專利名稱：一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及多肽的制備及初步分離技術(shù)。
背景技術(shù)：
月太，iii^^j ACE φ M Ii (Angiotensin-converting Enzyme Inhibitory Peptides, ACEIP)是一類能夠降低人體血壓的小分子肽，它是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 (Angiotensin-converting Enzyme, ACE)的抑制劑，可通過抑制血管緊張素I向血管緊張素II轉(zhuǎn)換以及阻止ACE降解緩激肽而起到降低血壓的作用。盡管目前的多種化學(xué)合成肽類可以抑制ACE活性，但都有一定的副作用，且由于他們的作用時(shí)間不長(zhǎng)，停藥后會(huì)使血壓反彈，而大量的實(shí)驗(yàn)證明乳蛋白來源的ACE抑制肽具有較高的體內(nèi)降壓作用，主要集中在小分子的肽類。1979年Oshima等最早報(bào)道食品蛋白源ACE抑制肽是由細(xì)菌膠原酶降解明膠獲得的六條活性肽，并證實(shí)抑制ACE活性的肽分子量主要集中在1500u以下。1982 年Maruyamas第一次從牛乳酪蛋白的胰蛋白酶水解液中分離出具有ACE抑制作用的十二肽、七肽、六肽和五肽。目前酶法制備乳源蛋白降血壓肽的方法包括直接酶解法和利用微生物間接酶解法，直接酶解又可分為單酶水解和復(fù)合酶水解。Nakamura、Yamamoto和 Abubakar等采用微生物間接酶解法從酸牛乳、干酪乳清中得到了具ACE抑制作用的降血壓肽;Aubois、拉爾夫、羅永康、毛學(xué)英等通過蛋白酶水解乳清蛋白的得到了具ACE抑制作用的降壓肽。從目前已有的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，水解乳清蛋白制備降血壓肽主要使用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等，均為單酶或雙酶水解法，上述方法得到的降血壓肽的分子量主要集中在1500u左右。本發(fā)明模擬人體胃腸道消化的方式，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶單酶和復(fù)合酶三酶兩步水解法制備乳清蛋白降血壓肽，較單酶或雙酶水解法得到的降血壓肽分子量更小、體內(nèi)吸收更容易。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以乳清蛋白為原料生產(chǎn)降血壓肽的方法，通過模擬人體胃腸道消化的方式，采用三酶兩步水解法獲得具有高ACE抑制活性，且易于體內(nèi)吸收的小分子降血壓肽。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，包括如下步驟
(1)乳清蛋白為原料，加水配制成質(zhì)量濃度為19Γ3%的乳清蛋白懸濁液，85°C 90°C 保持IOmin使乳清蛋白變性，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)pH=l. 5 2. 0，水解溫度為35°C 40°C，每Ig 乳清蛋白加胃蛋白酶25000擴(kuò)35000U，水解時(shí)間為廣3h ；
(2)酶解結(jié)束后80°C 90°C保持IOmin滅酶，冷卻至室溫后4000r/min離心；
(3)取步驟(2)所得上清液，調(diào)節(jié)pH=7.5^8. 0，水解溫度為45°C ^50°C，每Ig乳清蛋白加胰蛋白酶10000U 20000U和胰凝乳蛋白酶10000U 20000U，水解時(shí)間為4 6h ；
(4)酶解結(jié)束后80°C 90°C保持IOmin滅酶，冷卻至室溫后4000r/min離心，上清液真空濃縮后冷凍干燥得乳清蛋白降血壓肽粗品；
(5)取步驟⑷的乳清蛋白降血壓肽粗品，配制20mg/ml的多肽溶液IOOmL,加入30g 的DA201-C大孔吸附樹脂，30°C條件下靜態(tài)吸附3 5h，依次用25%、50%、75%、100%乙醇洗脫廣3h，收集并濃縮75%的乙醇洗脫組分；
(6)取步驟(5)中的質(zhì)量百分比濃度為75%的乙醇溶液洗脫組分，利用S印hadex G-IO凝膠層析進(jìn)一步分離，超純水lmL/min的流速進(jìn)行洗脫，收集第二個(gè)洗脫峰，真空濃縮后冷凍干燥得粉末狀乳清蛋白降血壓肽。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)
(1)本發(fā)明提出了一種制備乳清蛋白降血壓肽的新方法，通過模擬人體胃腸道消化的方式，采用三酶兩步水解法。此法安全、無毒副作用，工藝簡(jiǎn)單易行，便于工業(yè)化生產(chǎn)。(2)本發(fā)明制備的降血壓肽分子量分布在IOOOu以下、主要集中在600u左右，易于體內(nèi)吸收，且具高ACE抑制活性。(3)本發(fā)明制備的降血壓肽來源于牛乳蛋白，因此具有安全、無毒副作用，對(duì)正常血壓無作用等特點(diǎn)，可用于制備降血壓藥物和食品。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
本發(fā)明所述一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，以乳清蛋白為原料，每1. 5g乳清蛋白加水100mL，85°C 90°C保持IOmin使乳清蛋白變性，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)pH=l. 8，水解溫度為37°C，每Ig乳清蛋白加胃蛋白酶29000U，水解2h，在80°C 90°C條件下保持IOmin滅酶， 冷卻至室溫后4000r/min離心，將上清液調(diào)節(jié)pH=7. 8，水解溫度為48°C，每Ig乳清蛋白加胰蛋白酶15000U和胰凝乳蛋白酶15000U，水解5h，在80°C 90°C條件下保持IOmin滅酶，冷卻至室溫后4000r/min離心，將上清液真空濃縮后冷凍干燥得白色或淡黃色的粉末狀乳清蛋白降血壓肽粗品。取乳清蛋白降血壓肽粗產(chǎn)品配制20mg/ml的多肽溶液，每IOOmL溶液加30g DA201-C大孔吸附樹脂，30°C條件下靜態(tài)吸附4h，依次用25%、50%、75%、100%乙醇洗脫2h，收集并濃縮75%的洗脫組分。質(zhì)量百分比濃度為75%的乙醇洗脫組分利用S印hadex G-IO凝膠層析進(jìn)一步分離，超純水lmL/min的流速洗脫，收集第二個(gè)洗脫峰，真空濃縮后冷凍干燥得乳清蛋白降血壓肽產(chǎn)品。實(shí)施例2
與實(shí)施例1類似，其區(qū)別在于每3g乳清蛋白加水100mL，pH=2. 0，每Ig乳清蛋白加胃蛋白酶35000U，水解時(shí)間為3h。
權(quán)利要求
1.一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，其特征在于其步驟為(1)乳清蛋白懸濁液在85、0°c條件下保持IOmin變性，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)PH后加入胃蛋白酶，反應(yīng)廣3h后滅酶，冷卻后離心取上清液；(2 )取步驟(1)所得上清液調(diào)節(jié)pH，加入胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，反應(yīng)4 6h后滅酶， 冷卻后離心取上清液；(3)取步驟(2)所得上清液，真空濃縮后冷凍干燥得到白色或淡黃色的乳清蛋白降血壓肽粗品；(4)取步驟(3)所得乳清蛋白降血壓肽粗品用DA201-C大孔吸附樹脂吸附，然后乙醇梯度洗脫，收集并濃縮75%的乙醇洗脫組分；(5)取步驟(4)所得到的75%的乙醇洗脫組分利用葡聚糖S印hadexG-IO凝膠層析分離得到乳清蛋白降血壓肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是步驟(1)中乳清蛋白懸濁液質(zhì)量濃度為1% 3%，加酶量為每Ig乳清蛋白加胃蛋白酶25000擴(kuò)35000U， PH= 1. 5 2. 0，水解溫度為350C 40°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是步驟(2) 中加酶量為每Ig乳清蛋白加胰蛋白酶10000U 20000U和胰凝乳蛋白酶10000擴(kuò)20000U， pH=7. 5 8. 0，水解溫度為450C 50°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是步驟(1)和 (2)中滅酶條件為8(T90°C保持lOmin，冷卻至室溫后4000r/min離心。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是步驟(4)中取乳清蛋白降血壓肽粗品溶于水中，加入DA201-C大孔吸附樹脂下靜態(tài)吸附;T5h，依次用體積分?jǐn)?shù)為25%、50%、75%、100%的乙醇洗脫廣3h，收集并濃縮75%的乙醇洗脫組分，實(shí)現(xiàn)乳清蛋白降血壓肽的初步分離。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，其特征是步驟(4)中將質(zhì)量百分比濃度為75%的乙醇溶液洗脫組分通過S印hadex G-IO凝膠層析進(jìn)一步分離， 收集第二個(gè)洗脫峰，真空濃縮后冷凍干燥獲得粉末狀乳清蛋白降血壓肽。
全文摘要
一種乳清蛋白降血壓肽的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。步驟乳清蛋白懸濁液在85~90℃條件下保持10min變性，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH后加入胃蛋白酶，反應(yīng)1~3h后滅酶，冷卻后離心取上清液；調(diào)節(jié)pH，加入胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，反應(yīng)4~6h后滅酶，冷卻后離心取上清液；真空濃縮后冷凍干燥得到白色或淡黃色的乳清蛋白降血壓肽粗品；用DA201-C大孔吸附樹脂吸附，然后乙醇梯度洗脫，收集并濃縮75%的乙醇洗脫組分；利用葡聚糖SephadexG-10凝膠層析分離得到乳清蛋白降血壓肽。優(yōu)點(diǎn)安全、無毒副作用，工藝簡(jiǎn)單，便于工業(yè)化生產(chǎn)；易于體內(nèi)吸收，具高ACE抑制活性；具有安全、無毒副作用，對(duì)正常血壓無作用等特點(diǎn)，可用于制備降血壓藥物和食品。
文檔編號(hào)C12P21/06GK102329845SQ20111029453
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者呂兵, 王建峰, 王桂春, 陸劍平 申請(qǐng)人:常熟市金城食品添加劑有限公司