專利名稱：結核患者血清IgG抗體適配子及其制備方法
技術領域：
本發明屬微生物感染免疫和檢驗領域，涉及一種血清IgG (免疫球蛋白G)抗體的適配子及其制備方法，尤其涉及一種結核患者血清IgG抗體適配子及其制備方法。
背景技術：
結核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis)感染人體導致的結核病是一種嚴
重危害人民身體健康的慢性傳染病。結核病是歷史上患病率和死亡率最高的疾病之一。上
世紀50年代以來，結核病的流行在一定程度上得到了控制。我國是結核病高負擔國家，國
務院已確定結核病為我國三大重點防治傳染病之一。因此，加強對結核病的研發力度，亟待
研制新型抗結核新藥，以便對該病進行有效的治療和預防，具有很大的研究價值和社會效益。目前結核病控制存在的最主要的問題是病人發現率低、治愈率低。在診斷方面，現有的檢查方法均存在著一定的局限，難以達到快速、準確的結核病診斷。在治療方面，常規的化療藥物面臨著巨大的挑戰，現有的藥物已很難應對不斷出現的耐多藥臨床菌株，治愈率難以提高。近40余年來，尚無新的高效抗結核藥物問世。因此，加大結核分枝桿菌的基礎研究，尋找快速、靈敏、簡便、實用的結核病診斷新方法，提高結核病人的檢出率，以及尋找新的治療方法或者開發新的抗結核藥物，是目前結核病研究需要迫切解決的問題。但現代結核病癥狀交叉、隱蔽，導致漏診、誤診時有出現。臨床對肺結核的診斷方法提出更高要求。常規方法的抗酸染色鏡檢查抗酸桿菌陽性率低，培養結果雖可靠，但耗時長，需3 8周，且陽性率也低。結核菌素試驗的影響因素較多，存在假陰性等問題?；顒有越Y核病患者細胞免疫減損而體液免疫亢進，血液及其他體液中結核抗體(主要是IgG)升高，檢測出結核抗體有助于結核病的診斷。結核抗體測定對活動性肺結核診斷具有較高的實用價值。因此，結核IgG抗體可以作為新的抗結核藥物的篩選靶點，與其特異性結合的分子將有可能成為新的抗結核藥物。寡核苷酸適配子技術是近年來發展的一種新型的分子生物學技術，是采用指數級富集配體的系統進化技術(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment, SELEX)篩選獲得的。SELEX技術是20世紀90年代初研制的一種新的組合化學技術，基本原理是運用大容量的隨機寡核苷酸文庫，并結合體外PCR擴增技術，以指數富集與靶分子特異結合的寡核苷酸，并結合體外PCR擴增技術，以指數富集與靶分子特異結合的寡核苷酸，經過多輪篩選，或得高親和力、特異性強的寡核苷酸適配子(aptamers),具有庫容量大、靶分子范圍廣、親和力高等優點，運用范圍十分廣泛。已成功運用于許多靶分子的篩選，包括金屬離子、有機染料、蛋白質、藥物、氨基酸以及各種細胞因子等。已有研究通過SELEX技術篩選到相應靶物質的適配子作為拮抗劑，適用于腫瘤生長時的血管內皮生長因子、血栓生成因子、一些毒素蛋白和促生長因子等，已達到治療目的。在微生物檢測方面，特別是對一些未知的致病性細菌或病毒的研究， 雖然不知道其內部結構、功能以及這些物質的表位，但將其作為靶物質，通過SELEX過程篩選到與其相對應的適配子，檢測靶物質，已成為該領域的研究探索熱點。

發明內容
為了解決上述現有技術中的問題，本發明的目的是提供了一種結核患者血清免疫球蛋白G抗體的DNA適配子及其制備方法。本發明的另一個目的是提供了應用上述適配子檢測結核患者血清的方法。為了實現本發明的目的，本發明的一種結核患者血清免疫球蛋白G抗體適配子，其序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。SEQ ID NO.1 GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-CGCATTTCGCAACACGACTTGGCCAACGTACCTGG -TTCGACATGAGGCCCGGATC
SEQ ID NO. 2 GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-GACCTGGACGTCTTGCGCATAGTGCGGTGGCCCGC -TTCGACATGAGGCCCGGATCSEQ ID NO. 3 GGGAGCTCAGAATAA`ACGCTCAA-CGGTCAACTCGTGTA-TTCGACATGAGGCCCGGATC
上述結核患者血清免疫球蛋白G抗體適配子的制備方法，包括以下步驟
步驟1，構建隨機單鏈寡核苷酸文庫，設計合成78堿基對的隨機單鏈DNA文庫
5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中 N 代表堿基 A、G、C、T中的任意一個，容量為IO14-1O15,并進一步得到純化的單鏈ssDNA文庫用于IgG抗體適配子的SELEX技術篩選；
步驟2，利用適配子技術篩選免疫球蛋白G抗體適配子用包被緩沖液將IgG適配子包被于微孔板中，同時設空白反篩孔及健康人血清反篩孔；ssDNA文庫和SELEX結合緩沖液混勻后先與空白反篩孔進行孵育；然后轉移到IgG抗體包被孔進行孵育，SELEX沖洗緩沖液洗滌，甩干后加入SELEX洗脫緩沖液洗脫與IgG抗體結合的ssDNA，產物經酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化，PCR擴增后，進行10輪篩選，篩選后的飽和文庫，經克隆測序，獲得單個適配子。在本發明的一個較佳實施例中，步驟I中還包括對免疫球蛋白G抗體的純化。在本發明的另一較佳實施例中，所述純化包括按常規方法將結核患者血清過層析柱，并用硫氰酸鉀洗脫。在本發明的另一較佳實施例中，步驟2中使用SELEX結合緩沖液為20mmol/LHepes, 120mmol/LNaCl, 5mmol/LKCl, lmmol/LCaCl2, Immol/LMgCl，所述 SELEX 結合緩沖液的pH值為7. 35。在本發明的另一較佳實施例中，步驟2中使用SELEX沖洗緩沖液為所述SELEX結合緩沖液與O. 05% Tween 20溶液的混合溶液。在本發明的另一較佳實施例中，步驟2中使用SELEX洗脫緩沖液為20 mmol/LTris-HCl, 4 mol/L異硫氰酸胍，ImmoI/L DTT，所述SELEX洗脫緩沖液pH值為8. 3。本發明的結核患者血清IgG抗體DNA適配子親和性、特異性高，制備方法簡便；其用于血清學檢測能顯著提高結核病人陽性檢出率，可用于人及動物結核病的快速、簡便診斷，可以為結核病的實驗室診斷及抗結核治療評估提高有利依據。


圖1是SEQ ID NO.1的IgG抗體DNA適配子的二級結構圖譜；
圖2是SEQ ID NO.1的IgG抗體DNA適配子的二級結構圖譜；
圖3是SEQ ID NO.1的IgG抗體DNA適配子的二級結構圖譜。
具體實施例方式一種結核患者血清免疫球蛋白G (IgG)抗體適配子，其具有SEQ ID NO. USEQ IDNO. 2或SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。一種結核患者血清免疫球蛋白G抗體的DNA適配子的制備方法，包括以下步驟 步驟1，構建隨機單鏈寡核苷酸文庫設計合成78堿基對的隨機單鏈DNA文庫·5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中 N 代表堿基 AGCT中的任意一個，容量為IO14-1O15,并進一步得到純化的單鏈ssDNA文庫用于IgG抗體適配子的SELEX技術篩選；
步驟2，以微孔板為分離介質利用適配子技術篩選免疫球蛋白G抗體適配子用包被緩沖液將IgG適配子包被于微孔板中，同時設空白反篩孔及健康人血清反篩孔；ssDNA文庫和SELEX結合緩沖液混勻后先與空白反篩孔進行孵育；然后轉移到IgG抗體包被孔進行孵育，SELEX沖洗緩沖液洗滌，甩干后加入SELEX洗脫緩沖液洗脫與IgG抗體結合的ssDNA，產物經酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化，PCR擴增后，進行10輪篩選，篩選后的飽和文庫，經克隆測序，獲得單個適配子。本發明將LESEX技術引進結核分枝桿菌的研究領域，以IgG為靶物質，篩選獲得IgG的適配子，為進一步利用適配子技術進行結核分枝桿菌的診斷治療提供依據。應用上述結核患者血清免疫球蛋白G抗體的DNA適配子診斷結核病的方法，選擇IgG適配子或適配子組合構建寡核苷酸酶聯免疫檢測體系。本發明在獲得IgG適配子后，可通過選擇IgG適配子或適配子組合構建寡核苷酸酶聯免疫檢測體系來進行結核患者血清學檢測。已達到快速、準確診斷的目的。在本發明的一個實施例中，一種結核患者血清IgG抗體的DNA適配子的制備方法，包括
步驟1,(1)結核患者血清IgG抗體的純化
用5倍體積的結合緩沖液(O. lmol/LNaHC03、0· 5mol/LNaCl, pH值為8. 3)洗層析柱；10份結核初治患者的血清過層析柱2次，過柱速度稍慢；10倍體積的結合緩沖液洗滌；ImlKSCN(硫氰酸鉀10柱體積，3mol/L，pH值6.1)洗脫；柱子用結合緩沖液洗滌、蒸餾水洗柱、20%酒精洗柱；柱回收至Iml指形管中，4°C保存；洗脫餾分中回收的IgG抗體進行SDS-PAGE膠、Bradford法定量抗體濃度；回收的IgG抗體放_20°C保存待用。(2)構建隨機單鏈寡核苷酸文庫并得到純化的單鏈DNA文庫
構建隨機單鏈寡核苷酸文庫設計合成78堿基對的隨機單鏈DNA文庫
5’ -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’，其中 N 代表堿基 AGCT中的任意一個，容量為IO14-1O15 ;構建上游引物5’-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3’，構建下游引物 5’ -TTCGACATGAGGCCCGGATC-3’。并進一步得到純化的單鏈ssDNA文庫用于IgG抗體適配子的SELEX技術篩選。設計并得到純化的單鏈DNA文庫可以通過一般的PCR (聚合酶鏈式反應)擴增、不對稱PCR法和酚氯仿法純化得到。步驟2，利用適配子技術篩選免疫球蛋白G (IgG)抗體適配子
用包被緩沖液(O. 05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH值9. 6)將IgG適配子包被于微孔板中，同時設空白反篩孔及健康人血清反篩孔；IgG抗體包被孔和反篩孔均以5% BSA(牛血清白蛋白)封閉；ssDNA文庫和SELEX結合緩沖液混勻后先與空白反篩孔于37°C下進行孵育，去除與BSA和微孔板結合的ssDNA ;然后轉移到IgG抗體包被孔于37°C下進行孵育，SELEX沖洗緩沖液洗滌，甩干后加入SELEX洗脫緩沖液于80°C作用lOmin，洗脫與IgG抗體結合的ssDNA，產物經酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化，PCR擴增后，進行下一輪篩選。共進行10輪篩選。在第5、7、8、9、10輪進行以健康人血清為背景的反篩。篩選后的飽和文庫，經克隆測序，獲得單個適配子。該適配子即為能與IgG抗體結合的DNA適配子，其序列為序列1、序列2和序列3，并進行結構分析獲得該適配子的二級結構圖譜(見圖1至圖3)。本發明的實施例所用的SELEX結合緩沖液為20mmol/L Hepes, 120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，lmmol/LCaCl2，Immol/LMgCl，結合緩沖液 pH 值為 7.35 ；SELEX 沖洗緩沖液為SELEX結合緩沖液+0. 05% Tween 20 ;SELEX洗脫緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl,4 mol/L異硫氰酸胍，lmmol/L DTT，洗脫緩沖液的pH值為8. 3。應用本發明IgG抗體的DNA適配子進行血清檢測的方法，包括
選擇具有高親和性的Ig G抗體適配子或適配子組合構建寡核苷酸酶聯免疫檢測體系(enzyme-linked oligonucleotide sorbent assay, EL0SA)用于結核病的血清學檢測。適配子用分光光度計測濃度，并經99°C變性5min，冰浴IOmin進行預處理；處理后的適配子用包被液(0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH值9. 6)稀釋，按照每孔0. μδ的濃度包被酶聯板，包被過程為37°C孵育2h，4°C過夜；然后5% BSA (牛血清白蛋白)37°C下封閉Ih ；
將血清用樣品稀釋液按照1:25的比例稀釋加入，37°C孵育30min ;加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人二抗，37°C孵育30min ;加入PBST洗滌3次，3min/次；
顯色試劑A與顯色試劑B按照1:1的比例混合加入，37°C孵育lOmin，加入終止液終止顯色；加入PBST洗滌3次，3min/次；
利用酶標儀雙波長(450nm和620nm)檢測樣本的吸光度值(A450，A620)。結果判斷進行結果判斷的OD值應為0D450nm與0D630nm的差值。陽性對照每孔OD值彡0. 5 ;陰性對照OD值< 0. 1，否則試驗不成立。臨界值(Cutoff)計算陰性對照平均OD值+ 0. 06 (備注陰性對照OD值低于0. 05，以0. 05計算，高于0. 05按實際值計算)。結果解釋樣品OD值彡臨界值為結核抗體陽性；樣品OD值〈臨界值為結核抗體陰性。本發明的IgG抗體DNA適配子用于血清學檢測能顯著提高結核病人陽性檢出率，可用于人及動物結核病的快速、簡便診斷，可以為結核病的實驗室診斷及抗結核治療評估提聞有利依據。以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發 明的范圍內。
權利要求
1.一種結核患者血清IgG抗體適配子，其序列為SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2或SEQ IDNO. 3所示的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的結核患者血清IgG抗體適配子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟1，構建隨機單鏈寡核苷酸文庫，設計合成如下78堿基對的隨機單鏈DNA文庫5， -gggagctcagaataaacgctcaa-n35-ttcgacatgaggcccggATC-3，， 其中N代表堿基A、G、C、T中的任意ー個，容量為IO14-1O15 ； 步驟2，利用適配子技術篩選免疫球蛋白G抗體適配子。
3.如權利要求2所述的結核患者血清IgG抗體適配子的制備方法，其特征在干，步驟I中還包括對免疫球蛋白G抗體的純化。
4.如權利要求3所述的結核患者血清IgG抗體適配子的制備方法，其特征在于，所述純化包括按常規方法將結核患者血清過層析柱，并用硫氰酸鉀洗脫。
5.如如權利要求2所述的結核患者血清IgG抗體適配子的制備方法，其特征在于，步驟2 的適配子技術中使用了 SELEX 結合緩沖液20mmol/L Hepes, 120mmol/L NaCl, 5 mmol/LKCl，lmmol/LCaCl2, Immol/LMgCl，所述 SELEX 結合緩沖液的 pH 值為1. 35。
6.如如權利要求5所述的結核患者血清IgG抗體適配子的制備方法，其特征在于，步驟2中的適配子技術使用了 SELEX沖洗緩沖液所述SELEX結合緩沖液與0. 05% Tween 20溶液的混合溶液。
7.如如權利要求2所述的結核患者血清IgG抗體適配子的制備方法，其特征在于，步驟2中的適配子技術使用了 SELEX洗脫緩沖液20mmol/L Tris-HCl, 4mol/L異硫氰酸胍，lmmol/L DTT,所述SELEX洗脫緩沖液pH值為8. 3。
全文摘要
本發明提供了一種結核患者血清IgG抗體適配子，其序列為SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的核苷酸序列及其制備方法。本發明的結核患者血清IgG抗體DNA適配子親和性、特異性高，其用于血清學檢測能顯著提高結核病人陽性檢出率，可用于人及動物結核病的快速、簡便診斷，可以為結核病的實驗室診斷提供有利依據。
文檔編號C12N15/115GK103045600SQ201110305110
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月11日 優先權日2011年10月11日
發明者秦蓮花, 胡忠義, 楊華, 劉忠華, 蔡江麗 申請人:上海市肺科醫院