專利名稱：一種用磁性微粒從含微量核酸的樣本中純化dna的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用磁性納微米材料純化DNA的方法。
背景技術：
核酸提取是許多分子生物學技術中的關鍵步驟，由于對純度、完整性等要求，其提取方法尤為重要。而隨著法醫學、基因組等學科的高速發展，法醫DNA檢驗不僅為法醫個體識別鑒定了基礎，并也成為刑事技術中唯一能通過對微量生物物證進行檢驗直接認定罪犯的高新技術手段。因此，選擇高性能的DNA純化方法成為法醫DNA建庫和案件分析的首要條件。目前國內外對于核酸純化的報道和試劑盒很多，總結起來大體上可分為兩種，一種是酚氯仿抽提液相純化法，一種是固相純化法。酚氯仿抽提法主要通過有機相-水相分配來除去雜質達到純化核酸的目的。固相純化法則通過核酸與固相介質的非特異可逆性結合，從而達到純化核酸的目的，其結合方式主要包括吸附結合和離子交換結合。目前常用的幾種DNA提取方法均存在一些缺點。如酚_氯仿的液相純化方法， 不僅操作時間長，步驟繁瑣，而且在操作過程中常用到有機污染溶劑，造成環境污染。 Chelex-IOO法，因其省時、成本低、操作簡單、減少了有機試劑的使用，因此成為法醫檢測 DNA純化的常用方法。其原理基于樹脂的螯合作用去除痕量金屬離子等下游PCR的抑制劑。 但該方法得到的DNA純度不高，不利于下游分子生物學的應用，并且得到的DNA保存效果較差，當DNA保存時間過長(一年以上)，再進行STR擴增，結果有明顯的降解，如峰失調，等位基因丟失。目前，從法醫樣本中或含微量核酸樣本中純化DNA的試劑盒甚少，主要是由國外一些公司生產，如Qiagen公司、Promega公司等，而又以離心柱法為其主流的手動操作方法，其價格昂貴且步驟繁瑣，不利于推廣使用。利用磁性載體進行核酸純化是近年來發展起來的一種DNA純化方法，即利用具有超順磁性的納米或微米級球形顆粒作為固相介質來非特異性的吸附核酸，在外加磁場的作用下便將DNA-磁性微粒復合體與蛋白質、多糖等雜質分離開來，可省去離心、過濾等繁雜的操作，減少了過多的機械剪切作用對核酸造成的損傷，而當撤去磁場后，磁性微粒很快均勻分散于溶液中。由于它具有操作簡便、純度高、無酚、氯仿等有機試劑污染的特點，越來越受到人們的親睞，并且它易于實現自動化，滿足了法醫樣本中大規模建庫等高通量操作的需求。專利ZL 200920090335. 6采用納米級硅包被磁性微球為固相載體，配制不同的裂解液、結合液、清洗液等針對不同的檢材來純化法醫樣本的DNA，但由于該方法需針對不同的樣本，配置不同的裂解、結合、清洗體系來純化得到基因組DNA，并且在該專利方法包含了預裂解步驟，步驟繁瑣、復雜，大大延長實驗操作的時間。專利ZL 101935646A公開了一種利用磁珠從微量樣品中提取DNA的方法，該方法只闡述了從干血點、唾液、毛發這三種樣品中純化其基因組DNA，未能涉及到更多樣本的純化結果。

發明內容
為了解決背景技術中的上述問題，本發明提供一種利用磁性納米復合材料簡便、 快速、有效地從法醫樣本等含微量核酸的樣本中純化DNA的方法。本發明的技術方案一種用磁性微粒從含微量核酸的樣本中純化DNA的方法，該方法包括以下步驟(1)裂解樣品 取待純化樣品，加入終濃度分別為3 6M的胍鹽裂解液和0. 01 0. 05M的二硫蘇糖醇，混勻后于水浴中充分裂解5 30min ；(2)形成含磁性微粒-DNA復合物的混合溶液取200 600 μ g磁性微粒加入步驟(1)得到的裂解后的溶液中，振蕩混勻，于室溫充分結合，形成含磁性微粒-DNA復合物的混合溶液；(3)將磁性微粒-DNA復合物從混合溶液中分離對混合溶液磁性分離，棄去上清，將磁性微粒-DNA復合物從混合溶液中分離出來，收集；⑷清洗清洗收集到的磁性微粒-DNA復合物，去除抑制下游應用的雜質；(5)洗脫將洗脫液與清洗后的磁性微粒-DNA復合物混合均勻，使DNA從磁性微粒上洗脫下來，在外加磁場作用下將磁性微粒和洗脫下來的DNA分離，收集上清，即為純化的DNA。上述步驟(1)中胍鹽裂解液包括以下成分3 6M GuHCl, 3 6M GuSCN, 0. 005 0. OlM EDTA，0. 005 0. OlM NaCl，終濃度為 4% 6% 的 Triton X-100 和終濃度為 15% 80%的醇。上述步驟(1)中胍鹽裂解液中所含的醇優選乙醇或異丙醇。上述步驟(4)可以采用先后加入兩種清洗液混勻、磁性分離棄上清；第一種清洗液的主要成分是3 6M GuHCl，終濃度為30% 50%的乙醇；第二種清洗液的主要成分是0. 5M IM乙酸鈉，終濃度為50% 75%的乙醇、異丙醇或乙醇和異丙醇的混合物。上述步驟(5)中洗脫液優選IOmM Tris-HClUmM EDTA, pH = 8. 0的TE溶液或無核酶水。上述步驟(1)水浴反應最佳溫度為95°C。本發明涉及到的表示濃度的百分比均為體積百分比，比如30% 50%的乙醇，即指無水乙醇占溶液整體的體積分數為30% 50%。本發明的優點1、本發明能夠從含有微量核酸的樣品中成功提取得到高純度的DNA。2、本發明在裂解液中加入了適當體積百分含量的醇類物質，不僅可以使核酸特異性地結合到磁性微量上形成磁性微粒-DNA復合物，提高最終所獲得的DNA總量，并且簡化了類似磁性微粒純化過程中需對磁性微粒預處理的步驟。3、本專利采用鹽酸胍裂解液裂解細胞，不需要分步裂解。從樣品中提取到的DNA， 純度高，不含有抑制下游PCR反應的抑制劑。4、不需要離心機等大型儀器，減少了機械使用中的物理性剪切，亦避免了離心過
4程對基因組DNA的破壞。5、操作步驟簡便，時間短，全部過程只需要15 45min左右(根據不同樣本，裂解的時間不同)，從而大大縮短了提取DNA的時間。本發明可滿足從法醫樣本中提取高質量的DNA，并應用于下游PCR擴增、STR分型等應用；該方法無需離心，操作步驟快速、簡便。根據本發明，還可制作出既適用于手動操作又可配套自動化儀器從而純化得到法醫樣本DNA的試劑盒。


圖1是純化得到的血斑DNA進行PCR擴增后的瓊脂糖凝膠電泳圖譜(10 μ IPCR產物進行瓊脂糖電泳；M =DL 2000Marker)。圖2是純化得到的血斑DNA的STR分型圖譜。圖3是純化得到的口腔拭子DNA的STR分型圖譜。圖4是純化得到的煙蒂DNA的STR分型圖譜。圖5是純化得到的毛發DNA的STR分型圖譜。圖6是純化得到的指甲DNA的STR分型圖譜。圖7是利用自動化儀器純化得到的血斑DNA的STR分型圖譜。
具體實施例一種用磁性微粒從法醫樣本中純化DNA的方法，包括以下步驟(1)裂解樣品取一定量的法醫樣本如微量的血液、血斑、口腔拭子、煙蒂、毛發等樣品，經過簡單的前期處理，如將煙蒂的濾紙剪碎等操作步驟。加入濃度為3 6M的胍鹽裂解液0. OlM 0. 05M的二硫蘇糖醇，混勻后于95°C水浴中充分裂解5 30min ；其中，胍鹽裂解液的成分是3 6M GuHCl，3 6MGuSCN，0. 005 0. OlM EDTA，0. 005 0. OlM NaCl, 4 6% Triton X-100 (體積百分比)和15 80% (體積百分含量)的醇，醇可以是乙醇或者異丙醇；二硫蘇糖醇(DTT)濃度可隨樣本的不同而適當調整。如毛發和精斑這類含蛋白質含量較高的樣本時，可適當增加DTT的濃度。(2)形成含磁性微粒-DNA復合物的混合溶液取100 600 μ g磁性微粒加入到裂解后的溶液中，振蕩混勻，于室溫充分結合，形成含磁性微粒-DNA復合物的混合溶液。(3)將磁性微粒-DNA復合物從混合溶液中分離將混合溶液磁性分離，棄去上清， 將磁性微粒-DNA復合物從混合溶液中分離出來，收集。(4)清洗分別用清洗液清洗收集的磁性微粒-DNA復合物，去除蛋白質等抑制下游應用的雜質物質；具體可以先用清洗液I去除蛋白質，清洗次數為1 3次；再用清洗液 II去除殘留的小分子雜質物質，清洗次數可為2 4次。其中，清洗液I是含有鹽酸胍的醇溶液，其中鹽酸胍的濃度為3M 6M，醇是30% 50% (體積百分含量)的乙醇；清洗液 II是含有乙酸鈉的醇溶液，其中乙酸鈉的終濃度為0. 5M 1M，醇是50% 75% (體積百分含量)的乙醇、異丙醇或乙醇和異丙醇的混合物。(5)洗脫將洗脫液與磁性微粒-DNA復合物混合均勻，使DNA從磁性微粒上洗脫下來，在外加磁場作用下將磁性微粒和洗脫下來的DNA分離，收集上清，即為純化的DNA。
洗脫液可以采用IOmM Tris-HClUmM EDTA, pH = 8. 0的TE溶液或無核酶水。以下用實施例對本發明做進一步詳細說明，但并不限定本發明的保護范圍。實施例1 從血斑中純化基因組DNA的方法及效果驗證1. DNA 的純化(1)樣品裂解利用打孔器將直徑為5mm2的血斑打入1. 5ml的離心管中，依次加入150 μ 1胍鹽裂解液(胍鹽裂解液的濃度為6Μ，成分是3 6Μ GuHCl，3 6Μ GuSCN, 0.005 0. OlM EDTA，0. 005 0. OlM NaCl，4 6% Triton X-100 (體積百分比)及 15-80% (體積百分含量)的醇。)和1. 5μ 1的DTT(IM)，渦旋儀震蕩混勻，95°C水浴充分裂解30min。(2)將充分裂解后的血斑樣本，挑離載體。(3)核酸吸附于固相載體向步驟⑵所得到的裂解液中加入10 μ 1濃度為30mg/ml的磁性微粒，渦旋震蕩混合后，靜置5min形成磁性微粒-DNA的復合體。(4)清洗從磁性分離器上取出離心管，加入150 μ 1清洗液I (清洗液I是含有鹽酸胍的醇溶液，其中鹽酸胍的濃度為3Μ 6Μ，醇是30% 80% (體積百分含量)的乙醇)， 吹吸混勻，磁性分離直至上清澄清，棄上清；從磁性分離器上取出離心管，加入150 μ 1清洗液II (清洗液II是含有乙酸鈉的醇溶液，其中乙酸鈉的終濃度為0. 5Μ 1Μ，醇是50% 75% (體積百分含量)的乙醇和異丙醇)，吹吸混勻，磁性分離直至上清澄清，棄上清。重復本操作一次。打開離心管蓋并將其離心管架上上，室溫晾干5min。(5)從磁性分離器上取出離心管，向管中加入50 μ 1無核酶水，吹吸混勻，65°C 水浴5min ；將離心管置于磁性分離器上，磁性分離直至上清澄清，上清液即為純化得到的 DNA，將上清液轉移到另一離心管中，上清即為純化的DNA，可直接用于下游實驗或于-20°C 保存備用。2. PCR 的擴增取10μ 1純化得到的DNA進行PCR擴增反應。擴增后的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳， 結果如圖1所示，條帶清晰完整。3. STR復合擴增分析將純化后的DNA進行STR復合擴增(所采用的復合擴增試劑盒為市售的美國ABI 公司的擴增試劑盒)，然后用ABI 3100型遺傳分析儀檢測，結果如圖2所示，STR位點完整， 分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的 DNA純度高，完整性好。實施例2 從口腔拭子中純化基因組DNA的方法及效果驗證口腔拭子的準備，清水漱口三遍，用口拭子棉簽在口腔兩側輕輕地擦拭，陰干，備用。1. DNA 的純化純化時剪取含有口腔粘膜細胞的口腔棉簽外圍薄博的一層作為實驗檢材。其后步驟與實施例1相同。2. STR復合擴增分析將純化后得到的DNA進行STR復合擴增分析，與實施例1的STR復合擴增分析方法相同，結果如圖3所示，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA純度高，完整性好。實施例3 從煙蒂中純化基因組DNA的方法及效果驗證1.樣品的準備一般來說，對于有明顯咬痕的煙蒂我們通常剪取位于咬痕部位以上的部分，對于沒有明顯咬痕的煙蒂，則盡量剪取煙蒂的上端，一般剪取大小約為2cmX2cm的一塊，在裂解前盡量將其剪碎。2. DNA 的純化步驟與實施例1相同。3. STR復合擴增分析將純化后得到的DNA進行STR復合擴增分析，與實施例1的STR復合擴增分析方法相同，結果如圖4所示，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA純度高，完整性好。實施例4 從毛發和指甲中純化基因組DNA的方法及效果驗證1. DNA 的純化對于頭發和指甲這種比較堅硬的組織，在純化前要先進過消化，消化的具體方法是將指甲(盡量剪碎)和頭發(含毛囊)分別加入到1. 5ml的離心管中，之后加入20 μ 1 蛋白酶K和TES的條件下，56°C消化過夜。消化后渦旋振蕩，l,2000rpm離心2min，留上清。其后步驟與實施例1相同。2. STR復合擴增分析將純化后得到的DNA進行STR復合擴增分析，其方法與實施例1的方法相同，結果如圖5所示，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA純度高，完整性好。實施例5 利用自動化純化基因組DNA的方法及效果驗證1. DNA 的純化以血斑作為實驗檢材，配套自動化儀器進行實驗。首先將所需要的溶液按血斑樣本、裂解液、磁性微粒、清洗液I、清洗液II、清洗液 II、洗脫液的順序依次加入到96深孔板1-6孔中。然后運行自動化儀器進行試驗，運行程序參照實施例1進行DNA的純化。2. STR復合擴增分析將純化后得到的DNA進行STR復合擴增分析，其方法與實施例1的方法相同，結果如圖6所示，STR位點完整，分型準確，無等位基因丟失、不平衡擴增等現象出現，表明該純化方法純化效率高，得到的DNA純度高，完整性好。
權利要求
1.一種用磁性微粒從含微量核酸的樣本中純化DNA的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)裂解樣品取待純化樣品，加入終濃度分別為3 6M的胍鹽裂解液和0. 01 0. 05M的二硫蘇糖醇，混勻后于水浴中充分裂解5 30min ；(2)形成含磁性微粒-DNA復合物的混合溶液取200 600 μ g磁性微粒加入步驟(1)得到的裂解后的溶液中，振蕩混勻，于室溫充分結合，形成含磁性微粒-DNA復合物的混合溶液；(3)將磁性微粒-DNA復合物從混合溶液中分離對混合溶液磁性分離，棄去上清，將磁性微粒-DNA復合物從混合溶液中分離出來，收集；(4)清洗清洗收集到的磁性微粒-DNA復合物，去除抑制下游應用的雜質；(5)洗脫將洗脫液與清洗后的磁性微粒-DNA復合物混合均勻，使DNA從磁性微粒上洗脫下來， 在外加磁場作用下將磁性微粒和洗脫下來的DNA分離，收集上清，即為純化的DNA。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中胍鹽裂解液包括以下成分 3 6M GuHCl，3 6M GuSCN，0. 005 0. OlM EDTA，0. 005 0. OlMNaCl，終濃度為 4% 6%的Triton X-100和終濃度為15% 80%的醇。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)中胍鹽裂解液中所含的醇為乙醇或異丙醇。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)是先后加入兩種清洗液混勻、磁性分離棄上清；第一種清洗液的主要成分是3 6M GuHCl，終濃度為30% 50%的乙醇； 第二種清洗液的主要成分是0. 5M IM乙酸鈉，終濃度為50% 75%的乙醇、異丙醇或乙醇和異丙醇的混合物。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(5)中洗脫液是IOmMTris-HClUmM EDTA, pH = 8. 0的TE溶液或無核酶水。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)水浴反應溫度為95°C。
全文摘要
本發明提供一種利用磁性納米復合材料簡便、快速、有效地從法醫樣本等含微量核酸的樣本中純化DNA的方法。該方法包括以下步驟(1)取待純化樣品，加入終濃度分別為3～6M的胍鹽裂解液和0.01～0.05M的二硫蘇糖醇，混勻后于水浴中充分裂解5～30min；(2)形成含磁性微粒-DNA復合物的混合溶液；(3)將磁性微粒-DNA復合物從混合溶液中分離；(4)清洗；(5)洗脫獲得純化的DNA。本發明可滿足從法醫樣本中提取高質量的DNA，并應用于下游PCR擴增、STR分型等應用；該方法無需離心，操作步驟快速、簡便。根據本發明，還可制作出既適用于手動操作又可配套自動化儀器從而純化得到法醫樣本DNA的試劑盒。
文檔編號C12N15/10GK102352351SQ201110314908
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月17日 優先權日2011年10月17日
發明者崔亞麗, 張景閣, 李芳 , 楊柳, 趙穩操, 鄧晨 申請人:西安金磁納米生物技術有限公司