專利名稱：一種利用木質(zhì)纖維素制備l-乳酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用一株改造的厭氧梭菌菌株降解木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法。
背景技術(shù)：
L-乳酸(L-lactic acid)是在生物發(fā)酵過程中通過L-乳酸脫氫酶的催化作用下將丙酮酸轉(zhuǎn)換而成的左旋乳酸。與D-乳酸相比，由于L-乳酸可直接參與人體代謝、無任何副作用等良好的生物相融性，其被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。
木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源，但只有極少數(shù)被有效利用，絕大部分被作為廢物棄置在環(huán)境中，比如城市垃圾，反而造成環(huán)境污染。我國是農(nóng)業(yè)大國，每年的農(nóng)林廢棄物總量約15億噸，所以利用木質(zhì)纖維素作為原材料生產(chǎn)各類生物燃料以及化工產(chǎn)品具有廣闊的應(yīng)用前景。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大部分組成，分別占35-50%，20-35%，以及10-15%。由于其結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，導(dǎo)致其降解十分困難。
整合生物加工技術(shù)(Consolidated BioProcessing, CBP)針對(duì)當(dāng)前木質(zhì)纖維素利用技術(shù)中采用單元操作與集成優(yōu)化模式面臨的諸多挑戰(zhàn)，通過將纖維素酶的生產(chǎn)、纖維素的酶水解、戊糖發(fā)酵與己糖發(fā)酵等原本分立的反應(yīng)步驟進(jìn)行整合，大大簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝并有效地降低了成本，從而提高纖維素生物轉(zhuǎn)化利用的綜合技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。基于這些顯著的特色，CBP被認(rèn)為是最有前景的低成本纖維素生物轉(zhuǎn)化利用技術(shù)路線之一。
熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)是目前被認(rèn)為最有希望滿足CBP要求的微生物類群之一。熱纖梭菌能夠在高溫厭氧條件下發(fā)酵，其產(chǎn)生的纖維小體是目前最高效的結(jié)晶纖維素水解體系。熱纖梭菌不僅可以直接將纖維素轉(zhuǎn)化為單糖，并將水解產(chǎn)生的纖維寡糖及葡萄糖發(fā)酵為乳酸等在工業(yè)、食品業(yè)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用的高附加值產(chǎn)品。因此，在工業(yè)化應(yīng)用的前景上，熱纖梭菌比目前正在使用的酵母、大腸桿菌和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌等非纖維素降解菌具有更加顯著的優(yōu)勢(shì)。然而，野生型熱纖梭菌的乳酸生產(chǎn)能力較低，遠(yuǎn)不能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求。
本方法是建立在一株通過遺傳改造獲得的熱纖梭菌菌株CT-ak/dh的基礎(chǔ)之上的。在保持野生菌株能夠快速降解纖維素的特點(diǎn)前提下，該改造菌株在強(qiáng)化了乳酸合成途徑的同時(shí)切斷了其乙酸合成的途徑，從而將源于糖酵解的大部分代謝流導(dǎo)向乳酸發(fā)酵的方向，使得利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乳酸成為可能。本方法利用該改造菌株建立并優(yōu)化了木質(zhì)纖維素發(fā)酵制備L-乳酸的方法，從而大大降低乳酸生產(chǎn)成本，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前旦-5^ O發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括建立一株遺傳改造的厭氧梭菌菌株CT-ak/dh，以及以該菌株發(fā)酵降解預(yù)處理秸桿(木質(zhì)纖維素)來生產(chǎn)L-乳酸兩部分內(nèi)容。所要解決的技術(shù)問題可以通過以下方案來實(shí)現(xiàn)
1.熱纖梭菌的遺傳改造
本發(fā)明使用的起始菌株為Clostridium thermocellum。
為敲除目的基因，構(gòu)建的質(zhì)粒包括PHKOl (敲除質(zhì)粒骨架，含有下列原件a大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)ColEl和熱纖梭菌的復(fù)制起點(diǎn)pno ；b熱纖梭菌識(shí)別的復(fù)制其實(shí)起始蛋白 repB ;c氣霉素(chloramphenicol)抗性基因cat ;d大環(huán)內(nèi)酷類抗生素(macrolide-linco samide-streptograminB)抗性基因mis),以及在pHKOl基礎(chǔ)上構(gòu)建的敲除質(zhì)粒pHK02,用于敲除熱纖梭菌基因組上的基因Cthe_1028(乙酸激酶)。為表達(dá)外源基因，首先在pMPl 或pHKOl的基礎(chǔ)上加入?yún)捬鯚晒獾鞍椎木幋a基因PpFbFP，構(gòu)建的質(zhì)粒定義為質(zhì)粒pEMOl或 PEK01，后在二者基礎(chǔ)上加入待表達(dá)基因序列，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pEM02或pEK02。
如

圖1所示，將上述質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到相應(yīng)的宿主菌株中從而獲得相應(yīng)的目的菌株。本發(fā)明中的基因敲除方法是基于同源重組的原理進(jìn)行的，即根據(jù)熱纖梭菌基因組上目的基因兩側(cè)的核酸序列，分別設(shè)計(jì)約Ikb長(zhǎng)得同源臂序列，并構(gòu)建在相應(yīng)的敲除載體上，通過同源臂的交換重組，使得基因組上的目的基因置換到質(zhì)粒上來，再經(jīng)過相應(yīng)的篩選步驟從而達(dá)到基因敲除的目的。外源基因的表達(dá)是通過PEM02或PEK02上增加啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子原件來控制的，所選用的啟動(dòng)子見表I。
表1.本發(fā)明所采用的啟動(dòng)子種類
權(quán)利要求
1.一種利用木質(zhì)纖維素制備L-乳酸的方法，所述方法包括嗜熱厭氧梭菌的遺傳改造方法和發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)方法。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述嗜熱厭氧梭菌是能夠利用纖維素生產(chǎn)乳酸的梭菌(Clostridium),包括熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)衍生的菌株。
3.按照權(quán)利要求1-2的方法，其特征在于所述遺傳改造方法包括電轉(zhuǎn)化、基因敲除和基因異源表達(dá)的方法。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其所述電轉(zhuǎn)化的方法是基于專利201110048349.9描述的方法進(jìn)行的。
5.按照權(quán)利要求3的方法，其所述基因敲除的方法是基于同源重組的原理進(jìn)行的。
6.按照權(quán)利要求1-5的方法，其所述基因敲除的方法是通過構(gòu)建pHK系列質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)宿主細(xì)胞中進(jìn)行的。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其所述的pHK系列質(zhì)粒包括pHKOl和pHK02，以及按照本發(fā)明所描述構(gòu)建方法以PHKOl和pHK02為基礎(chǔ)構(gòu)建的其他質(zhì)粒。
8.按照權(quán)利要求1-5的方法，其所述基因表達(dá)的方法是通過構(gòu)建pEK系列質(zhì)粒以及 PEM系列質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)宿主中進(jìn)行的。
9.按照權(quán)利要求8的方法，其所述的pEK系列質(zhì)粒包括pEKOl和pEK02，以及按照本發(fā)明所描述構(gòu)建方法以PEKOl和pEK02為基礎(chǔ)構(gòu)建的其他質(zhì)粒。
10.一種能利用木質(zhì)纖維素制備L-乳酸的菌株CT-ak/ldh，其特征是按照權(quán)利要求1-9 的任意一項(xiàng)方法構(gòu)建的。
11.按照權(quán)利要求10的改造菌株進(jìn)行遺傳改造的應(yīng)用，其特征在于所述方法包括a)選定Cthe_1028(ak)作為敲除對(duì)象b)選定Idh和PpFbFP作為異源表達(dá)的對(duì)象c)構(gòu)建敲除載體和表達(dá)載體d)通過電轉(zhuǎn)化向野生菌株導(dǎo)入敲除載體，獲得突變株e)通過電轉(zhuǎn)化向突變株導(dǎo)入表達(dá)載體，獲得改造菌株CT-ak/ldh。
12.按照權(quán)利要求10-11的改造菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其特征在于所述方法包括a)所用的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方為“KH2P041.0-1.5g/L，K2HP044.0-10 . 0g/L，氮源 3. 0-7. 0g/L, MgCl2 · 6H201. 0-5. Og/L, CaCl2 · 2H20 50_250mg/L，F(xiàn)eSO4 · 6H20 0. 5-2. 5mg/ L, cysteine hydrochloride1. 0-5. Og/L, resazurin1. 0-10. Omg/L,碳源 10. 0-40. Og/ L, morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)5. 0-.20. Og/L, yeast extract 5. 0_20g/L, sodiumcitrate · 2H20 0. 2-1. 5g/L”。滅菌前調(diào)節(jié) pH 為 7. 0-8. 5。b)所用的碳源為纖維素質(zhì)生物質(zhì)，包含但不限于秸桿，木菊。c)所用的氮源為有機(jī)或無機(jī)氮源，包含但不限于尿素，酵母提取物，蛋白胨，玉米漿，硝酸鈉，谷氨酸鈉。d)所用的發(fā)酵條件為“溫度50-65°C，厭氧，罐壓為0.05-0. 5MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為 30-100rpm, pH恒定為7. 0-7. 5左右，發(fā)酵時(shí)間為24_48h”。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征是所述發(fā)酵的方式分批發(fā)酵，補(bǔ)料-分批發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù)發(fā)酵。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用木質(zhì)纖維素制備L-乳酸的方法。本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用一株改造的厭氧梭菌菌株降解木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法。本發(fā)明首次利用遺傳改造的嗜熱厭氧梭菌菌株用于整合生物加工(Consolidated Bioprocessing，CBP)技術(shù)，以木質(zhì)纖維素為底物發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，從而大大降低乳酸生產(chǎn)成本，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/74GK103031348SQ201110295619
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2011年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月8日
發(fā)明者崔球, 劉亞君, 洪偉, 崔古貞, 朱新術(shù) 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所