PCR引物設計與擴增利用Primer 5. 0引物設計軟件進行PCR擴增引物的設計，得到上游引物PF 5，-ATGAACAGTCCTGGAGTAGTGA-3，、下游引物 PR :5，-GGAATAGAAGTTATGGGTCGA-3，；擴增的反應條件為25 μ L PCR反應體系中含引物PF和I3R各0.5 μ mol/L，4種 dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各 1 μ mol/L, 2. 5U 的 Taq DNA 聚合酶，10 倍的 PCR 緩沖液 2. 5μ L，50ng 基因組 DNA，反應程序94°C 5min ；94°C 30s, 42°C 45s, 72°C lmin，31 個循環；72°C 8min ；(2) PCR產物的克隆及測序將經DNA凝膠回收試劑盒回收純化的PCR產物連接到pMD18_T載體上，轉化感受態E. coli TG1，藍白斑法篩選陽性克隆，提取質粒并作酶切鑒定，將含有目的片段的重組質粒進行測序，分別測得Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp_18、Sp-37和待鑒定螺旋藻品系基因組DNA 的ftsZ基因序列；(3)序列比對與系統發生樹構建對上述Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp-18、Sp-37和待鑒定螺旋藻品系的多重序列比對采用Clustal X 1.81軟件，其系統發生樹的構建采用Phylip 3. 65軟件包；以ftsZ基因序列作為一種分子標記與已知螺旋藻品系進行比對，由此鑒別螺旋藻生產性狀的優劣。本發明在擴增反應中選用的試劑和儀器為Taq DNA聚合酶和瓊脂糖為上海生工生物工程公司產品；克隆載體PMD18-T，以及dNTP、DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶均為日本TaKaRa公司產品；DNA凝膠回收試劑盒購于上海英駿公司；PCR引物由上海英駿公司合成，其它試劑均為分析純，序列擴增用美國Hybaid公司的Thermal Cycler PCR儀，測序用美國ABI公司的3730型測序儀。本發明的有益效果在于應用ftsZ基因序列鑒別螺旋藻品系生產性狀優劣的新方法與常規方法相比，不僅簡單快速、標準明確，而且成本低，并適合大規模、高通量篩選。


圖1為5株用于構建生產性狀鑒別標準的螺旋藻品系的系統發生樹示意圖；圖2為被鑒別藻株Sp-I與Sp-3在所建鑒別標準中的歸類圖。
具體實施例方式本發明的詳細技術方案可以通過以下步驟實施1、選用材料用于構建鑒別標準的5株鈍頂螺旋藻品系為公知的Sp-4、Sp-12、 Sp-17、Sp-18和Sp-37(浙江大學原子核農業科學研究所生物資源與分子工程實驗室也有保存)，在溫度、光照等環境因能自動調控的實驗室培養試驗中均表現優良，其中Sp-4、 Sp-12和Sp-17對環境適應能力強，在大規模生產養殖中被廣泛應用；而Sp-18和Sp_37因適應能力差而不能用作生產良種。2、選用的試劑和儀器Taq DNA聚合酶和瓊脂糖為上海生工生物工程公司產品； 克隆載體PMD18-T，以及dNTP、DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶均為日本TaKaRa公司產品；DNA凝膠回收試劑盒購于上海英駿公司；PCR引物由上海英駿公司合成。其它試劑均為分析純。序列擴增用美國Hybaid公司的Thermal Cycler PCR儀，測序用美國ABI公司的 3730型測序儀。3、PCR引物設計與擴增利用Primer 5. 0引物設計軟件得到上游引物PF 5，-ATGAACAGTCCTGGAGTAGTGA-3，，下游引物 PR 5，-GGAATAGAAGTTATGGGTCGA-3，，25 μ L PCR 反應體系中含引物 PF 禾口 PR 各 0. 5 μ mo 1/L，4 種 dNTP (dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各 1 μ mo 1/ L，2. 5U的Taq DNA聚合酶，10倍的PCR緩沖液2. 5 μ L，50ng基因組DNA [提取方法參考“海洋與湖沼”，2002，33 (2) :203-208]。反應程序94°C 5min ；94°C 30s, 42°C 45s, 72°C lmin, 31 個循環；72 °C 8min。4、PCR產物的克隆及測序將經DNA凝膠回收試劑盒回收純化的PCR產物連接到pMD18_T載體上，轉化感受態E. coli TG1，藍白斑法篩選陽性克隆，提取質粒并作酶切鑒定，將含有目的片段的重組質粒進行測序。測得Sp-4、Sp-12、Sp-17, Sp-18和Sp-37基因組DNA的ftsZ基因序列，分別如 SEQID NO =USEQID NO :2、SEQID NO :3、SEQID NO 4 和 SEQID NO 5 所示。5、序列比對與系統發生樹構建對上述Sp-4,Sp-12,Sp-17,Sp-18 和 Sp-37 的多重序列比對采用 Clustal X 1. 81 軟件，其系統發生樹的構建采用Phylip 3. 65軟件包。本發明的結果分析基于ftsZ基因序列的差異位點數分析及系統發生樹構建Sp-4,Sp-12,Sp-17,Sp-18和Sp_37的基因組DNA分別經ftsZ基因序列的特定引物PCR擴增與克隆，并測得相應的上述序列。運用Clustal X 1. 81軟件對上述5株螺旋藻品系的ftsZ基因序列的多重序列比對分析結果如下其中Sp-18和Sp-37這兩株品系與Sp_4、Sp-12或Sp_17兩兩間的堿基差異位點被標為下劃線，“_”表示缺失位點；“*”表示5個品系的ftsZ基因序列的相同位點；其具體比對情況如表1所示。表1 5株品系的ftsZ基因的序列的比較
權利要求
1.一種判別螺旋藻品系能否應用于大規模養殖生產的方法，其特征在于，是對被鑒定螺旋藻品系的ftsz基因進行測序，并與已知鈍頂螺旋藻品系Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp_18、 Sp-37 一起進行基于ftsZ基因序列的差異位點數分析及系統發生樹構建；如果被鑒別螺旋藻品系與Sp-4、Sp-12和Sp-17的ftsZ基因序列聚成一類，表示被鑒定螺旋藻品系生產性狀優良能夠應用于大規模養殖生產；如果被鑒別螺旋藻品系與Sp-18、Sp-37的ftsZ基因序列聚成一類，則表示被鑒定螺旋藻品系適應能力差不能應用于大規模養殖生產。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟(1)PCR引物設計與擴增利用Primer 5. 0引物設計軟件進行PCR擴增引物的設計，得到上游引物PF 5，-ATGAACAGTCCTGGAGTAGTGA-3，、下游引物 PR :5，-GGAATAGAAGTTATGGGTCGA-3，；擴增的反應條件為25 μ L PCR反應體系中含引物PF和PR各0. 5 μ mol/L，4種dNTP dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP 各 1 μ mol/L, 2. 5U 的 Taq DNA 聚合酶，10 倍的 PCR 緩沖液 2. 5 μ L, 50ng 基因組 DNA，反應程序94°C 5min ;94°C 30s, 42°C 45s, 72°C lmin，31 個循環；72°C 8min ；(2)PCR產物的克隆及測序將經DNA凝膠回收試劑盒回收純化的PCR產物連接到pMDIS-T載體上，轉化感受態 E. coli TG1，藍白斑法篩選陽性克隆，提取質粒并作酶切鑒定，將含有目的片段的重組質粒進行測序，分別測得Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp_18、Sp-37和待鑒定螺旋藻品系基因組DNA的 ftsZ基因序列；(3)序列比對與系統發生樹構建對上述Sp-4、Sp-12、Sp-17、Sp_18、Sp-37和待鑒定螺旋藻品系的多重序列比對采用 Clustal X 1. 81軟件，其系統發生樹的構建采用Phylip 3. 65軟件包；以ftsZ基因序列作為一種分子標記與已知螺旋藻品系進行比對，由此鑒別螺旋藻生產性狀的優劣。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，在擴增反應中選用的試劑和儀器為Taq DNA聚合酶和瓊脂糖為上海生工生物工程公司產品；克隆載體PMD18-T，以及dNTP、DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶均為日本TaKaRa公司產品；DNA凝膠回收試劑盒購于上海英駿公司；PCR引物由上海英駿公司合成，其它試劑均為分析純，序列擴增用美國Hybaid公司的 Thermal Cycler PCR儀，測序用美國ABI公司的3730型測序儀。
全文摘要
本發明屬于螺旋藻開發應用的技術，旨在提供一種判別螺旋藻品系能否應用于大規模養殖生產的方法。該方法是對被鑒定螺旋藻品系的ftsZ基因進行測序，并與已知鈍頂螺旋藻品系一起進行基于ftsZ基因序列的差異位點數分析及系統發生樹構建；如果被鑒別螺旋藻品系與已知鈍頂螺旋藻品系的ftsZ基因序列聚成一類，表示被鑒定螺旋藻品系生產性狀優良能夠應用于大規模養殖生產。應用ftsZ基因序列鑒別螺旋藻品系生產性狀優劣的新方法與常規方法相比，不僅簡單快速、標準明確，而且成本低，并適合大規模、高通量篩選。
文檔編號C12R1/89GK102329868SQ201110289019
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月26日 優先權日2011年9月26日
發明者于金鑫, 劉新穎, 呂蓓芬, 汪志平, 王景梅, 董丹丹, 藍瑾瑾, 邵斌, 陳子元 申請人:浙江大學