專利名稱：一種用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定化脂肪酶的方法。
背景技術(shù)：
脂肪酶是一類特殊的酰基水解酶，在動(dòng)植物各種組織及許多微生物中普遍存在， 是人類最早研究的酶類之一。它的天然底物是油脂，具有對油-水界面的親和力，能催化酯水解或醇解、酯合成、酯交換、多肽合成等反應(yīng)，在制藥、試劑、食品加工、生物能源等方面有著很大的應(yīng)用潛力。但脂肪酶是水溶性的，不易回收重復(fù)使用，粉末狀脂肪酶分散于有機(jī)溶劑中容易失活，于酶的固定化有利于酶的分散、回收和再利用，減少了酶的損耗和殘余酶產(chǎn)生的再次污染。科學(xué)家們一直對酶的固定化技術(shù)進(jìn)行研究，但迄今為止，幾乎沒有一種固定化技術(shù)能普遍適用于每一種酶，所以要根據(jù)酶的應(yīng)用目的和特性，來選擇其固定化方法。目前已建立的固定化方法一般可分為包埋法、吸附法、交聯(lián)法及共價(jià)偶聯(lián)法等。從20世紀(jì)50年代膜分離技術(shù)進(jìn)入工業(yè)化以來，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，它已廣泛滲透到化工、冶金、環(huán)保、生物工程等領(lǐng)域。分離膜不僅能對氣體、有機(jī)物、各類生物制劑等進(jìn)行有效的分離、濃縮、純化，而且還能作為固定化酶的載體，實(shí)現(xiàn)酶的膜固定化。固定化酶膜可將酶的催化特性和膜的分離、載體和分隔功能等結(jié)合起來，從而構(gòu)成酶膜生物反應(yīng)器，具有其他載體不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。近年來酶的膜固定化技術(shù)己經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜具有一定的吸附性、化學(xué)穩(wěn)定性好、疏水性、機(jī)械性能優(yōu)異等優(yōu)點(diǎn)， 根據(jù)復(fù)合膜的吸附特性固定化脂肪酶，提高了酶在反應(yīng)體系中的活性和穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)和控制酶的活性與選擇性，從而有利于酶的回收和產(chǎn)品的生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是針對單膜法固定化脂肪酶效果不理想的問題，而提出的用醋酸纖維素/ 聚四氟乙烯復(fù)合膜來進(jìn)行固定化脂肪酶的方法。用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶的方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)一、復(fù)合膜的制備。二、脂肪酶的固定化。三、酶活力的測定。四、固定化條件的優(yōu)化。五、固定化酶酶學(xué)性質(zhì)的討論。六、通過固定化酶膜的SEM圖像進(jìn)一步解釋利用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶的優(yōu)勢。利用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶中，酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜具有一定的吸附性、化學(xué)穩(wěn)定性好、疏水性、機(jī)械性能優(yōu)異等優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)復(fù)合膜的吸附特性固定化脂肪酶，提高了酶在反應(yīng)體系中的活性和穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)和控制酶的活性與選擇性，從而有利于酶的回收，最終得到的固定化酶活為17. 2U/cm2,明顯高于文獻(xiàn)中單膜法固定化脂肪酶的活力。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶的方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)一、復(fù)合膜的制備將15g醋酸纖維素60°C下溶于85g 二甲基甲酰胺中得到鑄膜液。將聚四氟乙烯膜先用0. lmol/L的NaOH溶液和0. lmol/L的HCl溶液清洗，然后用去離子水清洗，真空干燥后，平鋪在潔凈的玻璃板上。將醋酸纖維素鑄膜液用特制的刮刀涂在聚四氟乙烯膜表面，控制厚度，在室溫下?lián)]發(fā)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間完成干相轉(zhuǎn)換后，浸入去離子水完成濕相轉(zhuǎn)換。1 后用去離子水清洗，自然干燥待用；二、脂肪酶的固定化取若干份Icm2的醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜于三角瓶中，分別加入一定量的酶液和PH7. 5的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鉀緩沖液，恒溫?cái)嚢栉揭欢〞r(shí)間(25°C，170r/min)。再加入一定量戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取出酶膜，用去離子水沖洗，放于干燥處待其風(fēng)干后測定酶活。三、 酶活力的測定采用橄欖油乳化法；四、固定化條件的優(yōu)化分別在溫度5 35°C，吸附時(shí)間0. 5 3h，酶液濃度0. 005 0. 03g/mL,交聯(lián)時(shí)間1 6h，交聯(lián)劑濃度0. 05 0. 3%的條件下，通過測定固定化酶活力得到最佳的固定化條件。五、固定化酶酶學(xué)性質(zhì)的討論在溫度15 55°C，pH 5. 5 9. 5范圍內(nèi)，通過測定固定化酶和游離酶的活力，得出固定化酶的最適溫度，最適PH值。并通過5 12次重復(fù)使用固定化酶水解橄欖油來討論固定化酶的使用穩(wěn)定性。六、通過固定化酶膜的SEM圖像進(jìn)一步解釋利用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶的優(yōu)勢。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜與酶液在溫度20 30°C的條件下進(jìn)行脂肪酶的吸附固定。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜與酶液在溫度5 35°C的條件下，吸附固定2 池。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜與酶液在溫度5 35°C，吸附時(shí)間0. 5 3h，的條件下，添加濃度為0. 015 0. 025g/mL的酶液。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜與酶液在溫度5 35°C，吸附時(shí)間0. 5 3h，酶液濃度0. 005 0. 03g/mL的條件下，與戊二醛交聯(lián)2 4h。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜與酶液在溫度5 35°C，吸附時(shí)間0. 5 3h，酶液濃度0. 005 0. 03g/mL，與戊二醛交聯(lián)1 Mi的條件下，添加濃度為0. 15% 0. 25%的交聯(lián)劑。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟五中將固定化酶與游離酶在溫度25 45°C條件下，比較固定化酶與游離酶的最適溫度。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟五中將固定化酶與游離酶在PH7 9. 5條件下，比較固定化酶與游離酶的最適pH值。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)在于步驟五中將固定化酶重復(fù)使用10次來水解橄欖油，得到固定化酶的相對酶活力為原酶活的55. 5%。其它步驟與具體實(shí)施方式
一相同。
權(quán)利要求
1.一種用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶的方法，其特征在于用復(fù)合膜來固定化脂肪酶的方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)一、復(fù)合膜的制備將15g醋酸纖維素60°C下溶于8 二甲基甲酰胺中得到鑄膜液。將聚四氟乙烯膜先用0. lmol/L的NaOH溶液和0. Imol/ L的HCl溶液清洗，然后用去離子水清洗，真空干燥后，平鋪在潔凈的玻璃板上。將醋酸纖維素鑄膜液用特制的刮刀涂在聚四氟乙烯膜表面，控制厚度，在室溫下?lián)]發(fā)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間完成干相轉(zhuǎn)換后，浸入去離子水完成濕相轉(zhuǎn)換。1 后用去離子水清洗，自然干燥待用；二、脂肪酶的固定化取若干份Icm2的醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜于三角瓶中，分別加入一定量的酶液和PH 7. 5的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鉀緩沖液，恒溫?cái)嚢栉揭欢〞r(shí)間(25°C， 170r/min) 0再加入一定量戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取出酶膜，用去離子水沖洗， 放于干燥處待其風(fēng)干后測定酶活。三、酶活力的測定采用橄欖油乳化法；四、固定化條件的優(yōu)化分別在溫度5 35°C，吸附時(shí)間0. 5 3h，酶液濃度0. 005 0. 03g/mL,交聯(lián)時(shí)間 1 6h，交聯(lián)劑濃度0. 05 0. 3%的條件下，通過測定固定化酶活力得到最佳的固定化條件。五、固定化酶酶學(xué)性質(zhì)的討論在溫度15 55°C，pH 5. 5 9. 5范圍內(nèi)，通過測定固定化酶和游離酶的活力，得出固定化酶的最適溫度，最適PH值。并通過重復(fù)使用固定化酶水解橄欖油來討論固定化酶的使用穩(wěn)定性。六、通過固定化酶膜的SEM圖像進(jìn)一步解釋利用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶的優(yōu)勢。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜與酶液在溫度20 30°C的條件下進(jìn)行脂肪酶的吸附固定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜與酶液在溫度5 35°C的條件下，吸附固定2 汕。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜與酶液在溫度5 35°C，吸附時(shí)間0. 5 3h， 的條件下，添加濃度為0. 015 0. 025g/mL的酶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜與酶液在溫度5 35°C，吸附時(shí)間0. 5 3h， 酶液濃度0. 005 0. 03g/mL的條件下，與戊二醛交聯(lián)2 4h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟四中將醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜與酶液在溫度5 35°C，吸附時(shí)間0. 5 3h， 酶液濃度0. 005 0. 03g/mL,與戊二醛交聯(lián)1 Mi的條件下，添加濃度為0. 15% 0. 25% 的交聯(lián)劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟五中將固定化酶與游離酶在溫度25 45°C條件下，比較固定化酶與游離酶的最適溫度。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟五中固定化酶與游離酶在PH7 9. 5條件下，比較固定化酶與游離酶的最適pH值。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶，其特征在于步驟五中將固定化酶重復(fù)使用10次來水解橄欖油，得到固定化酶的相對酶活力為原酶活的55. 5%。
全文摘要
本發(fā)明提供一種以醋酸纖維素和聚四氟乙烯膜為材料制備了醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜，采用吸附-交聯(lián)相結(jié)合的固定化方法，用該復(fù)合膜來固定化脂肪酶。研究了溫度、吸附時(shí)間、酶液濃度、交聯(lián)時(shí)間和交聯(lián)劑濃度等不同固定化條件對脂肪酶固定化效率和催化效果的影響，并對固定化酶膜的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了討論。通過固定化酶膜的SEM圖像進(jìn)一步解釋利用醋酸纖維素/聚四氟乙烯復(fù)合膜固定化脂肪酶的優(yōu)勢。根據(jù)本發(fā)明中復(fù)合膜的吸附特性固定化脂肪酶，提高了酶在反應(yīng)體系中的活性和穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)和控制酶的活性與選擇性，從而有利于酶的回收和產(chǎn)品的生產(chǎn)，最終得到的固定化酶活為17.2U/cm2，明顯高于文獻(xiàn)中單膜法固定化脂肪酶的活力。
文檔編號C12N11/08GK102304503SQ201110290420
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月20日
發(fā)明者于殿宇, 劉鑫, 周曉丹, 周璇, 宋云花, 張佳寧, 張春艷, 時(shí)敏, 李志平, 李越, 江連洲, 王妍, 王立琦, 王雪, 胡立志, 陳曉慧 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)