專利名稱：甘蔗花葉病和宿根矮化病病原的多重pcr檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種甘蔗病害的檢測方法，主要是針對甘蔗花葉病病 毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)禾口甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease, RSD )病原細菌木質部賴氏桿菌木質部亞種 "ei/^ /72'a subsp. iy厶'，Lxx)的同時檢測方法。
背景技術：
甘蔗花葉病(Sugarcane mosaic virus, SCMV)和甘蔗宿根矮化 病(Ratoon Stunting Disease, RSD)是兩種世界范圍內廣泛發生的 主要病害，它們在我國各蔗區也相當普遍和嚴重，所有的甘蔗栽培品 種都受到不同程度的危害。
甘蔗花葉病由甘蔗花葉病毒引起，甘蔗花葉病毒是正單鏈RNA病 毒，是馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯Y病毒屬的重要成員之一，病毒株系繁 多，變異較大。它主要危害甘蔗葉片，染病植株細胞內的葉綠體顆粒 的發育受病毒抑制，在數目及體積上均遜于正常細胞，使葉組織發生 透綠現象，尤以新葉基部癥狀最為明顯，癥狀一般是黃綠相間不規則 的嵌紋、條斑或斑駁。病斑長短大小不一，布滿葉片，感病植株葉片 黃化，植株矮化、分蘗減少。部分品種在夏季高溫時癥狀會消失，即 所謂"隱癥"現象。宿根病蔗發芽緩慢，生長不良，還會表現出莖潰 瘍即莖外皮發生水漬狀條紋或斑塊，外皮下組織先變紫紅色，終致
壞死而皺縮，由于壞死組織和健康組織生長不平衡，致莖外皮被推擠 而破裂，形成所謂莖潰瘍，感病株節間縮短。據調査，華南各地尤其
是廣西旱地甘蔗花葉病的發病率達到30%以上，產量損失3%-50% 。 甘蔗宿根矮化病癥狀較隱蔽，易與干旱造成的損害癥狀相混，感 病植株節間短縮、品質劣變，蔗汁中還原糖增加，蔗糖的結晶率降低。 甘蔗宿根矮化病蔗株平均感染率50%左右，宿根年限愈長發病率愈 高。該病通常造成甘蔗減產12% 37%，在干旱的情況下減產高達 60%，蔗糖分降低0.5% (絕對值)，宿根性減弱，即使是無病無毒 的健康種苗在生產上使用5年后也是100%感染宿根矮化病。
防止這兩種病害的發生和蔓延對甘蔗產業的穩健發展十分重要。 SCMV初期外觀癥狀不明顯，而RSD則無特異的外觀癥狀，這給診斷 這兩種病害帶來了困難。隨著甘蔗健康種苗在甘蔗生產上的運用，迫 切需要建立能穩定、準確、靈敏并能同時檢測出這兩種病原的檢測方 法，它可為甘蔗健康種苗的生產和應用、健康甘蔗種質資源交換、品 種調運等提供有效的監控手段。
目前對SCMV的檢測方法有蔗株直觀測定、生物測定、電鏡診 斷、血清學測定、核酸分子雜交、多聚酶鏈式反應(PCR)等檢測方 法，其中PCR是一種較為靈敏準確的檢測方法。甘蔗RSD診斷技術經 歷了從內部癥狀觀察(剖莖檢視)、相差顯微鏡檢查、免疫技術和PCR 快速檢測等4個階段。由于特異性不明顯，剖莖檢視只能作為檢測感 染RSD的輔助標志；而如果含菌量低則用相差顯微鏡也不能檢出；免 疫技術檢測則存在對Lxx數量密度要求較高(要求含菌量達103
107Cells/ml以上)和假陰性或假陽性過高的問題；PCR技術能檢測 到含1-10個菌體的RSD，是較靈敏準確的檢測方法。目前對甘蔗進 行這兩種病害的檢測需要分兩步PCR進行提取甘蔗總RNA再通過 RT-PCR方法檢測SCMV;提取甘蔗的總DNA，再通過PCR方法檢測RSD。 這樣檢測較為煩瑣，檢測成本也很高。

發明內容
本發明的目的是提供一種甘蔗花葉病和宿根矮化病病原的多重 PCR檢測方法，它是在SCMV RT-PCR和RSD單一 PCR檢測體系的基礎 上，建立能同時檢測這兩種病原的一步法多重PCR檢測方法。
本發明是集中一步法RT-PCR和多重PCR的優勢，在已有RSD單 一 PCR檢測體系的基礎上，根據SCMV的中國大陸優勢株系SCMV-A及 其它四個株系SCMV-B、 D、 E、 SC的保守序列區設計反轉錄引物和PCR 檢測引物對，建立并優化了一步法多重RT-PCR反應體系和反應程序， 加快了診斷速度又節約了檢測費用。
為實現上述目的，本發明所采用的技術方案根據甘蔗花葉病毒 和甘蔗宿根矮化病病原細菌在甘蔗植株內的分布特點，確定取甘蔗植 株莖基部帶鞘葉片為檢測樣品，這保證了能無遺漏的同時檢測出在待 檢材料中可能存在的兩種病原；根據公知的甘蔗花葉病病毒中國大陸 優勢株系SCMV-A及其它四個株系SCMV-B、 D、 E、 SC的基因保守序列 區設計反轉錄引物和PCR檢測引物對，確保能檢測出中國大陸和臺灣 省導致甘蔗花葉病的甘蔗花葉病病毒；結合已有的檢測甘蔗宿根矮化 病病原細菌引物對，對甘蔗花葉病毒和甘蔗宿根矮化病病原的基因片
段進行擴增；利用總核酸提取方法提取總核酸，并用RT-PCR反轉錄 試劑盒將其中的RNA反轉錄成cDNA;設計該一步法多重RT-PCR的反 應體系和擴增程序，將核酸進行擴增，利用凝膠電泳分析擴增結果及 特異性，同時利用十倍遞進稀釋法檢測該一步法多重RT-PCR的敏感 度。
本發明與現有技術相比所具有的優點和積極效果 目前對甘蔗進行這兩種病害檢測需要分兩步PCR進行(1)提 取甘蔗總RNA再通過RT-PCR方法檢測SCMV; (2)提取甘蔗的總DNA， 再通過PCR方法檢測RSD。這樣檢測較為煩瑣，檢測成本也很高。而 本發明所設計的甘蔗花葉病和宿根矮化病病原的多重PCR檢測方法 集中一步法RT-PCR和多重PCR的優勢，只需提取甘蔗的總核酸，在 同 一個PCR管中完成反轉錄后通過一次PCR反應就可以同時檢測出這 兩種病害的病原，具有操作簡單、節省時間、成本低，同時還具有較 高的特異性和敏感性等優點。利用該檢測方法能特異擴增出甘蔗花葉 病毒和宿根矮化病病原的基因片段且最低能檢測到10—5ug的總核酸 模板，可用于SCMV和RSD的同時早期診斷和田間病原調查研究，可 為甘蔗健康種苗的生產和應用、健康甘蔗種質資源交換、品種調運等 提供有效的監控手段，對防止這兩種病害的發生和蔓延及甘蔗產業的 穩健發展都具有十分重要的意義，還對甘蔗其它病原的檢測也具有一 定的參考價值。
具體實施方式
下面對本發明作進一步詳細說明。本發明所設計的甘蔗花葉病和宿根矮化病病原的多重PCR檢測
方法包括下列步驟
1、 在甘蔗植株上確定最佳檢測取樣部位
由于SCMV和Lxx在甘蔗植株內各自的分布特點，為了保證在待
檢材料中能無遺漏的檢測出是否存在兩種病原，應以待檢測甘蔗植株 莖基部帶鞘葉片作為提取總核酸的材料。
2、 根據公知的甘蔗花葉病毒中國大陸優勢株系SCMV-A及其它四 個株系SCMV-B、 D、 E、 SC (在GenBank數據庫中的序列號分別為U7354、 U57355、 1157356、 U57357、 D00948)的核酸保守序列區設計反轉錄引 物(5， -CCTTCATCTGCATG-3，)和PCR檢測引物對cpcl， cpc2; RSD 引物對為F1， F2;用于擴增檢測甘蔗花葉病病毒的基因片段大小為 400bp，上游引物cpcl為5， -GAGTTTGATAGGTGGTATGAAGCC-3，，下游 引物cpc2為5' -CCTTCATCTGCATGTGGGC-3，；用于擴增Lxx的基因片段 的引物為已有引物上游引物F1為5， -CTGGCACCCTGTGTTGTTTTC-3，， 下游引物F2為5， -TTCGGTTCTCATCTCAGCGTC-3'，擴增的Lxx基因片段 大小為265bp;
3、 總核酸的提取及cDNA的合成
利用RNAplant試劑盒提取甘蔗總核酸取約0. lg感病樣品， 液氮研磨至粉末后加入0. 5ml 4"C的提取試劑，振蕩至徹底混勻，室 溫放置5 min后于4°C 12000rpm離心10 min，將上清轉入新的無Rnase 的離心管后加入0. lml 5MNaCl，溫和混均再加入0. lml氯仿，上下 顛倒數次混勻，然后4°C12000rpm離心10 min，取上層水相轉入新
的無Rnase離心管后再加入等體積的異丙醇，混勻，溫室放置10 min， 4。C12000rpm離心10 min，棄上清，力n lml 75%乙醇，4。C5000卬m 離心3 min，棄上清，短暫離心然后用槍頭吸出液體，室溫晾干2-3 min，加50 ul無Rnase水溶解(力口 2 ul RNasin Inhibitor),于-70 'C保存。
利用RNA反轉錄試劑盒進行cDNA的合成在PCR管中，加入如 下樣品提取的總核酸樣品4ul、 Nuclease-free Water 10ul、 SCMV 反轉錄引物lul、 7CTC熱激5min后置冰浴上冷卻2min、在管中繼續 力口入Nuclease-free Water 1.5ul、 5XRT Reaction Buffer 5ul、 dNTP Mixter 1.25ul、 RNasin 1.25ul、 M-MLV RTlul、將反應管42 'C保溫60 min、終止反應，反應液就是PCR反應中的cDNA模板。
4、 一步法多重RT-PCR的擴增
建立一步法多重RT-PCR:通過不同反應條件PCR擴增效果的比 較，該一步法多重RT-PCR反應體系設計為以"5 + 20"反應模式 即反轉錄物5ul+PCR反應試劑20ul,在同一個PCR管內進行反轉錄 和多重PCR。反轉錄反應體系是5XRT Reaction Buffer lul，反 轉錄引物(RT) 0. 5ul， dNTPs 0. 5ul,總核酸提取物lul， RNAsafe 0. 25ul， M—MLV Reverse Transcriptase 0. 25ul， Nuclease-free Water 5ul。反應結束后立即在同一 PCR管中加入20ul PCR反應試劑 Nuclease-free Water 12. 35ul 、 10 X PCR Buffer 2. 5ul ， dNTP Mixter 2ul， RSD上下游引物各lul, SCMV上下游引物各0.5ul, Taq靈 聚合酶0. 15ul。 PCR擴增程序為94。C預變性5min; 94。C變性20s，
53。C退火30s， 72°C 45s，循環30次；最后72。C延伸5min。
5、 瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果
用TAE電泳緩沖液配制1 %瓊脂糖凝膠，在TAE電泳槽中進行水 平電泳，加10ulPCR擴增產物，以健康甘蔗總核酸的反轉錄物為模 板的PCR產物為陰性對照，以DL2000 Marker為標準分子量， 100v/85mA電泳40分鐘，用凝膠成像系統拍攝電泳結果，若在265bp 處出現擴增條帶說明RSD為陽性，若在400bp處出現擴增條帶說明 SCMV為陽性，若在265bp和400bp均出現擴增條帶說明RSD和SCMV 均為陽性，無擴增條帶說明RSD和SCMV均為陰性。
6、 一步法多重RT-PCR特異性及敏感性檢測
一步法多重RT-PCR敏感性檢測用分光光度計測定呈陽性的 RSD、 SCMV單一感染樣品和混合感染的核酸，按十倍遞進稀釋法進行 稀釋，然后各取lul進行一步法多重PCR，借助凝膠電泳觀察結果， 找出肉眼可見特異電泳條帶所用核酸的最小臨界值，依此得出一步法 多重RT-PCR的敏感性。
權利要求
1、一種甘蔗花葉病和宿根矮化病病原的多重PCR檢測方法，其特征在于包括下列步驟1)、在甘蔗植株上確定最佳檢測取樣部位以待檢測甘蔗植株莖基部帶鞘葉片作為提取總核酸的材料；2)、根據公知的甘蔗花葉病毒中國大陸優勢株系SCMV-A及其它四個株系SCMV-B、D、E、SC的核酸保守序列區設計反轉錄引物(5’-CCTTCATCTGCATG-3’)和PCR檢測引物對cpc1，cpc2；RSD引物對為F1，F2；用于擴增檢測甘蔗花葉病病毒的基因片段大小為400bp，上游引物cpc1為5’-GAGTTTGATAGGTGGTATGAAGCC-3’，下游引物cpc2為5’-CCTTCATCTGCATGTGGGC-3’；用于擴增Lxx的基因片段的引物為已有引物上游引物F1為5’-CTGGCACCCTGTGTTGTTTTC-3’，下游引物F2為5’-TTCGGTTCTCATCTC AGCGTC-3’，擴增的Lxx基因片段大小為265bp；3)、總核酸的提取及cDNA的合成利用RNAplant試劑盒提取甘蔗總核酸取約0.1g感病樣品，液氮研磨至粉末后加入0.5ml 4℃的提取試劑，振蕩至徹底混勻，室溫放置5min后于4℃12000rpm離心10min，將上清轉入新的無Rnase的離心管后加入0.1ml 5MNaCl，溫和混均再加入0.1ml氯仿，上下顛倒數次混勻，然后4℃12000rpm離心10min，取上層水相轉入新的無Rnase離心管后再加入等體積的異丙醇，混勻，溫室放置10min，4℃12000rpm離心10min，棄上清，加1ml 75％乙醇，4℃5000rpm離心3min，棄上清，短暫離心然后用槍頭吸出液體，室溫晾干2-3min，加50ul無Rnase水溶解(加2ul RNasin Inhibitor)，于-70℃保存；利用RNA反轉錄試劑盒進行cDNA的合成在PCR管中，加入如下樣品提取的總核酸樣品4ul、Nuclease-free Water 10ul、SCMV反轉錄引物1ul、70℃熱激5min后置冰浴上冷卻2min、在管中繼續加入Nuclease-free Water 1.5ul、5×RT Reaction Buffer 5ul、dNTP Mixter 1.25ul、RNasin 1.25ul、M-MLV RT1ul、將反應管42℃保溫60 min、終止反應，反應液就是PCR反應中的cDNA模板；4)、一步法多重RT-PCR的擴增建立一步法多重RT-PCR通過不同反應條件PCR擴增效果的比較，該一步法多重RT-PCR反應體系設計為以“5+20”反應模式即反轉錄物5ul+PCR反應試劑20ul，在同一個PCR管內進行反轉錄和多重PCR；反轉錄反應體系是5×RT Reaction Buffer 1ul，反轉錄引物(RT)0.5ul，dNTPs 0.5ul，總核酸提取物1ul，RNAsafe0.25ul，M-MLV Reverse Transcriptase 0.25ul，Nuclease-free Water5ul；反應結束后立即在同一PCR管中加入20ul PCR反應試劑Nuclease-free Water 12.35ul、10×PCR Buffer 2.5ul，dNTP Mixter2ul，RSD上下游引物各1ul，SCMV上下游引物各0.5ul，Taq DNA聚合酶0.15ul。PCR擴增程序為94℃預變性5min；94℃變性20s，53℃退火30s，72℃ 45s，循環30次；最后72℃延伸5min；5)、瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果用TAE電泳緩沖液配制1％瓊脂糖凝膠，在TAE電泳槽中進行水平電泳，加10ul PCR擴增產物，以健康甘蔗總核酸的反轉錄物為模板的PCR產物為陰性對照，以DL2000 Marker為標準分子量，100v/85mA電泳40分鐘，用凝膠成像系統拍攝電泳結果，若在265bp處出現擴增條帶說明RSD為陽性，若在400bp處出現擴增條帶說明SCMV為陽性，若在265bp和400bp均出現擴增條帶說明RSD和SCMV均為陽性，無擴增條帶說明RSD和SCMV均為陰性；6)、一步法多重RT-PCR特異性及敏感性檢測一步法多重RT-PCR敏感性檢測用分光光度計測定呈陽性的RSD、SCMV單一感染樣品和混合感染的核酸，按十倍遞進稀釋法進行稀釋，然后各取1ul進行一步法多重PCR，借助凝膠電泳觀察結果，找出肉眼可見特異電泳條帶所用核酸的最小臨界值，依此得出一步法多重RT-PCR的敏感性。
全文摘要
本發明公開了一種甘蔗花葉病和宿根矮化病病原的多重PCR檢測方法，其特征是(1)取甘蔗植株莖基部帶鞘葉片為檢測樣品；(2)設計反轉錄引物和PCR檢測引物對cpc1、cpc2，RSD引物對F1、F2；對甘蔗花葉病毒和甘蔗宿根矮化病病原的基因片段進行擴增；(3)提取總核酸，將其中的RNA反轉錄成cDNA；(4)設計該一步法多重RT-PCR的反應體系和擴增程序，將核酸進行擴增；(5)利用凝膠電泳分析擴增結果及特異性，同時利用十倍遞進稀釋法檢測該一步法多重RT-PCR的敏感度。本發明所提供的檢測方法通過提取甘蔗的總核酸，在同一個PCR管中完成反轉錄及PCR反應就可以同時檢測出這兩種病害的病原，具有操作簡單、節省時間、成本低、特異性和敏感性高等優點。
文檔編號C12Q1/68GK101186948SQ20071019381
公開日2008年5月28日 申請日期2007年11月23日 優先權日2007年11月23日
發明者張顯勇, 張樹珍, 楊本鵬, 蔡文偉 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所