專利名稱：一種檢測甘蔗宿根矮化病菌的實時熒光定量pcr方法
技術領域：
本發明涉及甘蔗健康種苗與甘蔗抗性鑒定分子生物學技術領域，特別是甘蔗宿根矮化病菌的檢測引物和定量PCR檢測方法。
背景技術：
甘蔗宿根矮化病(ratoon stuning disease, RSD)是世界各甘蔗種植區普遍發生的一種細菌性病害。該病是由一種棒桿細菌Zei/siwia xyli subsp. 寄生于蔗株的維管束中引起，主要通過帶病蔗種和收獲時砍種刀具相互傳播，在一定時期內，部分通過土壤傳播。Davis等研究表明，該菌不易分離培養，為革蘭氏陽性桿狀細菌，由于該病沒有明顯的外部和內部癥狀，僅僅從外觀上難以鑒定，特別嚴重時才會表現蔗株矮化、纖細、分蘗減少、 生長慢等癥狀，且蔗株矮化會隨甘蔗宿根年限的延長而加重。甘蔗宿根矮化病一般造成減產10%-30%，干旱缺水時可達60%以上，而且還能導致品種種性退化。近年來，隨著國內外甘蔗育種單位之間的相互引種、國內各蔗區間的頻繁調種以及農業機械化的推進，RSD迅速蔓延。目前，由于甘蔗宿根矮化病菌尚沒有有效化學防治方法，同時缺乏抗性材料，甘蔗抗RSD育種進程緩慢。當前最有效的控制手段就是普及種植甘蔗健康種苗，甘蔗健康種苗的主要目的就是去除甘蔗易受感染的病毒病與細菌性病害，其中包括甘蔗宿根矮化病。如何快速準確的鑒定甘蔗健康種苗是否含有RSD菌是目前甘蔗健康種苗生產必備的關鍵技術。目前，宿根矮化病的常規檢測均是對甘蔗蔗汁直接進行檢測，方法主要有顯微鏡技術、 電視差顯微鏡技術、血清學技術和常規PCR等。但是前兩種方法都存在需要樣品量多、操作復雜、檢測耗時長、靈敏度不高等缺點，在實際中很難應用；血清學技術雖然可以克服前兩者所存在的缺點，實現高通量檢測，但相對于定量PCR而言，檢測靈敏度不高；而常規PCR技術只能終點定量，無法對病原菌初始濃度進行準確定量。因此，為了保證國家的甘蔗健康種苗生產計劃的順利進行，提高我國甘蔗生產技術水平，迫切需要建立一種簡便、快速、準確、 靈敏的檢測宿根矮化病菌的實時熒光定量PCR方法。

發明內容
本發明的目的是為了解決現有檢測宿根矮化病病菌方法中不能定量病原菌數量、 準確性差、且費時、費力的問題，而提供了一種檢測甘蔗宿根矮化病菌的實時熒光定量PCR 方法。本發明的技術方案如下
本發明首先提供了一種利用實時熒光定量PCR方法檢測甘蔗宿根矮化病菌的引物及探針，所述的引物為以下序列的引物對正向引物序列5’ -GGTTCCATTGCTTACCGATT-3’，反向引物序列 5’ -CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3，，探針序列是 FAM-5-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3 -TAMRAo本發明還提供了一種檢測甘蔗宿根矮化病病菌的實時熒光定量PCR方法，包括以下步驟
(1)宿根矮化病病菌的I^atl基因片段的克隆及標準曲線繪制以宿根矮化病致病菌 DNA為模板，采用所述引物對進行PCR擴增，切膠純化，連接到PMD18-T載體上，選擇陽性克隆，提取質粒DNA，得到宿根矮化病菌的I^atl基因，測定質粒DNA的吸光值，并將吸光值轉化成質粒DNA的濃度，再將質粒DNA的濃度轉化成為拷貝數，進行梯度稀釋，并以稀釋后的質粒DNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增，繪制標準曲線，構建標準曲線方程；
(2)以待測樣品蔗汁DNA為模板，用所述引物與探針進行實時熒光定量PCR擴增，通過將產生的的Ct值代入標準曲線方程轉化成起始反應的DNA分子拷貝數，即一個分子拷貝數代表一個白條病菌，從而定量檢測甘蔗樣品中感染宿根矮化病菌的數量。所述實時熒光定量PCR擴增的反應體系為25 μ L :2XTaqMan Universal Master Mix 12.5 μ L ；10 ymol/L 正向引物與反向引物各 0. 75 μ L ；10 μ mol/L 探針 0. 4 μ L ； DNA模板LOyL ；補水至25 μ L。所述實時熒光定量PCR擴增的反應條件為50 V，2 min,預變性95 V，10 min ； 95 °C, 15 s ；60 °C，退火延伸，1 min，40個循環，在60°C進行單點熒光檢測。為了保證定量檢測的準確性，因此在設計引物與探針時選擇該病原菌所特異致病基因Patl，然后將該序列在NCBI進行序列比對，該基因為宿根矮化病菌所特異性基因，與其他生物基因沒有顯著的同源性。本發明提供的用于檢測宿根矮化病菌的方法為以上面提供的引物對與探針在實時熒光定量PCR儀中檢測甘蔗中感染的宿根矮化病菌I^atl基因。通過儀器檢測PCR擴增過程中產生的熒光信號，即生成Ct值，然后利用已經建好的標準曲線將Ct值轉換成起始反應的核酸分子拷貝數，從而達到定量檢測甘蔗中感染宿根矮化病菌的數量。與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下
1、本發明首次根據宿根矮化病病菌的致病基因I^atl設計特異性引物與探針；
2、本發明首次在宿根矮化病菌的檢測上利用定量PCR法構建標準曲線方程，計算甘蔗樣品中感染的宿根矮化病菌數量；
3、本發明首次將宿根矮化病菌實時熒光定量PCR方法應用于甘蔗健康種苗檢測、甘蔗抗性鑒定方面。


圖1為宿根矮化病菌I^atl基因實時熒光定量PCR反應的標準曲線；橫坐標代表循環數Ct值；縱坐標代表熒光信號強度；
圖2為宿根矮化病致病菌的標準曲線方程；橫坐標代表起始拷貝數；縱坐標代表循環數Ct值。
具體實施例方式以下使用的各種生化試劑均來自生工生物工程(上海)有限公司，PCR相關試劑來自ABI公司，PMD18-T載體、引物與探針合成都來自TAKARA寶生物工程(大連)有限公司， 測序完成于南京金斯瑞生物有限公司。實施例1采用CTAB法提取宿根矮化病致病菌Zei/sfwia xyli subsp. zj^i (現保存于福建農林大學甘蔗綜合研究所，甘蔗宿根矮化病致病菌的分離方法為Y. "B. Pan提供)的DNA，以該 DNA模板，利用上述引物進行定性PCR擴增，采用Eppendorf Mastercycler EP PCR熱循環儀 5333 型基因擴增儀。25 μ L PCR 反應體系組成IOXPCRBuffer(Mg2+) 2.5 μ L, dNTP (2. 5 mmol/L)2 μ L，正反向引物(10 ymol/L)各 1 μ L，ExTaq 酶(5U/μ L) 0. 125 μ L,|l 板DNA (100 ng/yL) 1 μ L，加滅菌雙蒸水使總體積為17. 375。PCR擴增條件95 °C 5 min ；95 "C 30 S，56 "C 30 S，72 "C 30 S，；35 個循環；最后 72 °C延伸 7 min 后 4 °C保存備用。反應結束后將所得PCR產物用于1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，并進行膠回收純化，連接到PMD18-T載體上，選擇陽性克隆，提取質粒DNA，送測序公司進行測序，測序完成后將所得到測序結果Blast比對，結果正常后，繼續將質粒DNA采用紫外分光光度計在沈0 nm測定吸光度值。然后根據公式(DNA樣品濃度(ug/ml) = OD260 X 50X稀釋倍數)將吸光度值轉換成質粒DNA濃度。再根據以下公式將質粒DNA濃度轉化為拷貝數。MW =堿基數 χ 660 dalton/bp
(6. 02 χ 10 23 χ (濃度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml
對于雙鏈 DNA, 223 ng/ μ L 質粒 DNA 的 36 bp 長度相當于 5. 6 xlO 10 copies/ μ L 純化后的質粒DNA定量后，將該質粒DNA作為標準品，采用倍比梯度稀釋法進行稀釋， 即Iv原液(標準品i) +9v稀釋緩沖液，得標準品ii ；Iv標準品ii+9v稀釋緩沖液，得標準品iii，以此類推，就得到標準品的拷貝數分別為為IO8 10，分成8個標準樣品處理， 以此稀釋后質粒DNA為模板，每個標準樣品處理重復3次。分別檢測大腸桿菌、Leifsonia ginseng!和Leifsonia poae菌DNA、以健康種苗的蔗汁DNA為陰性對照，以宿根矮化病致病菌DNA為陽性對照，以雙蒸水為空白對照。利用ABI公司7500定量PCR儀進行實時熒光定量PCR擴增，制作標準曲線，進而
構建標準曲線方程。將未知樣品的Ct值帶入標準曲線方程，對未知樣品進行定量分析。采用ABI公司實時熒光定量PCR試劑盒進行PCR擴增，反應體系包括TaqMan Universal Master Mix (2 Χ) 12. 5 PL;上下游引物(10 ymol/L)各 0· 75 μ L JaciMan 探針(10 ymol/L) 0.4 yL;DNA 模板(1 μ g/μ L)l. 0 yL;補水至 25 yL，反應條件50 °C，2 min，預變性 95 "C, 10 min ；95 °C，15 s ；60 °C，退火延伸，1 min，40個循環，在60°C進行單點熒光檢測。定量PCR擴增標準曲線如圖1所示，反應結束后，利用軟件將反應中的數據分析生成標準曲線方程(如圖2)，R2表示標準曲線相關系數，Slope表示標準曲線斜率，Eficiency 表示反應的擴增效率，Y-interc印t表示Y軸的截距。正常的標準曲線應滿足以下條件 R2 > 0. 99, -3.5 < slope < -3.0，0. 9 < efficiency < 1.2。本實施例構建的標準曲線方程為:R2 為 0. 999，Slope 為-3. 335，Efficiency 為 99. 45%, Y-intercept 為 39. 945， Y=-3. 335Χ+39. 945。附甘蔗宿根矮化病致病菌的分離
一、采集病蔗
二、取病蔗下部，用刀把甘蔗表面的雜質、蠟粉刮干凈，用自來水沖洗干凈，再用無菌水沖洗兩遍。多個樣本要防止交叉污染，每處理一個樣本，刀具都要沖洗干凈，然后用酒精燈燒消毒。以下過程都要嚴格按照無菌操作進行。三、在超凈臺邊將甘蔗砍成小段，表面噴灑酒精，放入超凈臺內，點火快速燒消毒兩遍。四、在超凈臺內用滅過菌的大剪刀或刀將甘蔗截成6cm左右的小段，放入50mL無
菌離心管。五、25°C，3500rpm離心 15min。(注意配平，要求誤差< 0. Olg) 六、收集離心管底部的蔗汁，放入無菌的2mL離心管。七、25°C,3000rpm 離心 5min。八、取上清液放入無菌2mL離心管。九、梯度稀釋，做兩個處理
處理1 取10個無菌的2mL離心管，編好號碼，②一⑩號管分別加入0. 9mL的PBS(lx， 無菌)
①管為無稀釋的蔗汁，濃度為100；
②管中加入0.ImL蔗汁，混勻，濃度為ΙΟ"1 ；
③管中加入0.ImL②管的溶液，混勻，濃度為10_2 ；
④管中加入0.ImL③管的溶液，混勻，濃度為10_3;
⑤管中加入0.ImL④管的溶液，混勻，濃度為10_4;
⑥管中加入0.ImL⑤管的溶液，混勻，濃度為10_5;
⑦管中加入0.ImL⑥管的溶液，混勻，濃度為10_6;
⑧管中加入0.ImL⑦管的溶液，混勻，濃度為10_7;
⑨管中加入0.ImL⑧管的溶液，混勻，濃度為10_8;
⑩管中加入0.ImL⑨管的溶液，混勻，濃度為10_9。處理2 將上清液用0. 45 μ m的濾膜過濾后再進行梯度稀釋，稀釋方法同處理1。十、用移液槍將處理1和處理2各個梯度濃度的蔗汁點滴到平板培養基上，等蔗汁完全被培養基吸收后，用封口膜將培養皿封好。i^一、將培養皿放入培養箱中，28°C倒置培養^d。(由于RSD菌落很小，生長緩慢， 若是在2周時間內有菌落出現，說明樣品已經被污染)
實施例2
將2011年福建農林大學校內的國家第九輪甘蔗區域實驗的甘蔗分別提取蔗汁DNA， 11 個不同品種甘蔗有以下YA05-179、柳城 LCI、YG35, YG34、R0C20、FN36、YZ05-5、 R0C22、RC16、Y06-407、LC03-1137。按照傳統的核酸提取方法CTAB法，以純化后的基因組DNA作為模板，利用ABI公司7500實時熒光定量PCR儀，采用本發明特異性的引物對與 iTaciMan 探針進行 PCR 擴增。反應體系包括TaqMan Universal Master Mix (2Χ) 12.5 μ L ；正反向引物(10 ymol/L)各 0.75 μ L JaciMan 探針(10 μ mol/L) 0.40 μ L ；DNA 板1. 0 μ L ；補水至25 μ L，每個樣品做3次重復。反應條件50 °C,2 min,預變性95 V， 10 min ；95 °C，15 s ；60 °C，退火延伸，1 min，40個循環，在60°C進行單點熒光檢測。然后導入已建立的標準曲線利用熒光定量PCR儀軟件計算生成的Ct值，將Ct值導入標準曲線方程計算檢測到核酸分子的拷貝數。
經過計算宿根矮化病菌在11個不同甘蔗品種中的數量分別為YA05-179為 5. 0 XioVmL,
柳城 LCl 為 7. 9 XioVmL, YG35 為 3. 2 X 104/mL、YG34 為 4. 0 X 103/mL、R0C20 為 5. 0X103/mL、FN36 為 1. 6X 104/mL、而 YZ05-5、LC03-1137、R0C22、RC16、Y06-407 沒有檢
測到宿根矮化病病原菌。申請人:采用本方法檢測過多種其他病菌(包括大腸桿菌、Zei/sfwia ginseng!和 Leifsonia poae菌DNA、以健康種苗的蔗汁DNA為陰性對照，以宿根矮化病菌DNA為陽性對照，以雙蒸水為空白對照)，分別進行上述引物與探針的特異性檢測，結果發現該反應特異性強，其他待測菌株沒有擴增曲線產生，檢測結果如圖1所示。本發明的檢測限為10個拷貝，檢測在IO8-IO個拷貝數之間。
權利要求
1.一種利用實時熒光定量PCR方法檢測甘蔗宿根矮化病菌的引物及探針，其特征在于所述的引物為以下序列的引物對正向引物序列5’ -GGTTCCATTGCTTACCGATT-3’，反向引物序列 5’ -CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3，，探針序列是 FAM-5-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3-T AMRA。
2.一種根據權利要求1所述的引物及探針檢測甘蔗宿根矮化病病菌的實時熒光定量 PCR方法，其特征在于包括以下步驟(1)宿根矮化病病菌的I^atl基因片段的克隆及標準曲線繪制以宿根矮化病致病菌 DNA為模板，采用所述引物對進行PCR擴增，切膠純化，連接到PMD18-T載體上，選擇陽性克隆，提取質粒DNA，得到宿根矮化病菌的I^at 1基因，測定質粒DNA的吸光值，并將吸光值轉化成質粒DNA的濃度，再將質粒DNA的濃度轉化成為拷貝數，進行梯度稀釋，并以稀釋后的質粒DNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增，繪制標準曲線，構建標準曲線方程；(2)以待測樣品蔗汁DNA為模板，用所述引物與探針進行實時熒光定量PCR擴增，通過將產生的的Ct值代入標準曲線方程轉化成起始反應的DNA分子拷貝數，即一個分子拷貝數代表一個白條病菌，從而定量檢測甘蔗樣品中感染宿根矮化病菌的數量。
3.根據權利要求2所述檢測甘蔗宿根矮化病病菌的實時熒光定量PCR方法，其特征在于所述實時熒光定量PCR擴增的反應體系為25μ L :2XTaqMan Universal Master Mix 12. 5μ L ；lOymol/L正向引物與反向引物各0. 75 μ L ； lOymol/L探針0. 4 μ L ；DNA模板 LOyL ；補水至 25 μ L。
4.根據權利要求2所述檢測甘蔗宿根矮化病病菌的實時熒光定量PCR方法，其特征在于所述實時熒光定量PCR擴增的反應條件為50 2 min，預變性95 10 min ；95 °C， 15 s ；60 °C，退火延伸，1 min，40個循環，在60°C進行單點熒光檢測。
全文摘要
本發明首先提供了一種利用實時熒光定量PCR方法檢測甘蔗宿根矮化病菌的引物及探針，所述的引物為以下序列的引物對正向引物序列5’-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3’，反向引物序列5’-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3’，探針序列是FAM-5-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3-TAMRA。以上面提供的引物對與探針在實時熒光定量PCR儀中檢測甘蔗中感染的宿根矮化病菌Pat1基因。通過PCR擴增過程生成的Ct值，利用已經建好的標準曲線將Ct值轉換成起始反應的核酸分子拷貝數，從而達到定量檢測甘蔗中感染宿根矮化病菌的數量。該方法可應用于甘蔗健康種苗檢測、甘蔗抗性鑒定方面。
文檔編號C12Q1/68GK102312016SQ20111031655
公開日2012年1月11日 申請日期2011年10月18日 優先權日2011年10月18日
發明者王恒波, 許莉萍, 郭晉隆, 陳如凱, 陳平華, 高三基 申請人:福建農林大學