專利名稱：離子液體中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制備方法
技術領域：
本發明涉及生化制藥領域，具體涉及離子液體中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制備方法。
背景技術：
咖啡酸苯乙酯，英文名稱Caffeic acid phenethyl ester (CAPE)，化學名稱: 2-苯乙基-3-(3，4-二羥苯基)-2-丙烯酸酯，分子式=C17H16O4,分子量284. 31。咖啡酸苯乙酯是蜂膠、紅景天等天然產物中的主要功能成分，經藥理實驗證明其能夠阻斷中性粒細胞中活性氧化物質的產生、阻斷黃嘌呤氧化酶系統、能夠抑制機體內NO的增加，還能抑制腫瘤細胞增生(Biol. Pharm. Bull, 2003, 26 (4) :487-491)，是國際上各大醫藥公司競相開發的輔助藥物或藥物有效成分。制備咖啡酸苯乙酯的方法主要有提取和化學合成兩種方法(Journal of Biotechnology, 2010,148 :133-138) :(1)咖啡酸苯乙酯在自然界中的含量相當少，在咖啡酸苯乙酯含量最高的中國蜂膠中，其含量一般在5 25mg/g。直接從天然植物中提取的難度太大，且制得的咖啡酸苯乙酯的純度低；( 有機溶劑為反應介質、以傳統的酸作為催化劑的酯化合成法具有反應副產物多、對設備的腐蝕性強、產品分離過程復雜以及易揮發溶劑氣體對環境污染大等缺點(Journal of Molecular catalysis A :chemical, 2005, 234 107-110)。因此，急需尋求一種新型的反應介質及其催化劑來解決咖啡酸苯乙酯制備方法的以上技術缺陷。與傳統的催化劑相比，選擇脂肪酶作為酯化合成咖啡酸苯乙酯的催化劑具有其得天獨厚的優勢(1)脂肪酶對酯化反應具有專一性，避免了反應產生的副產物，使得反應產物的分離純化得到簡化；(2)由于酶具有高效性，能夠大大提高酯化反應的速率，從而提高咖啡酸苯乙酯的得率；C3)脂肪酶催化化學反應的反應條件相對溫和，對設備的腐蝕大大降低；(4)跟傳統的以酸作為催化劑相比較，脂肪酶不會揮發，對環境友好等(Process Biochemistry, 2009,44 :1358-1365)。因此，以脂肪酶作為反應催化劑、以咖啡酸和苯乙醇直接酶法合成咖啡酸苯乙酯不失為一種高效的制備方法。然而，雖然這種制備方法具有上述優點，但是傳統反應介質有機溶劑帶來的諸如對底物溶解度不高、揮發性溶劑對環境污染大等問題并沒有得到解決。離子液體作為一種新型的反應介質，具有傳統反應介質所不具備的一些優越特性。首先，離子液體的蒸汽壓極低，難以揮發，對環境幾乎沒有污染；其次，離子液體具有優良的熱穩定性，在反應需要的較高溫度條件下仍然能搞保護酶的活性以及反應的順利進行；再次，疏水作用的離子液體能夠與反應形成的水形成兩相，從而推動酯化反應向生成產物咖啡酸苯乙酯的方向進行；同時，還能夠保證脂肪酶分子的空間結構正常分布，保證酶具有正常的活性；此外，離子液體的最大特點是具有可重塑性，即可以根據反應底物的極性以及疏水性來調節陰、陽離子的結合，從而最大限度的增大反應底物的溶解度以及互溶度，從而提高反應的速率(Journal of Molecular Catalysis B :Enzymatic，2010，65 :68-72)。然而，以離子液體為反應介質的酶促合成咖啡酸苯乙酯尚未見報道。因此，本專利旨在建立以離子液體為反應介質，以脂肪酶為催化劑，通過酯化合成的方法來制備咖啡酸苯乙酯。該方法操作簡便，反應條件溫和，產物得率高，對環境友好，從而可以克服傳統的脂肪酶催化合成效率較低和底物溶解度較低的缺點，易于大量制備高純度咖啡酸苯乙酯，為推動其在醫藥工業中的廣泛應用具有十分重要的意義。

發明內容
技術問題為解決以上缺陷，本發明提供了一種在新型的反應介質——離子液體中由咖啡酸和苯乙醇酯化制備咖啡酸苯乙酯的方法，以有效提高底物濃度、提高產物收率以及縮短反應時間。技術方案離子液體中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制備方法，按照摩爾比苯乙醇咖啡酸=1 50 1的比例配制反應體系，按照質量比脂肪酶咖啡酸=1 200 1的比例加入脂肪酶，按照體積比離子液體苯乙醇=10 500 1的比例加入離子液體，在反應溫度10 100°C、振蕩轉速50 200rpm的條件下進行酯化反應10 150h。上述方法中，還可以按照質量比抗氧化劑咖啡酸=5 100 1的比例加入抗氧化劑。所述離子液體的陽、陰離子類型組合包括陽離子類型為[anim]、[Hmim]、[Nmim]、 [Τ0ΜΑ]或[Omim]，陰離子類型為[PF6]、[Tf2N]、[BF4]、[HSO4]或[Cl]，上述陰、陽離子配合而成離子液體。所述脂肪酶為微生物、動物、或植物來源的游離脂肪酶或固定化脂肪酶。所述脂肪酶微生物來源為假絲酵母Candida sp. (Candida antarctica、 Candida rugosa)、曲霄 Aspergillus sp. (Aspergillus niger、Aspergillus oryzae)、 青霉 Penicillium sp. (Penicillium camemberti、Penicillium roqueforti) > 根毛霄 Rhizomucor sp. (Rhizomucor miehei)、嗜熱真菌 Thermomyces sp. (Thermomyces lanuginosus)、毛 β Mucor sp. (Mucor javanicus)、芽 3 If 菌 Bacillus sp. (Bacillus subtilis)、 假單胞菌 Pseudomonas sp. (Pseudomonas cepacia、Pseudomonas f luorescens)、色桿菌 Chromobacterium sp. (Chromobacterium viscosum)、伯克氏菌 Burkholderia sp. (Burkholderia cepacia)等。所述脂肪酶動物來源為豬、狗、牛、羊、馬、兔、鼠、雞、鴨、鵝等動物胰臟組織。所述脂肪酶植物來源為蓖麻、油菜、油茶、光皮樹、黃連木、麻風樹、文冠果等油料作物種子。所述的抗氧化劑為ΒΗΤ、AHT、抗壞血酸及其酯類或沒食子酸及其酯類。有益效果在酶促合成咖啡酸苯乙酯的體系中選擇合適的離子液體作為反應介質來強化合成效率，該方法反應條件溫和，產物得率高，對環境友好，克服了以有機溶劑為反應介質催化合成效率較低和底物溶解度較低的缺點，易于大量制備咖啡酸苯乙酯。此外，整個酶促反應工藝基本上無廢棄物產生，無環境污染，具有非常良好的工業化應用前景，可以滿足迅速發展的醫藥工業的需要。


圖1離子液體中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的反應式。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。檢測酶促合成咖啡酸苯乙酯體系的高效液相色譜條件為色譜柱采用 250mmX4. 6mm 的 Alltima Cw 柱，流動相為乙腈冰醋酸(0. 5% ) (V V) = 50 50，流速為lmL/min，柱溫為30°C，檢測波長為325nm，進樣量為20 μ L。其中，產物咖啡酸苯乙酯的轉化率計算方法為
權利要求
1.離子液體中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制備方法，其特征在于按照摩爾比苯乙醇咖啡酸=1 50 1的比例配制反應體系，按照質量比脂肪酶咖啡酸=1 200 1的比例加入脂肪酶，按照體積比離子液體苯乙醇=10 500 1的比例加入離子液體，在反應溫度10 100°C、振蕩轉速50 200rpm的條件下進行酯化反應10 150h。
2.根據權利要求1所述離子液體中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制備方法，其特征在于按照質量比抗氧化劑咖啡酸=5 100 1的比例加入抗氧化劑。
3.根據權利要求1所述離子液體中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制備方法，其特征在于所述離子液體由下述陽離子和陰離子配合而成，其中陽離子類型為[anim]、[Hmim]、 [Nmim]、[Τ0ΜΑ]或[Omim]，陰離子類型為[PF6]、[Tf2N]、[BF4]、[HSO4]或[Cl]。
4.根據權利要求1所述離子液體中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制備方法，其特征在于所述脂肪酶為微生物、動物或植物來源的游離脂肪酶及其固定化脂肪酶。
5.根據權利要求4所述離子液體中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制備方法，其特征在于所述脂肪酶微生物來源為假絲酵母Candida sp.、曲霉Aspergillus sp.、青霉 Penicillium sp.、根毛霉Rhizomucor sp.、嗜熱真菌Thermomyces sp.、毛霉Mucor sp.、芽孢桿菌Bacillus sp.、假單胞菌Pseudomonas sp.、色桿菌Chromobacterium sp.或伯克氏菌Burkholderia sp.。
6.根據權利要求4所述離子液體中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制備方法，其特征在于所述脂肪酶動物來源為豬、狗、牛、羊、馬、兔、鼠、雞、鴨或鵝的動物胰臟組織。
7.根據權利要求4所述離子液體中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制備方法，其特征在于所述脂肪酶植物來源為蓖麻、油菜、油茶、光皮樹、黃連木、麻風樹或文冠果的油料作物種子。
8.根據權利要求1所述離子液體中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制備方法，其特征在于所述的抗氧化劑為BHT、AHT、抗壞血酸及其酯類或沒食子酸及其酯類。
全文摘要
離子液體中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制備方法，在選擇離子液體為反應介質中酶促合成咖啡酸苯乙酯，提高底物在反應介質中的溶解度，提高脂肪酶的熱穩定性及其對底物的立體選擇性。該方法操作簡便，反應條件溫和，產物得率大大提高，對環境友好，克服了傳統脂肪酶催化合成效率低和底物溶解度低的缺點，有利于規模化制備咖啡酸苯乙酯。
文檔編號C12R1/66GK102321692SQ20111030222
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月27日 優先權日2011年9月27日
發明者吳福安, 張磊霞, 李晶, 王俊, 郭錫杰, 顧雙雙 申請人:江蘇科技大學