專利名稱：一種包埋-交聯磷脂酶A₁聚集體的方法
技術領域：
本發明涉及一種固定化磷脂酶的方法。
背景技術：
磷脂酶A1在磷脂改性、油脂精煉等方面有廣泛應用，但游離磷脂酶A1價格昂貴，且不易回收，催化水解時條件苛刻；與游離酶相比，固定化酶在保持其高效、專一及溫和的酶催化反應特性同時，還呈現貯存穩定性高、分離回收容易、可多次重復使用、操作連續可控、 工藝簡便等優點。交聯酶聚集體(CLEAs)，是一類新型的固定化酶技術，具有制備簡單、酶活回收率高、操作和保存穩定性強等優點，被廣泛運用于固定化酶的制備中。近年來，CLEAs技術與材料學、印跡工程、介質工程、反應工程學等相結合取得了一系列新進展，包括載體固定化 CLEAs、包埋CLEAs、印跡法CLEAs、多酶CLEAs、CLEAs膜漿反應器等，在手性分子拆分與合成、抗生素生產等領域取得了一些成果。有些酶的CLEAs相對游離酶的酶活回收率竟超過 100%，某些脂酶的交聯酶聚集體活性甚至可提高10倍以上。但是由于其不易回收等缺點， 使酶的重復利用率降低，因此為得到活力高且回收率高的固定化酶。

發明內容
本發明是針對固定化磷脂酶A1活性低等問題，而提出的用包埋-交聯酶聚集體來進行磷脂酶A1固定化的方法。用包埋-交聯酶聚集體固定化磷脂酶A1的方法通過以下步驟實現一、磷脂酶A1的固定化。二、酶活力的測定。三、固定化條件的優化。四、固定化酶酶學性質的討論。五、通過固定化酶膜的SEM圖像進一步解釋包埋-交聯磷脂酶A1聚集體的優勢。利用包埋-交聯酶聚集體來進行磷脂酶A1的固定化中，包埋-交聯酶聚集體具有化學穩定性好、機械性能優異等優點，根據這些優點來固定磷脂酶，提高了酶在反應體系中的活性和穩定性，調節和控制酶的活性與選擇性，從而有利于酶的回收和保持較高的酶活回收率，最終得到的固定化酶活回收率為80. 2%，重復使用7次相對酶活力保留在65% 以上。
具體實施例方式以下通過具體實施例來進一步描述本發明，但這些實施例僅是例證性的，并不對本發明的保護范圍構成任何影響，本領域技術人員應該理解的是，根據本發明的精神所做的任何修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
具體實施方式
一用包埋-交聯酶聚集體來固定磷脂酶A1的方法通過以下步驟實現一、磷脂酶A1的固定化1、磷脂酶A1聚集體的制備將ImL酶加入到一定量的pH值為 5. 0的磷酸二氫鈉與檸檬酸緩沖液中，在0°C下緩慢加入無水乙醇并持續攪拌，從而保證酶聚集體顆粒均勻。冰浴反應一段時間，然后于IOOOOrpm離心，收集沉淀。2、交聯磷脂酶A1聚集體的制備及包埋過程向聚集體懸浮液中加入一定濃度的戊二醛，攪拌反應一段時間， 離心去除上清液，用緩沖液沖洗交聯酶聚集體數次，直到洗液中檢測不到任何的活力，收集沉淀用磷酸鹽緩沖液懸浮。在一定濃度的20mL海藻酸鈉溶液中加入上述酶聚集體lmL，攪拌均勻。靜止一段時間后，用滅菌后的5mL注射器吸入上述混合液，以約5滴/s注入一定濃度CaCl2溶液中制成微膠囊，將形成的微膠囊在4°C的CaCl2溶液中放置一段時間使其進一步硬化。然后抽濾得到硬化的微膠囊，用無菌生理鹽水洗滌3 5次，以洗去表面的 CaCl2，然后進行冷凍干燥備用。二、酶活力的測定一定量的底物無油磷脂溶于預定pH值的緩沖液中，經磁力攪拌器充分攪拌，混合均勻。取4個IOOmL三角瓶，2個作為空白瓶，2個作為樣品瓶，各加底物溶液25mL，再于空白瓶中加入95%乙醇15mL，于預定溫度的水浴中預熱5min，然后在各瓶中加入一定質量的經復水后的固定化酶，立即混勻計時，在預定溫度的水浴中180r/min的條件振蕩準確反應15min，然后于樣品瓶中立即補加95%乙醇15mL 終止反應，取出，用微量滴定管和配置好的NaOH標準溶液滴定，計算標準堿液平均消耗量。 三、固定化條件的優化分別在酶液濃度0. 02 0. 07g/mL、沉淀劑飽和度65 90%、沉淀 pH3 8、沉淀時間15 65min、交聯劑濃度0. 1 0. 6%、交聯時間3. 5 8. 5h、海藻酸鈉濃度0. 5 3%、鈣離子濃度0. 1 0. 35mol/L的條件下，通過測定固定化酶活力得到最佳的固定化條件。四、固定化酶酶學性質的討論在溫度40 70°C，PH 4. 5 7范圍內，通過測定固定化酶和游離酶的活力，得出固定化酶的最適溫度，最適PH值。并通過重復測定酶活來討論固定化酶的使用穩定性。五、通過固定化酶膜的SEM圖像進一步解釋包埋-交聯磷脂酶A1聚集體的優勢。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟三中將將酶液濃度0. 03 0. 07g/mL的條件下進行磷脂酶A1的固定。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟三中將將沉淀劑飽和度70 85%的條件下進行磷脂酶A1的固定。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟三中將將沉淀 PH4 7的條件下進行磷脂酶A1的固定。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟三中將將沉淀時間25 55min的條件下進行磷脂酶A1的固定。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟三中將將交聯劑濃度0. 2 0. 5%的條件下進行磷脂酶A1的固定。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟三中將將交聯時間4. 5 7. 5h的條件下進行磷脂酶A1的固定。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟三中將將海藻酸鈉濃度1 2. 5%的條件下進行磷脂酶A1的固定。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟三中將將鈣離子濃度0. 15 0. 3mol/L的條件下進行磷脂酶A1的固定。其它步驟與具體實施方式
一相同。
權利要求
1.一種包埋-交聯磷脂酶A1聚集體的方法，其特征在于用包埋-交聯酶聚集體來固定磷脂酶的方法通過以下步驟實現一、磷脂酶A1的固定化1、磷脂酶A1聚集體的制備將 ImL酶加入到一定量的pH值為5.0的磷酸二氫鈉與檸檬酸緩沖液中，在0°C下緩慢加入無水乙醇并持續攪拌，從而保證酶聚集體顆粒均勻。冰浴反應一段時間，然后于IOOOOrpm離心，收集沉淀。2、交聯磷脂酶A1聚集體的制備及包埋過程向聚集體懸浮液中加入一定濃度的戊二醛，攪拌反應一段時間，離心去除上清液，用緩沖液沖洗交聯酶聚集體數次，直到洗液中檢測不到任何的活力，收集沉淀用磷酸鹽緩沖液懸浮。在一定濃度的20mL海藻酸鈉溶液中加入上述酶聚集體lmL，攪拌均勻。靜止一段時間后，用滅菌后的5mL注射器吸入上述混合液，以約5滴/s注入一定濃度CaCl2溶液中制成微膠囊，將形成的微膠囊在4°C的 CaCl2溶液中放置一段時間使其進一步硬化。然后抽濾得到硬化的微膠囊，用無菌生理鹽水洗滌3 5次，以洗去表面的CaCl2，然后進行冷凍干燥備用。二、酶活力的測定一定量的底物無油磷脂溶于預定PH值的緩沖液中，經磁力攪拌器充分攪拌，混合均勻。取4個IOOmL 三角瓶，2個作為空白瓶，2個作為樣品瓶，各加底物溶液25mL，再于空白瓶中加入95%乙醇 15mL，于預定溫度的水浴中預熱5min，然后在各瓶中加入一定質量的經復水后的固定化酶， 立即混勻計時，在預定溫度的水浴中180r/min的條件振蕩準確反應15min，然后于樣品瓶中立即補加95%乙醇15mL終止反應，取出，用微量滴定管和配置好的NaOH標準溶液滴定， 計算標準堿液平均消耗量。三、固定化條件的優化分別在酶液濃度0. 02 0. 07g/mL、沉淀劑飽和度65 90%、沉淀pH3 8、沉淀時間15 65min、交聯劑濃度0. 1 0. 6%、交聯時間3. 5 8. 5h、海藻酸鈉濃度0. 5 3%、鈣離子濃度0. 1 0. 35mol/L的條件下，通過測定固定化酶活力得到最佳的固定化條件。四、固定化酶酶學性質的討論在溫度40 70°C, PH 4. 5 7范圍內，通過測定固定化酶和游離酶的活力，得出固定化酶的最適溫度， 最適PH值。并通過重復測定酶活來討論固定化酶的使用穩定性。五、通過固定化酶膜的 SEM圖像進一步解釋包埋-交聯磷脂酶A1聚集體的優勢。
2.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A1聚集體的方法，其特征在于步驟三中將酶液濃度0. 03 0. 07g/mL的條件下進行磷脂酶A1的固定。
3.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A1聚集體的方法，其特征在于步驟三中將沉淀劑飽和度70 85%的條件下進行磷脂酶A1的固定。
4.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A1聚集體的方法，其特征在于步驟三中將沉淀PH4 7的條件下進行磷脂酶A1的固定。
5.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A1聚集體的方法，其特征在于步驟三中將沉淀時間25 55min的條件下進行磷脂酶A1的固定。
6.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A1聚集體的方法，其特征在于步驟三中將交聯劑濃度0. 2 0. 5%的條件下進行磷脂酶A1的固定。
7.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A1聚集體的方法，其特征在于步驟三中將交聯時間4. 5 7. 5h的條件下進行磷脂酶A1的固定。
8.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A1聚集體的方法，其特征在于步驟三中將海藻酸鈉濃度1 2. 5%的條件下進行磷脂酶A1的固定。
9.根據權利要求1所述的一種包埋-交聯磷脂酶A1聚集體的方法，其特征在于步驟三中將鈣離子濃度0. 15 0. 3mol/L的條件下進行磷脂酶A1的固定。
全文摘要
本發明提供一種固定化磷脂酶A1的方法，在交聯酶聚集體技術基礎上進行改進，先將游離磷脂酶A1制成交聯酶聚集體，再將得到交聯酶聚集體進行包埋，得到固定化磷脂酶A1。研究了酶液濃度、沉淀劑飽和度、沉淀pH、沉淀時間、交聯劑濃度、交聯時間、海藻酸鈉濃度和鈣離子濃度等不同固定化條件對磷脂酶固定化效率和催化效果的影響，并對固定化酶膜的酶學性質進行了討論。通過固定化酶膜的SEM圖像進一步解釋利用包埋-交聯聚集體的方法固定化磷脂酶的優勢。根據本包埋-交聯酶聚集體化學穩定性和機械性能優異等特性固定化磷脂酶，提高了酶在反應體系中的活性和穩定性，調節和控制酶的活性與選擇性，從而有利于酶的回收和保持較高的酶活回收率，最終得到的固定化酶活回收率為80.2％，重復使用7次相對酶活力保留在65％以上。
文檔編號C12N11/04GK102337256SQ20111029042
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月20日 優先權日2011年9月20日
發明者于殿宇, 周旋, 奚會松, 宋云花, 張佳寧, 時敏, 李志平, 李越, 杜晶, 王妍, 王立琦, 王雪, 胡立志, 陳曉慧 申請人:東北農業大學