專利名稱：微生物酶轉化棘白菌素b的方法
技術領域：
本發明涉及生物制藥領域，更具體地，本發明涉及通過微生物酶將棘白菌素B轉化為棘白菌素B母核的方法。
背景技術：
上世紀70年代以來，真菌感染無論是其發生頻率還是感染種類都在不斷地增加，特別是在免疫抑制患者包括HIV感染者、器官移植者、腫瘤患者以及那些患有其它疾病而正進行免疫治療的患者中。直到20世紀80年代末和90年代咪唑類及三唑類抗真菌藥物的研發成功，臨床方能有效而安全地控制真菌感染。雖然這些藥物對控制臨床深部真菌感染起到了重要的作用，但由于這些藥物選擇性差、耐藥真菌的出現以及對諸如曲霉和白色念珠菌等真菌的敏感性不強等原因，深部真菌感染疾病的死亡率仍居高不下。因此，尋找一種新的安全有效的抗真菌藥物就顯得尤為重要。眾所周知，真菌細胞具有細胞壁而哺乳動物細胞沒有細胞壁。因此，真菌細胞壁是新型抗真菌藥物的理想靶點。棘白菌素類藥物是20世紀70年代發現的一組天然產物，由相似的環狀多肽核心和不同的脂肪酸側鏈組成，該脂類側鏈通過非競爭性作用機制抑制β-(1，3)- -葡聚糖的合成，從而導致細胞壁葡聚糖的排空、滲透不穩定以及真菌細胞的溶解而發揮其抗真菌作用。其作用機制獨特，不良發應率低，且對一些唑類和兩性霉素B耐藥的真菌具有很強的抗菌活性，尤其是對諸如曲霉和白色念珠菌等感染趨勢上升的真菌具有良好的殺滅作用。棘白菌素類抗生素主要有三種類型:B，C和D。其中棘白菌素B (Echinocandin B, ECB)是最主要的類型。ECB,是于1974年Nyfeler R.等人發現的由曲霉菌屬Aspergilus nidulans和Aspergilusrugulosus發酵產生的,但由于酰基側鏈的存在，使其具有一定的溶血毒性。以ECB為先導化合物進行結構改造，可以得到一些具有臨床應用價值的化合物，如西洛芬凈(Cilofungin)、卡帕芬凈(Caspofungin, MK991)、米卡芬凈(Micafungin, FK463)、阿尼芬凈(Anidulafungin, LY303366)。西洛芬凈由于毒性和劑型問題終止了研究開發，但后三者已先后在美國(2001年)、日本(2002年)、美國(2006年)首次上市。其中阿尼芬凈是由禮來公司和Vicuron Pharmaceuticals公司聯合研制開發,給藥途徑為靜脈滴注。動物實驗研究表明，同卡泊芬凈和米卡芬凈相比，阿尼芬凈對煙曲霉菌活性更強，對白色念珠菌活性相對較弱。其制備過程包括以下兩步:(I)通過微生物轉化——游動放線菌發酵產生的脫酰化酶對棘白菌素B(Echinocandin B, ECB)進行催化，使側鏈斷裂，生成母核(EchinocandinB Nucleus,ECBN)和不飽和脂肪酸側鏈。(2)在母核的基礎上采用化學合成的方法加入新的側鏈——戊氧-三苯羧基。其中母核的制備是關鍵步驟。目前對于ECB母核的制備，化學方法成本較高，微生物轉化具有以下優點:反應條件溫和、產物單一、高度的化學選擇性、區域選擇性和對映體選擇性、易于純化、不污染環境且能完成一些化學合成難以進行的反應 。美國專利US7785826B2詳細介紹了 ECB轉化ECBN的工藝。此工藝主要流程包括:將ECB發酵完成以后，離心獲得菌絲體，把菌絲體重新懸浮于水中然后加入脫酰酶進行轉化。但此工藝轉化耗時20 30h，且ECB脫酰酶僅利用一次。因此，仍需開發微生物酶轉化棘白菌素B的方法。

發明內容
鑒于現有技術的上述狀況，本發明提供一種簡單的將棘白菌素B(ECB)轉化成棘白菌素B母核(ECBN)的方法，該方法包括以下步驟:I)微生物發酵獲得棘白菌素B脫酰酶；2)發酵完成后，往發酵液中添加磷酸鹽，進行超聲，離心取上清液，即為棘白菌素B脫酰酶粗酶液；3)純化粗酶液，得到棘白菌素B脫酰酶酶液；4)將棘白菌素B溶于乙醇中，與脫酰酶酶液混合并攪拌使其轉化為棘白菌素B母核，轉化完成后，過濾，取濾液；5)濾液過大孔吸附樹脂，棘白菌素B母核吸附于樹脂上，用有機溶劑將棘白菌素B母核洗脫下來。以下詳細說明本發明方法的各步驟:上述方法的步驟I)中，發酵所用菌株可以是天然產酶菌，例如猶他游動放線菌；也可以是基因工程菌，例如白色鏈霉菌基因工程菌株。可采用本領域技術人員熟知的條件進行棘白菌素B脫酰酶的發酵。

棘白菌素B脫酰酶為一種鹽溶性蛋白，且結合在細胞膜上。棘白菌素B脫酰酶發酵完成后，在發酵液中添加一定量的磷酸鹽以形成酸堿緩沖體系，使得磷酸鹽的濃度為0.05M-0.15M，從而提供一定的離子強度以及穩定的pH環境，利于棘白菌素B脫酰酶的溶解和穩定。因此，在本發明的一個優選實施方式中，上述方法的步驟2)中，調節所述緩沖體系的pH為6-7。在本發明的另一個優選實施方式中，超聲該酸堿緩沖體系1-2小時。超聲有利于脫酰酶從細胞膜上脫離下來。離心取上清液，即得棘白菌素B脫酰酶粗酶液。得到棘白菌素B脫酰酶粗酶液后，需對該粗酶液進行純化。根據本發明一個優選的實施方式，所述純化包括使粗酶液旋蒸濃縮并抽濾的步驟。旋蒸后有雜蛋白沉淀出現，抽濾以去除雜蛋白，所得濾液即棘白菌素B脫酰酶酶液。因此上述方法的步驟3)的主要作用是去除棘白菌素B脫酰酶粗酶液中的雜蛋白，并且使酶液得到一定程度的濃縮，提高酶轉化效率。根據本發明的一個優選的實施方式，所述旋蒸溫度為45-50°C，旋蒸時間為1-2小時；所述濃縮為將體積減少至原體積的50-80%。由于棘白菌素B水溶性極差，已公開的轉化方法多采用DMSO為助溶劑，本發明方法的步驟4)中用乙醇替代DMSO作為棘白菌素B助溶劑。乙醇與DMSO相比具有環境友好、無毒、價格低廉等優點，且意外發現利用乙醇作為棘白菌素B助溶劑轉化效率更高。將溶于乙醇的棘白菌素B添加到脫酰酶酶液中配成反應體系，通常將配制好的反應體系置于轉化反應器內，充分攪拌，轉化完成后，抽濾，濾液即棘白菌素B母核。用HPLC定量檢測濾液中棘白菌素B母核的含量。根據本發明的一個優選的實施方式，所述轉化時間可以為6-12小時。根據本發明的另一個優選的實施方式，所述乙醇的濃度為大于或等于95% (體積)。最后一步，濾液過大孔吸附樹脂，棘白菌素B母核吸附于樹脂上，然后用有機溶劑將棘白菌素B母核洗脫下來。轉化產物棘白菌素B母核能夠完全吸附于樹脂上，而一些極性較大雜質則不能吸附。在本發明的一個優選實施方式中，上述方法的步驟5)中上柱后用濃度為30-60%的甲醇水溶液(體積)能夠將棘白菌素B母核完全解析下來，液相純度達到90%以上。根據本發明的一個優選的實施方式，所述大孔吸附樹脂可以選自HP20或XAD18。根據本發明的一個優選實施方式，上柱后脫酰酶酶液按步驟4)-5)可重復使用2-4次。棘白菌素B脫酰酶能夠重復使用是其他已公開的工藝中所未報道的，重復使用棘白菌素B脫酰酶能夠有效降低生產成本，減少能耗。本發明將ECB轉化為ECBN方法的摩爾轉化率高，轉化時間短，產物易于分離純化，能夠有效提高后期分離純化的收率和純度，ECB脫酰酶能夠重復使用。因此適合大規模的工業生產，具有很好的商業價值。


圖1是實施例1第I次轉化后HPLC圖譜；圖2是實施例1第4次轉化后HPLC圖譜；

圖3是實施例2第I次轉化后HPLC圖譜；圖4是實施例2第3次轉化后HPLC圖譜；圖5是實施例3第I次轉化后HPLC圖譜；圖6是實施例3第4次轉化后HPLC圖譜；圖7是實施例1第I次轉化后轉化液過柱后HPLC圖譜；圖8是實施例2第I次轉化后轉化液過柱后HPLC圖譜；圖9是實施例3第I次轉化后轉化液過柱后HPLC圖譜。
具體實施例方式除非另有所指，實施例中的％為重量百分比。以下實施例中，HPLC檢測法的條件如下:流動相:0.2%乙酸銨水溶液:乙腈=95: 5；柱型號:C18，150X4.60mm，3ym;柱溫:40°C；流速:0.7ml/min ；檢測波長:222nm。本發明實施例中所用試劑均可從市售獲得。其中酵母粉(Yeastextract)購自英國Oxoid公司；蛋白胨(Trypton)購自英國Oxoid公司，麥芽浸粉購自上海源聚生物科技有限公司；蔗糖購自上海藍平實業有限公司；葡萄糖購自上海西王淀粉糖有限公司；花生柏粉購自北京康明威培養基技術有限責任公司；燕麥粉購自天津化工經銷部；其余生化試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。HP20樹脂由日本三菱化學公司生產，XAD18樹脂購自羅門哈斯公司。實施例1:I)、棘白菌素B脫酰酶的發酵菌種:猶他游動放線菌(Actinoplanes utahensis NRRL12052),購自美國農業研究菌種保藏中心。培養基配方:斜面培養基:酵母粉0.3%，麥芽浸粉0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，瓊脂
2.5%, pH 7.0-7.2，30°C培養 5-7 天種子培養基:蔗糖2.5%，燕麥粉 2%，酵母粉 0.25%，K2HPO40.1%，KCl 0.05%,MgSO4.7H20 0.05%, FeSO4.7H20 0.0002%, pH = 6.8，30°C培養 4_5 天發酵培養基:蔗糖2.5%,花生柏粉1.2%, K2HPO40.1 %，MgSO4.7H200.3%, pH =
6.8，30°C 培養 3-4 天2)、發酵完成后，發酵液中添加Na2HPO4.12H20和NaH2PO4.2Η20濃度分別為6.1Og/L和5.8g/L，用HCl調節pH為6.0，超聲lh，離心取上清，即為棘白菌素B脫酰酶粗酶液。3)、粗酶液旋蒸濃縮至原體積80%，旋蒸溫度為45°C，旋蒸時間為lh。旋蒸濃縮后有雜蛋白沉淀出現，抽濾去除部分雜蛋白，所得濾液即棘白菌素B脫酰酶酶液。4)、將棘白菌素B溶于95%乙醇中，添加到脫酰酶酶液內配成反應體系，體系內棘白菌素B濃度控制在4mg/ml。將配制好的反應體系置于轉化反應器內，充分攪拌，28°C，150rpm，轉化12h。轉化完成后，抽濾，取濾液HPLC定量檢測棘白菌素B母核含量，并計算底物棘白菌素B的摩爾轉化率為93%。摩爾轉化率％ =生成ECBN摩爾數/底物ECB摩爾數X 100%5)、轉化后濾液過大孔吸附樹脂HP20，棘白菌素B母核完全吸附于樹脂上，用濃度為40%的甲醇水溶液將ECBN集中洗脫下來，由圖7計算的液相純度達到93.3 %。6)、上柱后酶液按步驟4) 5)重復使用3次，摩爾轉化率分別為94%、90 %、86%。實施例2I)、棘白菌素B脫酰酶的發酵菌種:猶他游動放線菌(Actinoplanes utahensis NRRL12052),購自美國農業研究菌種保藏中心。培養基配方:斜面培養基:酵母粉0.3%，麥芽浸粉0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，瓊脂
2.5%, pH 7.0-7.2，30°C培養 5-7 天種子培養基:蔗糖2.5%，燕麥粉 2%，酵母粉 0.25%，K2HPO40.1%，KCl 0.05%,MgSO4.7H20 0.05%, FeSO4.7H20 0.0002%, pH = 6.8，30°C培養 4_5 天發酵培養基:蔗糖2.5%,花生柏粉1.2%, K2HPO40.1 %，MgSO4.7H200.3%, pH =
6.8，30°C 培養 3-4 天2)、發酵完成后，發酵液中添加Na2HPO4.12H20和NaH2PO4.2H20濃度分別為
18.20g/L和15.15g/L，NaOH調pH為7.0，超聲2h，離心取上清，即為棘白菌素B脫酰酶粗酶液。3)、粗酶液旋蒸濃縮至原體積50%，旋蒸溫度為45°C，旋蒸時間為2h。旋蒸濃縮后有雜蛋白沉淀出現，抽濾去除部分雜蛋白，所得濾液即為棘白菌素B脫酰酶酶液。4)、將棘白菌素B溶于無水乙醇中，添加到脫酰酶酶液內配成反應體系，體系內棘白菌素B濃度控制在2mg/ml。將配制好的反應體系置于轉化反應器內，充分攪拌，28°C，150rpm,轉化6h。轉化完成后，抽濾，取濾液HPLC定量檢測棘白菌素B母核含量，并計算底物棘白菌素B的摩爾轉化率為86%。摩爾轉化率％ =生成ECBN摩爾數/底物ECB摩爾數X 100%5)、轉化后濾液過大孔吸附樹脂，棘白菌素B母核完全吸附于樹脂上，用濃度為60%的甲醇水溶液將ECBN集中洗脫下來，由圖8計算的液相純度達到90.7%。6)、上柱后酶液按步驟4 5重復使用2次，棘白菌素B的摩爾轉化率為90%、86%。實施例3I)、棘白菌素B脫酰酶的發酵菌種:猶他游動放線菌(Actinoplanes utahensis NRRL12052),購自美國農業研究菌種保藏中心。培養基配方:斜面培養基:酵母粉0.3%，麥芽浸粉0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，瓊脂2.5%, pH 7.0-7.2，30°C培養 5-7 天種子培養基:蔗糖2.5%，燕麥粉 2%，酵母粉 0.25%，K2HPO40.1%，KCl 0.05%,MgSO4.7H20 0.05%, FeSO4.7H20 0.0002%, pH = 6.8，30°C培養 4_5 天發酵培養基:蔗糖2.5%,花生柏粉1.2%, K2HPO40.1 %，MgSO4.7H200.3%, pH =6.8，30°C 培養 3-4 天 2)、發酵完成后，發酵液中添加Na2HPO4.12H20和NaH2PO4.2H20濃度分別為12.20g/L和10.15g/L，調節pH為6.8，超聲1.5h，離心取上清，即為棘白菌素B脫酰酶粗酶液。3)、粗酶液旋蒸濃縮至原體積70%，旋蒸溫度為50°C，旋蒸時間為1.5h。旋蒸濃縮后有雜蛋白沉淀出現，抽濾去除部分雜蛋白，所得濾液即棘白菌素B脫酰酶酶液。4)、將棘白菌素B溶于無水乙醇中，添加到脫酰酶酶液內配成反應體系，體系內棘白菌素B濃度控制在3mg/ml。將配制好的反應體系置于轉化反應器內，充分攪拌，28°C，150rpm，轉化12h。轉化完成后，抽濾，取濾液HPLC定量檢測棘白菌素B母核含量，并計算底物棘白菌素B的摩爾轉化率為93%。摩爾轉化率％ =生成ECBN摩爾數/底物ECB摩爾數X 100%5)、轉化后濾液過大孔吸附樹脂XAD18，棘白菌素B母核完全吸附于樹脂上，用濃度為50%的甲醇水溶液將ECBN集中洗脫下來，由圖9計算的液相純度達到92.6%。6)、上柱后酶液 按步驟4 5重復使用3次，棘白菌素B的摩爾轉化率為90%、85%,85%o
權利要求
1.將棘白菌素B轉化成棘白菌素B母核的方法，包括以下步驟: 1)微生物發酵獲得棘白菌素B脫酰酶； 2)發酵完成后，往發酵液中添加磷酸鹽，進行超聲，離心取上清液，即為棘白菌素B脫酰酶粗酶液； 3)純化粗酶液，得到棘白菌素B脫酰酶酶液； 4)將棘白菌素B溶于乙醇中，與脫酰酶酶液混合并攪拌使其轉化為棘白菌素B母核，轉化完成后，過濾，取濾液； 5)濾液過大孔吸附樹脂，棘白菌素B母核吸附于樹脂上，用有機溶劑將棘白菌素B母核洗脫下來。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述步驟I)中的發酵所用菌株為天然產酶菌或基因工程菌。
3.根據權利要求1所述的方 法，其中所述步驟I)中的發酵所用菌株為猶他游動放線菌(Actinoplanes utahensis)。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述步驟2)所述超聲持續l_2h。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述步驟2)中往發酵液中添加磷酸鹽，使得磷酸鹽的濃度為0.05M-0.15M。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述步驟2)中將所述發酵液的pH調節為6-7。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述步驟3)所述純化包括使粗酶液旋蒸濃縮并抽濾的步驟。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述步驟3)中所述旋蒸溫度為45-50°C，旋蒸時間為1-2小時。
9.根據權利要求7所述的方法，其中所述步驟3)中所述濃縮為將體積減少至原體積的50-80%。
10.根據權利要求1所述的方法，其中所述步驟4)中所述大孔吸附樹脂選自HP20或XAD18。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述步驟4)中所述轉化時間為6-12小時。
12.根據權利要求1所述的方法，其中所述步驟4)中所述乙醇的濃度為大于或等于95%。
13.根據權利要求1所述的方法，其中所述步驟5)中所述有機溶劑為甲醇水溶液。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述甲醇水溶液的濃度為30-60%。
15.根據權利要求1所述的方法，其中上柱后脫酰酶酶液按步驟4)-5)可重復使用2-4次。
全文摘要
本發明提供一種微生物酶轉化棘白菌素B的方法，包括以下步驟1)微生物發酵獲得棘白菌素B脫酰酶；2)發酵完成后，往發酵液中添加磷酸鹽，進行超聲，離心取上清液，即為棘白菌素B脫酰酶粗酶液；3)純化粗酶液，得到棘白菌素B脫酰酶酶液；4)將棘白菌素B溶于乙醇中，與脫酰酶酶液混合并攪拌使其轉化為棘白菌素B母核，轉化完成后，過濾，取濾液；5)濾液過大孔吸附樹脂，棘白菌素B母核吸附于樹脂上，用有機溶劑將棘白菌素B母核洗脫下來。本發明方法的摩爾轉化率高，轉化時間短，產物易于分離純化，且ECB脫酰酶能夠重復使用。
文檔編號C12R1/045GK103074403SQ20111033011
公開日2013年5月1日 申請日期2011年10月26日 優先權日2011年10月26日
發明者李繼安, 陳詳, 阮建昌, 林慧敏, 陳代杰, 沈劍鋒, 阮霞琴, 石飛燕, 董華成 申請人:上海醫藥工業研究院, 浙江震元制藥有限公司