專利名稱：鑒定h3亞型禽流感病毒的pcr引物對及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種鑒定H3亞型禽流感病毒的PCR引物對及其應用。
背景技術：
禽流感是由禽流感病毒引起的禽類病毒性傳染病。H3亞型禽流感病毒是流行于水禽的主要亞型之一；近年來發現我國大部分地區雞群存在H3亞型流感病毒的血清陽性抗體，且有從雞群中分離到H3亞型禽流感病毒的報道，說明H3亞型禽流感病毒已經感染雞， 并進入雞群；此外，流行病學調查顯示，H3亞型禽流感病毒與雞群中的主要流行亞型(H5和 H9亞型)病毒發生了基因交換產生了新型流感病毒，并引起雞群發病；而且，H3亞型禽流感病毒曾經是人間流感大流行毒株的供體。因此，建立一種針對H3亞型禽流感病毒的檢測試劑，既可滿足水禽和雞群禽流感病毒監測的需要，又可為人間流感大流行的預警提供一種有效的檢測方法。傳統的檢測方法，如病毒分離、血凝抑制試驗等，費時、費力，不能做出快速而及時的診斷。現代的分子生物學診斷技術能從分子水平揭示多種疾病，如高致病性禽流感，也能從分子水平揭示潛在高致病性禽流感毒株的差異，從而實現早期而快速地診斷疾病。目前還沒有一種針對H3亞型禽流感病毒進行檢測的PCR引物及方法，以用于流感病毒的流行病學監測和診斷。

發明內容
本發明的目的是提供一種鑒定H3亞型禽流感病毒的PCR引物對及其應用。本發明所提供的PCR引物對，是由兩條單鏈DNA組成，所述兩條單鏈DNA是序列表中序列1所示的單鏈DNA和序列表中序列2所示的單鏈DNA。本發明所提供的PCR引物對可用于制備診斷或輔助診斷H3亞型禽流感的試劑或試劑盒，或用于制備鑒定或輔助鑒定H3亞型禽流感病毒的試劑或試劑盒。含有所述PCR引物對的試劑或試劑盒均屬于本發明的保護范圍。上述PCR引物對的制備方法也屬于本發明的保護范圍。該制備方法具體可包括將所述PCR引物對中所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。所述鑒定或輔助鑒定H3亞型禽流感病毒的試劑盒的制備方法也屬于本發明的保護范圍。該制備方法具體可包括如下步驟將所述PCR引物對中所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種物質包裝在同一試劑盒內DNA聚合酶和4種dNTP(dATP， dTTP, dCTP 和 dGTP)。本發明所提供的PCR引物對可檢測H3亞型禽流感病毒，尤其適合檢測H3N8亞型的禽流感病毒。本發明所提供的PCR引物對可檢測不同來源的H3亞型禽流感病毒，尤其適合檢測鴨源的H3亞型禽流感病毒。本發明所提供的引物對用于檢測H3亞型禽流感病毒的特異性高，靈敏度可達1EID5(I/I00yl，與病毒分離和血凝抑制實驗等常規實驗方法的鑒定結果相比的符合率為 100% ；不僅可以對待測病禽的口腔拭子、泄殖拭子進行檢測，還可檢測病禽尿囊液，操作簡單、容易推廣，便于基層操作和應用，可成為H3亞型禽流感病毒疫病診斷和流行病學調查的有用檢測工具。


圖1為引物對H3V的特異性檢測。其中，M為Maker，1-6分別為感染H3亞型禽流感病毒 A/Duck/BeiJing/33/2004、A/Duck/BeiJing/40/2004、A/Duck/BeiJing/44/2004、 A/Duck/BeiJing/56/2005、A/Duck/BeiJing/59/2005 和 A/Duck/BeiJing/61/2005 的樣品，7-19分別為感染H5m亞型禽流感病毒A/Chicken/Huabei/202/2010、H5N1亞型禽流胃__ A/tree sparrow/Jiangsu/l/2008> H5N1 MMA/Duck/Huabei/7/2009> H9N2 亞型禽流感病毒 A/Quail/HongKong/Gl/1997、H9N2 亞型禽流感病毒 A/Chicken/ Beijing/3/1999、H9N2 亞型禽流感病毒 A/Duck/ShangDong/2CP/2010、H4N6 亞型禽流感病毒 A/Duck/ShangDong/1/2010、H6N1 亞型禽流感病毒 A/Duck/Bei jing/1/2003、新城疫病毒HG/Beijing/2009、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、呼腸孤病毒 (REO)的樣品，19為陰性雞胚尿囊液對照。圖2為引物對H3V的敏感性測定。其中，1-7分別為不同稀釋度的H3亞型禽流感病毒含量樣品，依次為 1 X 104EID50/100 μ 1U X 103EID50/100 μ 1U χ io2eid50/ioo μ 1, 10EID50/100 y 1、1ΕΙΕ)50/100 μ 1、1 X 1(^EID50/100 μ 1、1 X 1(T2EID5Q/100 μ 1，8 為陰性雞胚尿
囊液對照。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例所使用的病毒毒株信息如表1所示實施例1、PCR引物對設計根據Η3亞型禽流感病毒HA基因的高度保守區域基因設計引物對H3V:上游引物 H3-622F :5，-TTCACCACCCGAGCACAA-3，(序列表序列 1 序列)；下游引物 H3-837R 5，-GGGCGATTAGGTTTCCATTA-3，(序列表序列2序列)；退火溫度為51°C ；引物對H3V的靶序列為 Genbank EU492531 的第 622-639 位和第 818-837 位。實施例2、PCR引物對的特異性檢測
1、總RNA提取及質量控制分別取感染 H3 亞型禽流感病毒 A/Duck/BeiJing/33/2004、A/Duck/ Beijing/40/2004, A/Duck/BeiJing/44/2004, A/Duck/BeiJing/56/2005, A/Duck/ Beijing/59/2005 或 A/Duck/BeiJing/61/2005(Pu，J.，Liu, Q. F.，Xia, Y. J.，Fan, Y. L.， Brown, E. G. , Tian,F.L. and Liu,J. H. ,2009. Genetic analysis of H3subtype influenza viruses isolated from domestic ducks in northern China during 2004-2005. Virus Genes 38，136-42.)的雞胚尿囊液和感染類似H3亞型禽流感病毒的H5m亞型禽流感病毒 A/Chicken/Huabei/202/2010、H5N1 亞型禽流感病毒 A/tree sparrow/Jiangsu/l/2008(Liu, Q. ， Ma, J. ， Kou, Z. ， Pu, J. ， Lei, F. ， Li, T. and Liu, J. ,2010b. Characterization of a highly pathogenic avian influenza H5Nlclade 2.3.4virus isolated from a tree sparrow. Virus Res 147, 25-9.) > H5N1A/Duck/
Huabei/7/2009、H9N2 亞型禽流感病毒 A/Quail/HongKong/Gl/1997、H9N2 亞型禽流感病毒 A/Chicken/Bei jing/3/1999 (Sun，Y.，Pu, J.，Jiang, Ζ.，Guan, Τ.，Xia, Y.，Xu, Q.，Liu, L. , Ma, B. , Tian, F. , Brown, Ε. G. and Liu, J. , 2010. Genotypic evolution and antigenic drift of H9N2influenza viruses in China from 1994to 2008.Vet Microbiol 146， 215-25.)、H9N2 亞型禽流感病毒 A/Duck/ShangDong/2CP/2010、H4N6 亞型禽流感病毒 A/ Duck/ShangDong/1/2010、H6N1 亞型禽流感病毒 A/Duck/Bei jing/1/2003、新城疫病毒 HG/ Bei jing/2009 (Rui, Ζ. , Juan, P. , Jingliang, S. , Jixun, Ζ. , Xiaoting, W. , Shouping, Ζ., Xiaojiao, L. and Guozhong, Ζ. ,2010a. Phylogenetic characterization of Newcastle disease virus isolated in the mainland of China during 2001-2009. Vet Microbiol 141,246-57.)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)或呼腸孤病毒(REO) 的雞胚尿囊液及陰性雞胚尿囊液，分別提取總RNA (方法同實施例4)。用核酸蛋白分析儀 BioPhotometer測定其OD值，得出其濃度與純度值，并以此控制核酸質量。2、反轉錄合成cDNA用反轉錄試劑盒(K1622，Fermentas)分別將步驟1的總RNA樣品進行反轉錄，得到cDNA ；DEPC水作為總RNA的對照。反應體系 QOyL) 1 μ L Oligo 引物(20pmol/μ L)，4 μ L Reaction (5 X)， 1 μ LRibolock Rnase Inhibitor (20U/μ L), 2 μ L IOmM dNTP Mix, 1 μ L RevertAid M-MuLVReverse Transcriptase (200U/ μ L)，650ng 總 RNA, DEPC 7jC卒卜足至 20 μ L。反應條件加完DEPC水(提取的RNA溶解其中)和oligo引物后，瞬離，65°C 5min 后立即冰浴。加完其余五樣后，瞬離，37°C讓，再70151^11，41保存。3、PCR擴增檢測引物對的特異性以弓丨物對H3V為引物，對步驟2得到的cDNA樣品進行PCR擴增。反應體系(25yL) :12. 5yL2XMIX buffer (AS111，北京全式金生物技術有限公司，其成分為fesyTaq DNA聚合酶、dNTPs及反應緩沖液)，濃度為20pmol/ μ L序列表序列 1引物0. 5 μ L，濃度為20ρπιο1/μ L序列表序列2引物0. 5μ L，cDNA 2 μ L，DEPC水補足至 25 μ L，每個cDNA設置2個重復。反應程序94°C5min ；94°C 30s ；51°C 45s ；72°C 45s，從第二步開始進行 30 個循環，72°C IOmin ；4°C Ih0電泳取PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳(結果如圖1所示)，A/Duck/ Beijing/33/2004, A/Duck/BeiJing/40/2004, A/Duck/BeiJing/44/2004, A/Duck/ Beijing/56/2005,A/Duck/BeiJing/59/2005 和 A/Duck/BeiJing/61/2005 感染的雞胚尿囊液樣品中均得到一條大小在200-300bp之間的PCR產物條帶，經測序得知該條帶的大小均為216bp。陰性雞胚尿囊液及H5W亞型禽流感病毒、H9N2亞型禽流感病毒、H4N6亞型禽流感病毒、H6N1亞型禽流感病毒、新城疫病毒、IBV、IBDVJP REO感染的雞胚尿囊液樣品中在 200-300bp之間無PCR產物條帶。結果表明，引物對H3V的特異性很好，可以特異檢出H3亞型禽流感病毒。
實施例3、PCR引物對的靈敏度檢測1、總RNA提取和各個稀釋液的制備取感染H3亞型禽流感病毒A/Duck/Bei jing/40/2004的雞胚尿囊液，采用 Reed-Muench法進行病毒EID5tl的測定，獲得此H3亞型禽流感病毒在雞胚尿囊液中的含毒量。根據此病毒含量，用無菌PBS將此雞胚尿囊液稀釋為病毒濃度為106EID5(1/100 μ 1 (如雞胚尿囊液的病毒濃度為l(fEID5(l/100y 1，則進行10倍稀釋(107/106 = 10))，然后在此基礎上進行10倍倍比稀釋，各個稀釋液中，病毒含量分別為105EID5Q/100y l、104EID5Q/100y 1、 103EID50/100 y 1、102EID5(I/100 μ 1、Io1EID5ciZioo μ U10°EID50/100 y 1、Kr1EID5cZlOO μ 1、 10"2EID50/100 μ 1。測定病毒濃度在104EID5Q/100 μ 1-10"2EID50/100 μ 1之間樣品的檢測敏感性。取104EID5(1/100 μ 1-10-2EID50/100 μ 1之間各稀釋度的尿囊液樣品，分別提取總RNA(總 RNA提取方法同實施例4)。2、反轉錄合成cDNA用反轉錄試劑盒(K1622，i^rmentaS)分別將各個稀釋液中提取的總RNA進行反轉錄，得到cDNA ；陰性雞胚尿囊液的反轉錄產物作為總RNA的對照。反應體系 ΟΟμ 1 μ L Oligo 引物(20pmol/μ L)，4 μ L Reaction (5 X), 1 μ L Ribolock Rnase Inhibitor(20U/μ L),2 μ L IOmM dNTP Mix,1 μ L RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200U/ μ L), 11 μ L RNA, DEPC 7_Κ卒卜足至 20 μ L。反應條件加完DEPC水(提取的RNA溶解其中)和oligo引物后，瞬離，65°C 5min 后立即冰浴。加完其余五樣后，瞬離，37°C讓，再70151^11，41保存。3、PCR擴增檢測引物對的靈敏度以弓丨物對H3V為引物，對步驟2得到的cDNA樣品進行PCR擴增。反應體系(25yL) :12. 5yL2XMIX buffer (AS111，北京全式金生物技術有限公司，其成分為fesyTaq DNA聚合酶、dNTPs及反應緩沖液)，濃度為20pmol/ μ L序列表序列 1引物0. 5 μ L，濃度為20ρπιο1/μ L序列表序列2引物0. 5μ L，cDNA 2 μ L，DEPC水補足至 25 μ L，每個cDNA設置2個重復。反應程序94°C5min ；94°C 30s ；51°C 45s ；72°C 45s，從第二步開始進行 30 個循環，72°C IOmin ；4°C Ih0電泳取PCR產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳(結果如圖2所示)，1EID50/100 μ 1及以上病毒濃度樣品的總RNA中可觀察到216bp的擴增條帶。結果表明，引物對H3V的檢測靈敏度可達1ΕΠ)5(1/100μ 1，即檢測樣本病毒含量的下限為1EID5(1/I00y 1。實施例4、PCR引物對的符合率檢測以經過病毒分離、血凝抑制試驗等常規實驗方法鑒定為Η3亞型禽流感病毒A/ Duck/Beijing/40/2004感染的雞的組織樣品以及從活禽市場采集的380份健康雞和鴨的咽拭子及糞便棉拭子樣品為檢測樣品，以健康雞的肺組織樣品為陰性對照，PBS為空白對照，以H3亞型禽流感病毒A/Duck/Bei jing/40/2004感染的雞胚尿囊液為陽性對照，提取總 RNA,反轉錄后，以引物對H3V為引物進行PCR反應，過程如下1、樣品的采集和處理雞的組織樣品取肺的組織；雞和鴨的棉拭子咽拭子、泄殖腔拭子；2_8°C保存， 送實驗室檢測。要求送檢樣品新鮮。
2、樣本液的制備(1)組織樣品稱取IOOmg組織樣品置研磨器中，加入0.8ml裂解液(硫氰酸胍， 0. 8M ；硫氰酸銨，0. 4M ；醋酸鈉緩沖液，0. IM ；甘油5%和苯酚38%，混勻)研磨，把研磨好的組織樣品移至1. 5ml離心管中，4°C 8000rpm離心5min，取上清250 μ 1，置于1. 5ml滅菌離心管中，加入750μ 1上述裂解液，劇烈振蕩混勻，室溫放置5min。(2)棉拭子樣品將浸液中的棉拭子充分捻動，擰干后棄去拭子，4°C SOOOrpm離心 5min，取上清液250μ 1，置于1.5ml滅菌離心管中，加入750 μ 1裂解液(硫氰酸胍，0. 8Μ ； 硫氰酸銨，0. 4Μ ；醋酸鈉緩沖液，0. IM ；甘油5%和苯酚38%，混勻)，劇烈振蕩混勻，室溫放置 5min。(3)陰性對照(PBS)取滅菌雙蒸水250μ1，置于1.5ml滅菌離心管中，加入 750 μ 1裂解液(硫氰酸胍，0. 8Μ ；硫氰酸銨，0. 4Μ ；醋酸鈉緩沖液，0. IM ；甘油5%和苯酚 38 %，混勻)，劇烈振蕩混勻，室溫放置5min。3、總 RNA 提取1)取處理后的樣本液(雞胚尿囊液無需處理即可作為樣本液)300 μ 1，加 900ulTRIZ0L (15596-018，hvitrogen)，輕輕顛倒混勻數次，冰浴 IOmin02)加 200 μ 1 氯仿，顛倒混勻 15s，冰浴 5min，4°C離心，13000r/m, 15min。3)取700ul上清移入新的離心管，加入等量的異丙醇，輕輕顛倒混勻，混勻后，4°C 離心，13000r/m, 15min。4)棄上清，貼壁緩緩加Iml 75% DEPC處理過的酒精，加完后輕轉兩圈。5)4°C，13000r/m，5min。6)倒上清，置于冰上風干5-lOmin。7)用 15 μ L DEPC 水和 1 μ L RNA 酶抑制劑(200U/ μ L, #kl622, Fermentas)溶解沉淀，即用或_80°C保存備用。4、反轉錄用反轉錄試劑盒(K1622，Fermentas)分別將步驟3獲得的總RNA樣品進行反轉錄，得到cDNA ；DEPC水作為總RNA的對照。反應體系 ΟΟμ 1 μ L Oligo 引物(20pmol/μ L)，4 μ L Reaction (5 X), 1 μ L Ribolock Rnase Inhibitor(20U/μ L),2 μ LlOmM dNTP Mix,1 μ L RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200U/ μ L), 11 μ L RNA, DEPC 7_Κ卒卜足至 20 μ L。反應條件加完DEPC水(提取的RNA溶解其中)和oligo引物后，瞬離，65°C5min 后立即冰浴。加完其余五樣后，瞬離，37°C lh，再70°C 5min，4°C保存。5、PCR 檢測反應體系(25yL) :12. 5yL2XMIX buffer (AS111，北京全式金生物技術有限公司，其成分為fesyTaq DNA聚合酶、dNIPs及反應緩沖液)，濃度為20pmol/μ L序列表序列1引物0. 5 μ L，濃度為20ρπιο1/μ L序列表序列2引物0. 5 μ L，2 μ LcDNA，DEPC水補足至 25 μ L，每個cDNA設置2個重復。反應程序94°C5min ；94°C 45s ；51°C 45s ；72°C 45s，從第二步開始進行 30 個循環，72°C IOmin ；4°C lh。6、電泳
取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。結果陽性對照可觀察到216bp擴增帶，空白對照和陰性對照無此擴增帶，10個H3亞型禽流感病毒感染的雞的組織樣品全部呈陽性； 380個雞和鴨的咽拭子和糞便拭子樣品中檢測到1個呈陽性；上述檢測結果與病毒分離和血凝抑制實驗等常規實驗方法的鑒定結果相比的符合率為100%。
權利要求
1.鑒定或輔助鑒定H3亞型禽流感病毒的PCR引物對，它由兩條單鏈DNA組成，其特征在于所述兩條單鏈DNA是序列表中序列1所示的單鏈DNA，和序列表中序列2所示的單鏈 DNA。
2.權利要求1所述的PCR引物對在制備診斷或輔助診斷H3亞型禽流感試劑或試劑盒中的應用。
3.權利要求1所述的PCR引物對在制備鑒定或輔助鑒定H3亞型禽流感病毒試劑或試劑盒中的應用。
4.鑒定或輔助鑒定H3亞型禽流感病毒的PCR試劑，其特征在于所述PCR試劑中含有權利要求1所述的PCR引物對。
5.鑒定或輔助鑒定H3亞型禽流感病毒的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中含有權利要求4所述的PCR試劑。
6.權利要求1所述的PCR引物對的制備方法，其特征在于所述制備方法包括將權利要求1所述的PCR引物對中所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
7.權利要求5所述的試劑盒的制備方法，包括如下步驟將權利要求1所述的PCR引物對中所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種物質包裝在同一試劑盒內DNA聚合酶和下述4種dNTP :dATP，dTTP, dCTP和dGTP。
全文摘要
本發明公開了一種鑒定H3亞型禽流感病毒的PCR引物對及其應用。本發明所提供的PCR引物對是由兩條單鏈DNA組成，所述兩條單鏈DNA是序列表中序列1所示的單鏈DNA和序列表中序列2所示的單鏈DNA。本發明所提供的引物對用于檢測H3亞型禽流感病毒的特異性高，靈敏度可達1EID50/100μl，與病毒分離和血凝抑制實驗等常規實驗方法的鑒定結果相比的符合率為100％；不僅可以對待測病禽的口腔拭子、泄殖拭子進行檢測，還可檢測病禽尿囊液，操作簡單、容易推廣，便于基層操作和應用，可成為H3亞型禽流感病毒疫病診斷和流行病學調查的有用檢測工具。
文檔編號C12R1/93GK102304591SQ20111030217
公開日2012年1月4日 申請日期2011年10月8日 優先權日2011年10月8日
發明者劉金華, 包靜楠, 唐慶冬, 孫洪磊, 王金亮, 蒲娟 申請人:中國農業大學