專利名稱：一種獲得神經白細胞素的方法
技術領域：
本發明屬動物細胞培養領域，涉及細胞分泌的新生化物質的發現、檢測及鑒定的方法。
背景技術：
睪丸支持細胞(Sertoli cell, SCs)是由意大利人Enricol Sertoli于1865年在油鏡下首次發現，并以其名字命名。Sertoli認為支持細胞是圍繞著生精細胞生長的上皮細胞，而這些上皮細胞具有保護生精細胞的功能(Griswold M.D, Morales C, SylvesterS.R.Molecular biology of the Sertoli cell[J].0xford Reviews of ReproductiveBiology,1988，10:124-161)。Sertoli還建立了支持細胞的染色方法，即通過用硝酸和乙酸甚至碘液進行組織顯色觀察，獲得了較清晰的細胞核結構。在Sertoli發現了支持細胞后，學者們展開了大量關于支持細胞的研究。在電子顯微鏡問世以前，SCs —直被認為是生精細胞的支架結構，并作用于生精發生的各個階段從而促進精子細胞的生成。近年來，研究表明了 SCs不僅為生精細胞提供合適的生理發育的微環境，還能提供促進細胞生長和保護細胞免受免疫系統攻擊的活性物質和信號分子。至今，SCs的功能與調控作用還不完全清楚。神經干細胞(Neural stem cell, NSCs)能在體外合適的生長環境中增殖形成神經球，同時保持高度未分化 的特性。1992年Reynolds等首次從成年鼠腦紋狀體中分離出神經干細胞，并成功進行體外培養。體外擴增的神經干細胞克隆具有多分化潛能，并可以被誘導分化形成神經元(neuron),星形膠質細胞(astrocyte)及少突膠質細胞(oligodendrocyte)。神經干細胞體外分化的技術為治療中樞神經系統損傷、神經系統病變及神經退行性疾病的治療帶來希望。根據文獻報道，誘導神經干細胞分化主要通過以下三個方面進行:(I)將攜帶治療作用的目的基因的神經干細胞進行移植；(2)在神經干細胞的生長環境中添加特殊的細胞因子進行誘導；(3)通過與滋養細胞共培養定向分化至功能神經元細胞。神經干細胞向神經元等神經終末端細胞的分化受控于基因的調節，即神經干細胞向不同功能的神經細胞定向分化時需要不同的基因進行調控。NSCs 一直被利用來進行外源移植治療神經退行性疾病(NeurodegenerativeDiseases)，但是直接移植胚胎NSCs會有產生畸胎瘤的風險。為保證移植安全，NSCs常在體外被誘導形成分化終末端的神經細胞以后再進行移植。SCs能夠提供多種神經營養因子和信號分子，在和NSCs共移植能促進發育和干細胞向神經元分化。同時，SCs還能為共移植物提供局部免疫豁免效應從而提聞了移植的效率。但是，目前現有技術中關于支持細胞是否能夠促進神經元存活和軸突生長等方面還鮮有報道，也不清楚這種促進作用是由哪些活性物質所致。

發明內容
本發明的目的在于提供一種產生神經白細胞素(NLK)的方法。
本發明的另一目的在于提供一種促進神經元軸突生長的方法、本發明的另一目的還在于提供神經白細胞素的一種新用途。在本發明的第一方面，提供一種產生神經白細胞素(NLK)的方法，所述方法包括:培養睪丸支持細胞，從而分泌產生神經白細胞素。 在一個優選例中，所述方法包括:(I)采用含10±1% (v/v)血清的DMEM: F12(l: I)基礎培養基培養睪丸支持細胞；(2)細胞貼壁(較佳地，70%以上細胞貼壁；更佳地，75%以上細胞貼壁；更佳地，80%或80%以上細胞貼壁)后，去除含血清的DMEM: F12(l: I)基礎培養基，加入無血清DMEM: F12(l: I)高糖基礎培養基，繼續培養；和(3)步驟(2)獲得的細胞培養物取上清懸濁液，其中含有神經白細胞素。在另一優選例中，所述的血清是胎牛血清。在另一優選例中，步驟(2)中，無血清DMEM: F12(l: I)高糖基礎培養基中，細胞培養2-10天；較佳地2-8天；更佳地2.5-6天，如5天、4天、3天。在另一優選例中，步驟⑴中，培養基中睪丸支持細胞的密度是IX IO4 IXlO6細胞/ml。在另一優選例中，步驟(I)中，培養基中睪丸支持細胞的密度是2X IO4 8X IO5細胞/ml ;更佳地為4X IO4 6X IO5細胞/ml。

在另一優選例中，所述的方法還包括:從睪丸支持細胞培養物中分離分泌產生神經白細胞素。在本發明的另一方面，提供一種促進神經元軸突生長的方法，所述方法包括:(a)培養睪丸支持細胞(作為飼養(層)細胞)，其分泌產生神經白細胞素；(b)在(a)的細胞培養體系中加入神經干細胞；使神經干細胞與睪丸支持細胞混合，或使神經干細胞與睪丸支持細胞不混合但發生胞間物質交換；從而神經干細胞分化為神經元，所述的神經元軸突生長能力增強且軸突上突觸數目增加。在另一優選例中，步驟(a)包括:采用含10 ± I (v/v) %血清的DMEM: F12(l: I)基礎培養基培養睪丸支持細胞；細胞貼壁(較佳地，70%以上細胞貼壁；更佳地，80%以上細胞貼壁；更佳地，90%以上細胞貼壁)后，去除含血清的DMEM: F12(l: I)基礎培養基。在另一優選例中，步驟(a)中，睪丸支持細胞的密度是IXlO4 IX IO6細胞/ml (較佳地2X IO4 8X IO5細胞/ml ;更佳地為4X IO4 6X IO5細胞/ml);和/或步驟(b)中，神經干細胞的密度是IX IO4 IX IO6細胞/ml (較佳地2X IO4 8 X IO5細胞/ml ;更佳地為4 X IO4 6 X IO5細胞/ml)。在另一優選例中，步驟(b)中，通過滲透膜隔離神經干細胞與睪丸支持細胞，使神經干細胞與睪丸支持細胞不混合但發生胞間物質交換。在另一優選例中，所述的滲透膜是孔徑為0.m的膜。在另一優選例中，所述的方法的步驟(b)之后還包括:分離所述的神經干細胞。在另一優選例中，步驟(b)中，加入神經干細胞后繼續培養2-10天(較佳地4-10天；更佳地5-9天，如6天、7天、8天)。在本發明的另一方面，提供一種神經白細胞素的用途，用于制備促進神經元軸突生長的組合物。在另一優選例中，所述組合物還用于增加神經元上突觸數目。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1、睪丸支持細胞鑒定。A:HE染色鑒定；B =DAPI熒光染色鑒定；C:掃描電子顯微鏡下10000倍放大效果圖。圖2A、神經干細胞聚集體的形成。圖2B、熒光顯微鏡下觀察在第72h時形成的神經球。圖3、神經干細胞及其分化后神經元與星形膠質細胞的鑒定圖。A圖為分離培養第3代后NESTIN陽性單細胞；B圖為DAPI細胞核熒染；C圖為A，B的合成圖；D圖為神經干細胞分化成的神經元(標記beta TujIII) ;E圖由神經干細胞分化而成的星形膠質細胞(標記GFAP) ；F圖為神經干細胞接種后培養第3天時形成的神經球的NESTIN熒光照片(比例尺:30 u m) o圖4、神經干細胞培養至第一、三、五天時的形態變化(比例尺:30 U m)。A、B:第一天時為單細胞形態；C:第三天時的神經球；D:第五天時的神經球。圖5、在不同接種密度條件下神經干細胞的生長變化曲線。圖6、通過免疫熒光染色分析神經干細胞分別在第I (A-C)，2 (D-F)，3 (G-1)代時的細胞純度變化。(A，D，G ):Nestin陽性細胞；(B，E，H):DAPI核熒光染色；(C，F，I):復合圖。圖7、神經干細胞在第一、二、三代時的純度變化。圖8、皮層神經干細胞在分化培養基(DM)、條件培養基(CM)和支持細胞飼養層(Sertoli)培養時的存活率。當培養至第7天時，存活率由臺盼藍染液染液檢測。圖9、SDS-PAGE檢測支持細胞培養上清液中的蛋白條帶。圖10、UPLC-ES1-MS/MS分析結果中神經白細胞素的鑒定結果(SEQ IDNO:19)。圖11、瓊脂糖凝膠電泳圖分析了在SCs中mRNA表達情況。圖12、三種培養模式在一、三、七天時軸突生長狀態比較。圖13、在三種培養模式下第7天時的軸突生長狀態。圖14、在三種培養模式下第7天時的軸突上突觸數目。
具體實施例方式本發明人致力于尋找新的在促進神經元分化過程中起作用的支持細胞活性物質，通過將支持細胞與神經干細胞共培養的方法，本發明人意外發現這種培養促進了神經元分化，并且發現，支持細胞分泌神經白細胞素與這種神經元分化的促進具有關聯。產生神經白細胞素的方法由于過去并未在睪丸支持細胞中發現神經白細胞素，本發明第一次揭示并驗證了神經白細胞素的存在。在鑒定、分析支持細胞分泌物時，采用將超濾管離心濃縮后的蛋白樣品進行SDS-PAGE分析，然后進行考馬斯亮藍染色、洗脫后分辨出各區間的蛋白條帶。在將切下的蛋白條帶通過高效液相串聯二級質譜分析方法初步得到胞外分泌蛋白種類的結果后，再利用逆轉錄-聚合酶鏈反應法(RT-PCR)鑒定細胞內神經白細胞素的mRNA表達。在確定該物質在蛋白質和核酸水平上均有表達后，分別在誘導分化的神經元培養環境中外源添加與拮抗該活性物質后，通過免疫細胞化學熒光染色分析法分析神經元的生長狀況。在神經元培養物中單獨添加神經白細胞素可以使得其存活率達到60%，顯著高于未添加的對照組。由于神經白細胞素在胞外呈單體結構并具有保護神經元、促進軸突生長及抗凋亡等作用，該物質主要可作為外源添加劑用于神經系統修復或神經干細胞移植治療神經退行性疾病等過程中。本發明首先提供了一種產生神經白細胞素(NLK)的方法，所述方法包括:培養睪丸支持細胞，從而分泌產生神經白細胞素。作為本發明的優選方式，先將睪丸支持細胞在含血清的培養基中培養，使其良好地貼壁，然后再去除血清后(可通過采用無血清培養基洗滌來去除血清)，使用無血清的培養基培養。培養的時間通常在2-10天(較佳地2-8天；更佳地2.5-6天，如5天、4天)，從而獲得的培養物的上清中存在有神經白細胞素。培養基中睪丸支持細胞的密度決定了其是否可以實現良好的貼壁，因此，本發明人優化了接種細胞的密度，較佳地，培養基中睪丸支持細胞的密度是I X IO4 I X IO6細胞/ml ;更佳地，培養基中睪丸支持細胞的密度是2X IO4 8X IO5細胞/ml ;更佳地為4X IO4 6X IO5 細胞/ml。作為本發明的優選方式，所述的方法還包括:從睪丸支持細胞培養物中分離分泌產生神經白細胞素。神經白細胞素作為一種蛋白，可以采用本領域常規的或公知的許多技術來將之分離。例如但不限于:硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose離子交換、UltrogelAcA34凝膠過濾三步法純化；或采 用N1-1DA親和層析一步法純化。細胞培養時采用的基礎培養基是商業化的培養基，其中的成分可確保睪丸支持細胞良好地生長。例如，所述的基礎培養基是DMEM: F12(l: I)高糖基礎培養基，該培養基為已完全商業化的，例如是購自Gibco公司的產品。本發明的方法產生的神經白細胞素是產生自細胞的，因此其是一種天然的蛋白，保留了其原有的天然活性。促進神經干細胞的分化基于本發明人的新發現，本發明還提供了一種促進神經元軸突生長的方法，所述方法包括:(a)培養睪丸支持細胞(作為飼養(層)細胞)，其分泌產生神經白細胞素；(b)在(a)的細胞培養體系中加入神經干細胞；使神經干細胞與睪丸支持細胞混合，或使神經干細胞與睪丸支持細胞不混合但發生胞間物質交換；從而神經干細胞分化為神經元，所述的神經元軸突生長能力增強且軸突上突觸數目增加。由于促進神經干細胞的活性物質是神經白細胞素，其可被分泌表達于培養基中，因此所述的神經干細胞與睪丸支持細胞之間可以隔離培養，兩者之間通過設置滲透膜來實現物質的交換，這種培養方式對于后續兩種細胞的分離是非常有利的。所述的滲透膜具有合適的微孔，從而使得兩種細胞不會穿透而它們所分泌產生的分子能夠穿透。例如，所述的滲透膜是孔徑約0.4 的膜。本發明首次揭示神經白細胞素(neuroleukin)是支持細胞分泌的促進軸突生長的活性物質之一。在本發明的具體實施例中，為了驗證支持細胞分泌的促進軸突生長的活性物質，通過總RNA提取和逆轉錄PCR驗證了支持細胞表達神經白細胞素(NLK)的mRNA，并通過超高效液相串聯二級質譜驗證NLK存在于支持細胞上清液中。在支持細胞飼養層中外源添加抗神經白細胞素抗體后，培養到第7天時神經元軸突長度減少到了 108 ym，與外源添加NLK的支持細胞直接共培養條件達到的176 ii m相比較要少得多，所以NLK對促進軸突生長和提高神經元存活率有很大的貢獻，是支持細胞分泌的一種重要活性物質。因此，分化自皮層神經干細胞的神經元的軸突生長和神經元存活率的提高都能夠由支持細胞所調節，并且發現由支持細胞分泌的神經白細胞素(neuroleukin)起到了重要作用。這不僅能夠提供大量的可供移植治療用的神經元來源，還能強化神經元之間的相互作用，從而提高移植的效率。本發明的揭示為支持細胞與神經干細胞共移植治療神經退行性疾病的方法奠定了理論基礎。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1、支持細胞的體外分離、傳代和鑒定1.睪丸組織支持細胞(SCs)的體外分離

支持細胞分離主要參照Welsh和Wiebe的方法(Welsh M.J, Wiebe J.P.Sertoli細胞 from immature rats:1n vitro stimulation of steroid metabolism by FSH[J].Biochemical and Biophysical Research Communications, 1976,69 (4):936-941),力口以改進并在無菌條件下進行，描述如下:首先將10-15天ICR雄鼠(中國科學院實驗動物部，上海)拉頸處死，分離雄性ICR小鼠的雙側睪丸組織，在解剖鏡下操作剝去脂肪組織與組織白膜，然后將生精小管剪碎成Imm3的小塊。用質量體積比為0.2% I型膠原酶和0.2% (w/v)胰蛋白酶等體積混合在36.5°C恒溫水浴鍋內消化30min，之后吹打成細胞懸液，經過200目細胞篩過濾后靜置3min，棄上清液。用含10%% (v/v)FCS的DMEM: F12(l: I)高糖基礎培養基(GIBC0，美國；除非另外說明，該培養基中含有葡萄糖4.5g/L)重懸細胞，原代培養以5X IO5細胞/ml的高細胞密度接種于培養瓶內，在37°C，5% (v/v)CO2的飽和濕度環境下培養。同時，進行差速貼壁lOmin，以除去培養液中的雜細胞，然后更換培養液繼續培養并作PO代細胞，之后傳代細胞稱為Pl，P2......代。2.支持細胞的傳代觀察培養48h的細胞形態，在細胞生長接近80%覆蓋瓶底時進行胰酶消化傳代培養。首先將細胞培養液吸取棄掉，用0.1M PBS溶液清洗2遍，加入0.2% (w/v)的胰蛋白酶液進行消化3min，當觀察細胞基本懸浮后，立即補充2ml培養液(含10% (v/v)胎牛血清的高糖DMEM培養基)進行緩慢吹打瓶底，將全部細胞吹起后收集進行800rpm離心3min。去上清液后再次補加培養液進行細胞重懸，計數后在CO2恒溫培養箱中進行傳代培養。
3.支持細胞的鑒定方法(1)蘇木精伊紅(Hematoxylin-Eosine, HE)染色支持細胞鑒定采用HE染色方法。即將細胞放入二甲苯液中10min、95% (v/v)乙醇溶液2min、80% (v/v)乙醇2min、75% (v/v)乙醇2min，然后在完全脫水后用蘇木精染液染色lOmin，流水稍微清洗3s洗掉表面殘留大量的蘇木精染色液。將細胞放入I % (v/v)鹽酸乙醇3s后再次用清水漂洗30s,然后在伊紅染液中浸泡3min,依次浸入75% (v/v) >80%(v/v) >95% (v/v)和無水乙醇中浸泡各5min,再在二甲苯中脫水5min后用中性樹膠封固，光學顯微鏡下進行觀察。(2)掃描電子顯微鏡觀察將玻片上游離細胞用0.1M PBS清洗I遍，用0.1M PBS配制的2.5% (w/v)戊二醒固定液在4°C條件下預固定。1% (w/v)鋨酸在4°C條件下固定Ih,之后用0.1MPBS漂洗3次，5min/次。后采用梯度乙醇(按照體積分數分別為:30%、50%、70%、85%和100% )進行逐步脫水，在4°C條件下晾干。噴鍍金后在掃描電子顯微鏡下觀察。4.細胞生長參數分析活細胞計數:胎盤藍染色液染色鑒定細胞活性，同時由血球計數板計數。細胞存活率=活細胞數/(活細胞數+死細胞數)X 100% ；支持細胞純度=支持細胞數/總細胞數X100%。生長曲線分析:將傳代至P2代的細胞以3種不同細胞密度(0.5X IO5細胞/ml，2 X IO5細胞/ml，5 X IO5細胞/ml)接種于25mm2培養瓶內，每隔6h取每組3孔的細胞分別計數。經數據統計后通過EXCEL軟件作細胞生長曲線。5.統計分析方法數據用平均數(X—)表示，應用SPSS 10.0統計軟件進行單因素方差分析的多重比較。6.結果睪丸支持細胞顯著結構特征是雙核仁結構。分離自小鼠睪丸組織的支持細胞在體外培養后分別通過蘇木精伊紅染色、DAPI核熒光染色和電子顯微鏡進行觀察鑒定。蘇木精伊紅染色后，在光學顯微鏡下可見分離的支持細胞胞體為寬大的柱狀及典型的雙核仁結構，細胞核呈卵圓或不規則形，胞質內有可見透明的小空泡結構(圖1A);同時，通過DAPI進行細胞核熒光核染后，同樣能夠清晰看到雙核仁典型結構(圖1B)。通過掃描電子顯微鏡觀察支持細胞的外形結構，發現在支持細胞表面有大量粗大的突觸(圖1C)，根據細胞形態學分析，該大量的突觸可能與支持細胞吞噬細胞殘片和貼壁生長等生理作用有關。在新制備的支持細胞懸液經胎盤藍染色計活細胞數后得到的細胞存活率達93%以上，每只睪丸組織大約可獲得支持細胞I X IO6-1 X IO7個。培養24小時后，小鼠睪丸支持細胞貼壁生長體積不斷增大呈不規則片狀結構，同時呈現梭狀胞體。綜上，成功分離和鑒定了小鼠睪丸支持細胞。通過HE染色和DAPI核熒光染色進行觀察，表明分離的細胞具有典型雙核結構，即鑒定為支持細胞。實施例2、胚胎神經干細胞的體外分離、培養及鑒定1.胚胎皮層神經干細胞(NSCs)分離方法孕齡14天ICR孕鼠1只，在其腹部用75% (v/v)乙醇噴灑消毒，剪開腹部皮膚肌肉后暴露其腹腔及子宮，迅速分離出胎鼠，放入盛有加入I % (w/v)青霉素和鏈霉素的0.1MPBS溶液中，移入超凈臺，將胎鼠在新皿內清洗后再轉入另一皿內浸泡5min。按以下操作在無菌條件下完成取出胎鼠皮層腦組織的一系列操作:a.從腦前額邊緣揭腦膜；b.挑取一側腦皮層放置在裝有0.1M PBS溶液中；c.用鑷子撕碎組織；d.加入等量胰蛋白酶液在37 °C條件下消化30min。準備15ml無菌離心管,加4ml洗液與I滴FCS準備終止消化，吸出皿內組織后在800rpm條件下離心3min。上清做廢液處理后再加7ml洗液清洗(期間準備血球計數板計數)，離心完后按分離細胞數量加入培養液重懸細胞，并計數。以1父105細胞/1111密度接種細胞在371:，5% (v/v)CO2恒溫培養箱中`培養。2.皮層神經干細胞的傳代培養觀察皮層神經干細胞生長狀態良好，神經球邊緣清晰且懸浮生長。吸出細胞懸液以800rpm離心3min。棄上清后，以Iml 0.2% (w/v)胰蛋白酶液吸出細胞后置于37°C CO2恒溫培養箱中孵育消化3min。吸出細胞后轉移至終止液內輕柔吹打后繼續以800rpm離心3min。再次棄上清后以2ml培養液重懸細胞并計數。3.免疫細胞化學熒光染色方法將神經干細胞(NSCs)以合適的密度接種在涂有多聚賴氨酸的12孔板內培養，觀察細胞貼壁生長狀態良好，呈圓形或有1-2個觸角伸出。按以下步驟進行免疫細胞化學熒光染色操作:在每孔中補加適量0.1M PBS清洗，搖床上搖勻IOmin ;吸取PBS棄掉，補加4%多聚甲醛在4°C條件下固定Ih ;吸取多聚甲醛溶液補加PBS適量清洗IOmin ;補加500iUl%的PBST常溫孵育，搖勻30min;0.0lMPBS清洗后用含5% (v/v)山羊血清(BIOffEST)溶液封閉30min。用稀釋液稀釋一抗鼠源Nestin (I: 200, SANTA CRUZ)在4°C條件下孵育細胞過夜，回收一抗后用0.1M PBS清洗，同樣由0.3% (v/v) PBST配制含3%(v/v)山羊血清溶液避光按1: 100稀釋羊抗鼠熒光二抗(Jackson，美國)，每孔加200 ill在4°C條件下孵育lh。用PBS清洗后避光保存，同時也可以在熒光顯微鏡下進行觀察。對于成熟神經元和星形膠質細胞的免疫熒光染色步驟基本同上，不同之處在于用鼠源一抗PTujIIId: 2000，Sigma)孵育成熟神經元細胞，用鼠源一抗GFAP (I: 1000，Sigma)孵育星形膠質細胞。4.統計分析方法數據用平均數(x")表示，應用SPSS 10.0統計軟件進行單因素方差分析的多重比較。5.結果(I)皮層神經干細胞的分離及鑒定如上方法對ICR孕鼠進行皮層神經干細胞的分離。體外培養后發現單純機械吹打和加0.2%胰蛋白酶消化得到的單細胞懸液含有較多的未完全消化的組織塊，如經培養后會聚集周圍單細胞形成聚集體(Aggregation),而并非由單細胞增殖形成的神經球(圖2A)。由于聚集體會導致團塊內部的細胞因無法取得營養物質而逐漸衰老死亡，因此聚集體越少越好。如果利用較高濃度的胰酶液進行消化細胞或者時間延長后得到的單細胞進行培養則容易在培養3天后出現成片的絮狀物，可能是細胞因消化程度過度而死亡引起的。實驗結果表明:0.2% (w/v)胰蛋白酶消化液消化3min為最佳，傳代的細胞生長狀態良好，在36h可觀察二分裂細胞形態，在72h后會出現多于10個細胞組成的神經球(圖2B)。細胞鑒定以其生物標記物鑒定是一種高效方法之一，如Nestin是神經干細胞的特征物質之一(丁道芳，邢三麗，周鳴鳴，宋后燕.大鼠胚胎神經干細胞單克隆化及單層化培養和鑒定[J].生物化學與生物物理進展，2009，36 (I):72-76)，P TujIII是神經元細胞重要生物標記物之一 (Hill E.Jjffoehrling E.K,Prince M,Coleman M.D.Differentiatinghuman NT2/D1 neurospheres as a versatile in vitro3D model system fordevelopmental neurotoxicity testing[J].Toxicology,2008, 249:243-250), GFAP 是星形膠質細胞生物標記物之一(Sakuragawa N, ThangavelR, Mizuguchi M, Hirasawa M,Kamo 1.Expression of markers for both neuronal and glial 細胞 in human amnioticepithelial 細胞[J].Neuroscience Letters, 1996, 209:9_12)。因此，皮層神經干細胞的鑒定可以形成的神經球或分散的神經單細胞通過Nestin免疫細胞化學熒光染色來實現。取分化培養液中孵育3天后的混合細胞經NestiruGFAP和P -TujIII等特征生物標記物的免疫熒光染色分析對分化細胞中星形膠質細胞和成熟神經元細胞的鑒定。由圖3可知:神經干細胞不論在單細胞形態還是處在神經球形態都會大量表達Nestin特征蛋白，并在熒光二抗的作用下顯 示出綠色熒光。在分化培養基的誘導分化作用下，這些細胞失去了原先的干細胞特性不再表達Nestin，并且向神經元和星形膠質細胞方向開始分化。結果顯示了干細胞的多分化潛能的特性。因此，本實施例中分離獲得的細胞是神經干細胞，并可分化為神經元細胞和星形膠質細胞。(2)皮層神經干細胞的形態學觀察在倒置相差顯微鏡下可見接種的單細胞形態圓潤，折光性好，且胞體較小。培養至第3天結束時神經干細胞基本處于10個細胞克隆組成的神經球和簡單較小的神經球。培養至第5天，活力不強的單細胞或神經球在個體大小的指標上會明顯小于活力較強的神經球，正常的神經球會有50個以上的神經細胞組成并懸浮生長于培養基中(圖4)。在原代PO傳代培養后，傳代周期可由原代PO的5天縮短至4天，因為隨著細胞純度提高，獲得細胞的速率也隨之增加。(3)皮層神經干細胞的傳代培養與細胞純度分析原代胎鼠來源的神經干細胞接種密度以三種初始密度(5X IO5細胞/ml，IX IO5細胞/ml，0.5 X IO5細胞/ml)進行接種，培養至第5天時的結果如圖5。IXlO5細胞/ml的接種密度培養時，在培養第5天時，每個神經球所含神經細胞數目最高可達50個以上。如果以5 X IO5細胞/ml較高的密度接種，在第2天時培養液已經變黃，需頻繁消化重懸培養，而過于頻繁的操作會導致細胞生長活性下降。同時，已經形成的神經球老化速度也將增加，單個細胞的生長狀況也開始下降。若以衰老的神經球進行傳代培養，得到的細胞因增殖活力不佳開始逐漸死亡。因為機械吹打細胞不能保證神經球分散均勻，所以加入胰酶消化后可減少傳代過程中神經球的數目。因此，以IX IO5細胞/ml的接種密度培養為較佳。通過免疫細胞化學熒光染色法將Nestin陽性的NSCs標記后計數，接著利用DAPI核熒光染色標記視野內所有的細胞，并計細胞總數，最后利用公式(神經干細胞純度=Nestin陽性細胞數/DAPI熒光染色的細胞數X 100% )計算出神經干細胞的純度。隨著傳代過程中，不斷收集生長活性較強的神經球，使得細胞碎片和活性低的神經細胞所占比例越來越低，從而提高了高活性的神經干細胞的比例。在第一和第二代時神經干細胞的比例分別是36%和74%，而最終神經干細胞的比例在第3代時達到92% (圖6，圖7)。綜上，本實施例采用機械分離法和酶消化法分離NSCs，獲得的NSCs存活率為92%。剛分離得到的細胞呈圓形表面光滑無突起，體積較大，邊界清楚并且折光性強。接種3天后可形成較小的神經球，培養至第5天時單個神經球能達到50個以上的單細胞，此時開始進行傳代培養。傳代后得到的單細胞在合適的培養條件下培養再次形成神經球的方式與形成時間及形態均與原代相似，并且在細胞表面特異性抗原蛋白Nestin檢測仍然呈陽性，證明了神經干細胞在培養過程中仍然保持干細胞特性并具有很強的增殖能力。實施例3、大腦皮層神經干細胞與支持細胞共培養及活性物質鑒定1.培養液配制神經干細胞增殖培養基(液):pH為7.4的IOOml高糖DMEM: F12(l: I)基礎培養基中添加終濃度為20ng/mlbFGF、20ng/ml EGF、 質量體積比分別為I % N2、I % B27、I % Gln和I %青霉素/鏈霉素(P/S)。消化終止液:IOml高糖DMEM: F12(l: I)基礎培養基中添加I滴胎牛血清。0.3% (v/v) PBST 溶液:在97ml 0.1M PBS溶液中添加3ml TritonlOO，在40°C水浴條件下溶解3h。抗體封閉液:在0.3% PBST溶液中添加5% (v/v)的山羊血清，混勻后在室溫條件下使用。抗體稀釋液:在0.3% PBST溶液中添加3%的山羊血清后可用于稀釋一抗和二抗。分化培養基(DifferentiationMedia, DM):在基礎培養基(DMEM: F12(l: I)高糖培養基；購自Gibco)中添加1%FCS，1%B27,1% N2 和 1% Gln ；DEPC 水:在IL水中添加Iml DEPC進行攪拌過夜，第二天將DEPC水進行120°C條件下高溫高壓處理，可與4°C條件下保藏。支持細胞無血清條件培養基(Conditioned Medium, CM),制備如下:正常條件下，支持細胞在含10 %胎牛血清(fetal calf serum, FCS)的DMEM: F12(l: I)高糖基礎培養基)中培養增殖，但在無血清的DMEM: F12(l: I)的培養條件下支持細胞是不能存活的，支持細胞貼壁稀疏的區域在24h后開始變形萎縮成細長的竹葉狀，貼壁稠密區域整片細胞24h后開始有卷曲脫離培養瓶的現象。同樣只在神經干細胞(neural stem cells, NSCs)增殖液中的原代支持細胞也是無法存活的,但原代支持細胞可以在含0.1% “胰島素-轉鐵蛋白-硒”這個物質的DMEM: F12(l: I)的培養基中進行無血清培養增殖[Yue F, Cui L, Johkura K, Ogiwara N, Sasaki K.1nduction ofmidbrain dopaminergic neurons from primate embryonic stem cells by coculturewith sertoli cells [J] Stem Cells，2006，24:1695-1706]。在本實驗過程中，將分離下來的傳代至第3代的支持細胞消化后重懸于含10% FCS的DMEM: F12(l: I)基礎培養基中并以5X IO5細胞/ml的密度接種5ml在25cm2培養瓶中培養48小時，待支持細胞鋪滿瓶底80%的面積(即80%貼壁)后，吸去含血清培養基，用DMEM: F12(l: I)高糖基礎培養基清洗細胞3次，補加無血清DMEM: F12(l: I)高糖基礎培養基孵育3天，然后再取出上清懸濁液進行離心，2000rpm離心IOmin后，去除細胞的上清液即為支持細胞條件培養基，可-20°C冷凍保存或用于分析其中的化學或生物學成分。2.支持細胞與神經干細胞直接共培養支持細胞懸于含10%胎牛血清的DMEM: F12(l: I)基礎培養基中，以5X IO4細胞/ml的細胞密度在12孔板中按每孔500 u I接種SCs細胞，待培養I天后95%以上細胞貼壁良好，用無血清DMEM: F12(l: I)高糖基礎培養基清洗以去除血清3次；同時，將神經干細胞懸于基礎培養基中，并以5 X IO4細胞/ml的細胞密度接種500 ill至飼養層上進行共培養。在第3天，第6天和第10天時取樣觀察樣品與陽性對照樣品之間的差別。陽性對照:將神經膠質細胞作為飼養層與神經干細胞共培養，共培養方法同上。3.Transwell 孔板培養Transwell滲透膜的應用能夠說明支持誘導干細胞分化和促進神經元生長是因為SCs分泌的活性蛋白還是由于細胞與細胞之間相互接觸導致的。用添加了質量體積比為I %谷氨酰胺(Gln)和I %P/S的DMEM: F12(l: I)高糖基礎培養基作為細胞共培養的培養基，將懸浮的NSCs以5X IO4細胞/ml密度接種在涂有左旋多聚賴氨酸的12孔板底部，SCs以5 X IO5細胞/ml密度接種在有0.4 ii m膜的嵌套內進行37 °C、含5 % (v/v) C02_95 %(v/v)空氣的條件下培養。

4.條件培養基孵育神經干細胞將在含10%胎牛血清(FCS)的DMEM: F12(l: I)高糖基礎培養基中培養的支持細胞以無血清基礎培養基清洗后重懸于DMEM: F12(l: I)高糖基礎培養基中培養，3天后收集培養液，迅速離心取上清作為支持細胞條件培養基，待用。以I X IO5細胞/ml的細胞密度將重懸于條件培養基中的神經干細胞接種5ml于25cm2培養瓶中培養，37°C，5% CO2條件下培養3天可取樣觀察并檢測。5.分化培養基孵育神經干細胞以IX IO5細胞/ml的細胞密度將重懸于分化培養基中的神經干細胞接種5ml于25cm2培養瓶中培養。從第二天起可取樣觀察以及檢測。6.細胞免疫熒光染色分析為了檢測細胞中存在的特定蛋白的分布，皮層神經干細胞以接種密度5X IO4細胞/ml的細胞密度接種在左旋多聚賴氨酸涂布的6孔板上再37°C、含5% C02-95%空氣的條件下，用無血清神經干細胞增殖培養基進行培養。在Transwell嵌套上接種SCs，然后于第2天將其放置在神經干細胞培養環境中培養，共培養系統中的培養液換成DMEM: F12(l: I)高糖培養基。經過72h的誘導培養過程后，用4%多聚甲醛在4°C條件下固定分化的神經細胞 30min后，用 0.0lM PBS (phosphate buffered saline)洗漆 5min,再用 1% (v/v)PBST孵育30min (在PBS中添加1% Triton-100)，接著PBS清洗3次，每次5min，再用含5%山羊血清的0.3%的PBST孵育30min，然后分別添加小鼠源單克隆抗體0TujIII(l: 2000稀釋；Sigma-Aldrich Inc.)和兔源單克隆抗體 GFAP (1: 300 稀釋；Santa Cruz BiotechnologyInc.)在4°C條件下進行孵育過夜。第2天用0.01M PBS清洗細胞5分鐘后，進行熒光二抗突染(抗小鼠 IgG, 1: 200 稀釋；抗兔 IgG, 1: 200 稀釋，Jackson Immuno-ResearchLaboratories Inc.)在室溫，避光條件下染色2h，然后用0.0lM PBS清洗細胞3次后(每次5分鐘),利用DAPI (I u g/ml, 4,6-diamidino-2-pheny I indole)在避光條件下進行細胞核熒光染色。抗體的特異性利用表達相關蛋白的細胞作為陽性對照，陽性對照的細胞克隆只包含已染色的細胞。為了檢測陽性細胞比率，隨機選取不同分化階段的細胞克隆進行免疫染色并在核染計數所有細胞后計算陽性率。7.細胞存活率分析在不斷酶消化和傳代后，皮層神經干細胞的存活率通過臺盼藍染液進行染色分析。有形態缺陷的或者不完整的細胞膜的細胞不能抵御臺盼藍染液的侵染，從而胞體變成藍色。在光學顯微鏡下觀察細胞并進行計數分析。8.總 RNA 提取和 RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR)反應細胞總RNA 通過 TRIzol 試劑盒(Invitrogen,http://www.1nvitrogen.com)進行提取。提取的RNA純度通過紫外光譜成像系統(UV-spectrophotometer)進行分析。總RNA提取操作如下:(I)用1ml Trizol溶解細胞沉淀后，將細胞懸液轉移至1.5ml EP管內靜置5min ；(2)向EP管內 添加0.2ml氯仿，上下震蕩15s，靜置2min后在冷凍離心機中以12000rpm 速率離心 12min ；(3)分層后取出上清RNA水相層溶液并轉移至新的1.5ml EP管內，加入等體積異丙醇沉淀核酸，混勻后于室 溫下靜置lOmin，之后再在冷凍離心機中以12000rpm速率離心lOmin，離心結束可見側壁和底部有少許沉淀，去上清并以75%乙醇溶液洗滌I次；(4)洗滌后在冷凍離心機中以12000rpm速率離心5min，棄上清后室溫下晾干，最后視RNA提取量加入10-15 ill無RNase的DEPC水。溶解后可在紫外分光光度計下在260nm條件下測OD值。利用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara Shuzo, Japan)將5u g RNA逆轉錄成cDNA。每份cDNA與設計的特定引物(表I)和Taq DNA聚合酶(Takara)混合后進行RT-PCR分析，之后反應產物在含1%瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。反轉錄PCR 反應體系:25 ii I 體系中添加 5 ii I 5 X bufferUO u I dNTPU U RNase抑制液、Iu I反轉錄酶和8iU DEPC水。將樣品混勻后，在如下設定程序下進行:42°C，90min，95°C IOmin然后4°C 5min。反應結束后反應液于_20°C保存。PCR反應:在25 ill反應體系中，有4 ill dNTP、正反引物各2 yl、LA-TaqDNA聚合酶0.5 ii 1、反轉錄PCR反應液3 ill和DEPC水13.5 ill。樣品混勻后，在如下設定程序下進行:95V 5min、94°C 30s,55°C 30s,72°C lmin、72°C 7min、4°C 5min，其中第 2 步到到第 4 步之間循環次數為30次。反應結束后直接進行核酸凝膠電泳分析。表1、基因和引物設計
權利要求
1.種產生神經白細胞素的方法，其特征在于，所述方法包括:培養睪丸支持細胞，從而分泌產生神經白細胞素。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)采用含10±1%(v/v)血清的DMEM: F12(l: I)基礎培養基培養睪丸支持細胞； (2)細胞貼壁后，去除含血清的DMEM: F12(l: I)基礎培養基，加入無血清DMEM: F12(l: I)高糖基礎培養基，繼續培養；和 (3)步驟(2)獲得的細胞培養物取上清懸濁液，其中含有神經白細胞素。
3.權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，無血清DMEM: F12(l: I)高糖基礎培養基中，細胞培養2-10天。
4.權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，培養基中睪丸支持細胞的密度是 I X IO4 I X IO6 細胞 /ml。
5.種促進神經元軸突生長的方法，其特征在于，所述方法包括: (a)培養睪丸支持細胞，其分泌產生神經白細胞素； (b)在(a)的細胞培養體系中加入神經干細胞；使神經干細胞與睪丸支持細胞混合，或使神經干細胞與睪丸支持細胞不混合但發生胞間物質交換；從而神經干細胞分化為神經元，所述的神經元軸突生長能力增強且軸突上突觸數目增加。
6.權利要求5所述的方法，其特征在于， 步驟(a)包括:采用含10 ± I (v/v) %血清的DMEM: F12(l: I)基礎培養基培養睪丸支持細胞；細胞貼壁后，去除含血清的DMEM: F12(l: I)基礎培養基。
7.權利要求5所述的方法，其特征在于， 步驟(a)中，睪丸支持細胞的密度是I X IO4 I X IO6細胞/ml ;和/或 步驟(b)中，神經干細胞的密度是I X IO4 I X IO6細胞/ml。
8.權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(b)中，通過滲透膜隔離神經干細胞與睪丸支持細胞，使神經干細胞與睪丸支持細胞不混合但發生胞間物質交換。
9.種神經白細胞素的用途，用于制備促進神經元軸突生長的組合物。
10.權利要求9所述的用途，所述組合物還用于增加神經元上突觸數目。
全文摘要
本發明涉及一種獲得神經白細胞素的方法。本發明人通過將支持細胞與神經干細胞共培養的方法發現這種培養促進了分化后神經元軸突的生長以及提高了神經元的存活率，并且發現支持細胞分泌神經白細胞素與這種對神經元生長與存活的促進具有關聯。因此，可應用支持細胞來產生神經白細胞素，以及應用支持細胞來促進神經元生長與存活。
文檔編號C12N5/0793GK103088092SQ201110332380
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月27日 優先權日2011年10月27日
發明者郭美錦, 鄧磊, 張嗣良, 儲炬, 莊英萍 申請人:華東理工大學