專利名稱：卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法
技術領域：
本發明涉及一種卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法，屬于雙微體分離純化技術領域。
背景技術：
雙微體(double minute chromosomes，DMs)是細胞中攜帶擴增基因的染色質絲形成的環狀、無著絲粒和端粒、可自主復制、成對出現的顆粒狀結構，是基因擴增的主要細胞遺傳學標志，是染色體外遺傳單位的ー種主要存在形式。DMs參與細胞增殖并為細胞生長提供選擇優勢，與腫瘤的演進和細胞耐藥性的形成密切相關。大量的研究表明，雙微體與衰老、基因組不穩定、腫瘤及耐藥密切相關。針對雙微體的深入研究對于腫瘤遺傳學的發展及其臨床應用有著重要的意義。自從1962年發現DMs以來，由于普通的分子生物學技術不能簡便、高效地獲取DMs，致使我們并不清楚在絕大多數細胞中DMs的結構及組成。DMs研究的滯后很大程度上是由于缺乏有效的分離手段。在以往的研究中，差速離心(differential gradientcentrifugation)、、流工^細胞分;^術(fluorescence activated cell sorting)、 通過誘導S期細胞核出芽及微核形成選擇性的捕獲DMs等方法都曾用于DMs的分離和純化，但是這些方法在樣品制備及分離過程中不可避免會有染色體斷裂形成的小片段混入 DMs中，嚴重干擾DMs的純度。不同于以上方法，染色體顯微切割技術可較為成功的從中期分裂相中剝離收集較高純度DMs，但是此方法技術難度高、工作強度大，且收獲的DMs量極少，對于部分實驗而言無法滿足進ー步研究的需要。在常規的凝膠電泳中，凝膠以篩濾形式對DNA分子進行分離，其分離的上限僅為 501Λ左右。然而對于501Λ以上的DNA分子，常規的電泳方法就失去了其分子篩的作用，所有的DNA分子的移動速度接近，很難分離形成足以區分的條帶。脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)是ー種分離大分子 DNA的方法。在脈沖場凝膠電泳中電場不斷在兩種方向之間變動，DNA分子帶有負電荷，會朝正極移動，其中相對較小的分子在電場轉換后可以較快的轉變移動方向，而較大的分子在凝膠中轉向較為困難，因此小分子向前移動的速度比大分子快，從而實現了對大分子DNA 的分離。脈沖場凝膠電泳可以用來分離大小IOKb IOMb范圍的DNA分子，足以使細菌、酵母染色體及經稀有限制酶消化的哺乳類動物大片段DNA得以分離，這ー獨具的高分辨率使 PFGE的應用范圍擴展到幾乎所有生物基因組組織結構的研究。目前常用的PFGE的裝置主要有垂直脈沖場電泳系統(TAFE)，旋轉膠系統(RGE)，場翻轉系統(FIGE)，箝位勻強電場系統(CHEF)，程序化自動控制的電泳(PACE)等。CHEF是目前用途最廣的ー種PFGE，可分離近IOMb大小的DNA分子。脈沖場凝膠電泳的方法可用于射線或限制性內切酶等線性化處理后DMs分子大小的鑒定。由于其樣品制備過程中先將細胞包埋于瓊脂糖中，再用細胞裂解及蛋白酶消化以去除細胞中DNA之外的成分，大大減小了操作過程中外界作用力的干擾，降低了染色體
3斷裂所形成小DNA片段對DMs純度的影響，此外該方法操作簡單可以實現對DMs的高效回收并能充分滿足后期實驗對實驗樣品量的需求。但是盡管如此，要想分離得到純度足夠高并可用于序列分析的DMs特異性DNA還有很大的難度。

發明內容
本發明的目的是為了實現對高純度DMs的分離和純化，進而提供一種卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法。本發明ー種卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法技術方案步驟如下人卵巣癌細胞UACC-1598的培養及細胞完整雙微體的脈沖場凝膠電泳分離1、樣品制備人卵巢癌細胞UACC-1598在含10% FBS的RPMI-1640培養基中，于5% CO2,37°C 條件下進行培養；收集對數生長期、匯合率為70% 80%的人卵巣癌細胞UACC-1598，計數后重懸于PBS，使細胞密度為1 2 X IO8細胞/mL，并在37°C水浴中孵育；加入等體積37°C 的1. 4%低熔點瓊脂糖，迅速混勻后倒入潔凈模具中，4°C放置10 15min使其凝固；將膠塊從模具中取出后置于3 5倍體積的細胞裂解液中于37°C水浴中震蕩孵育約90min至膠塊透明；棄細胞裂解液并用洗液(Washing buffer)反復洗膠塊3次后置于3 5倍體積的蛋白酶K溶液，37°C水浴中震蕩孵育6 12小時；Washing buffer洗滌三次后，置于貯存液中4°C保存；2、脈沖場凝膠電泳將制備好的膠塊置于0. 5%瓊脂糖凝膠的點樣孔中，用相同濃度的瓊脂糖封閉加樣孔；在10°c的0. 5X TBE電泳緩沖液中適宜電泳條件下先進行第一向FIGE模式電泳，電泳條件為正向電壓梯度(Forward Voltage Gradient) :3 5V/cm，起始轉換時間(Int. Sw. Time) :50 70seconds，終止轉換時間(Fin. Sw. Time) :220 260seconds ；負向電壓梯度(Rev. Voltage Gradient) :2 4V/cm，負向起始轉換時間(Rev. Int. Sw. Time) :15 30seconds，負向終止轉換時間(Rev. Fin. Sw. Time) :50 70seconds ；總電泳時間(Total RunTime) :36 45hours.隨后調整方向進行第二向CHEF模式電泳，分離大片段DNA分子； 電泳條件為電壓梯度(Gradient) :3 6V/cm，脈沖角度(Included angle) :120，起始轉換時間 Gnt. Sw. Tm) 100 130seconds，終止轉換時間(Fin. Sw. Tm) :270 320seconds， 電泳時間(Run time) :25 30hours.以商品化的H. wingi和S. cerevisiae染色體為分子重標尺；3、瓊脂糖酶法回收DMs DNA對電泳凝膠中的垂直DNA條帶進行切膠回收，切取含有目的DNA片段的低熔點瓊脂糖凝膠，切成細塊并稱重，加入1/10體積的IOX瓊脂糖酶緩沖液用于平衡反應體系；于 70°C IOmin熔化低熔點瓊脂糖凝膠后，冷卻至60°C并靜置5min，加入瓊脂糖酶于60°C消化 1小時，冰上放置15min后12000r/min離心15min，取上清液并加入1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液和1倍體積的異丙醇，混勻后_20°C冷卻6 12小吋，之后，12000r/min離心15min， 棄上清用70%的冷異丙醇清洗沉淀兩次，干燥后加入TE溶解DNA沉淀，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收所得DNA片段大小。
所述的細胞裂解液由0. 01mol/L Tris-HCl pH8. 0,0. 05mol/L NaCl、l%十二烷基肌氨酸鈉、0. lmol/L EDTA和0. 2% SDS制成。所述的Washing buffer 由 0. 01mol/L Tris-HCl 和 0. lmol/L EDTA 制成。所述的蛋白酶K溶液由0. lmol/L EDTA、1 %十二烷基肌氨酸鈉、0. 2% SDS和Img/ HiL蛋白酶K制成。所述的貯存液由0. 001mol/L Tris-HCl 和 0. 01mol/L EDTA 制成。本發明的有益效果本發明的方法通過雙向電泳的方式對脈沖場凝膠電泳的優化可實現對雙微體簡便、高效的分離。經FISH驗證，將分離的DMs DNA標記為探針，與中期核型雜交，探針信號可特異性的覆蓋中期核型的所有DMs上，因而證明我們分離的DMs的純度高，并為后續DMs相關實驗的開展奠定了堅實的基礎。


圖1是雙向脈沖場凝膠電泳分離DMs圖(圖中A:分子標尺S. cerevisiae和 H. wingei示意圖；B 第一、ニ加樣孔中為分子量標尺S. cerevisiae和H. wingei僅進行縱向FIGE電泳，第三個加樣孔中為UACC-1598進行縱向FIGE和橫向CHEF兩向電泳；C UACC-1598的雙向電泳，其中第一向縱向延長時間的FIGE電泳；第二向橫向延長時間的 CHEF電泳；D =UACC-1598的雙向電泳，其中第一向縱向FIGE電泳進ー步延長時間；第二向橫向CHEF電泳時間同C)；圖2是切膠回收DMs DNA瓊脂糖電泳檢測圖；圖3是人卵巢癌細胞UACC-1598中期染色體(X 1000)圖；圖4是雙向脈沖場凝膠電泳分離所得DNA的FISH驗證圖(圖中A =Cy3標記DMs DNA為探針；B =DAPI染核；C 圖A，B的融合)；圖5是DMs染色體起源的FISH分析圖(圖中A，B，C和D，E，F分別為兩個細胞不同顏色熒光信號圖；A和D中紅色信號代表分離所得DMs DNA ；B和E中細胞核應用藍色 DAPI復染；C和F兩圖分別為A，B和D，E的融合)。
具體實施例方式參見圖1 圖5，本實施方式卵巣癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法的技術方案是這樣實現的人卵巣癌細胞UACC-1598的培養及細胞完整雙微體的脈沖場凝膠電泳分離1、樣品制備人卵巢癌細胞UACC-1598在含10% FBS的RPMI-1640培養基中，于5% CO2,37°C 條件下進行培養。收集對數生長期、匯合率為70% 80%的人卵巣癌細胞UACC-1598，計數后重懸于適量的PBS，使細胞密度約為1 2 X IO8細胞/mL，并在37°C水浴中孵育。加入等體積37°C的1. 4%低熔點瓊脂糖，混勻后倒入潔凈模具中，4°C放置10 15min使其凝固。 將膠塊從模具中取出后置于3 5倍體積的細胞裂解液中(O.Olmol/L Tris-HCl pH8. 0， 0. 05mol/LNaCl，l%十二烷基肌氨酸鈉，0. lmol/L EDTA,0. 2% SDS)于 37°C水浴中震蕩孵育約90min至膠塊透明。棄細胞裂解液并用Washing buffer(0. 01mol/L Tris_HCl，0. Imo 1/ LEDTA)反復洗膠塊3次后置于3 5倍體積的蛋白酶K溶液(0. lmol/L EDTA，十二烷基肌氨酸鈉，0. 2% SDS，lmg/mL蛋白酶K)，37°C水浴中震蕩孵育過夜。Washing buffer洗滌三次后，置于貯存液(0. 001mol/L Tris-HCl,0. 01mol/L EDTA)中 4°C保存。2、脈沖場凝膠電泳將制備好的膠塊置于0. 5%瓊脂糖凝膠的點樣孔中，用相同濃度的瓊脂糖封閉加樣孔。在10°C的0.5XTBE電泳緩沖液中適宜電泳條件下先進行第一向FIGE模式電泳，隨后調整方向進行第二向CHEF模式電泳，分離大片段DNA分子。以H. wingi和S. cerevisiae 為分子量標尺。如果要進行后續切膠回收DNA，則需要在預期電泳條帶所到位置換上濃度稍高(0. 8% )的低熔點瓊脂糖凝膠。完整未經線性化的人卵巣癌細胞中全基因組DNA經雙向電泳分離后，呈現為兩個不同形狀的DNA集聚區域(如圖1B、C、D)，其中之ー為垂直的條帶，而另ー DNA集聚條帶呈拋物線狀。并且兩條電泳條帶的分布特征提示兩區域所含DNA具有不同的超微結構。由于線性DNA分子在雙向電泳中多呈斜線狀，因此我們認為垂直條帶為雙微體DNA成分稱之為 DMs DNA，通過與脈沖場電泳分子量標尺比較可見其大小分布從1Mb到大于3Mb的范圍，具有明顯的異質性(圖1A、B)。3、瓊脂糖酶法回收DMs DNA對電泳凝膠中的垂直DNA條帶進行切膠回收，切取含有目的DNA片段的低熔點瓊脂糖凝膠，切成細塊并稱重，按說明書所示加入1/10體積(按凝膠重量Img = 1 μ L計算) 的10Χ瓊脂糖酶緩沖液用于平衡反應體系。于70°C IOmin熔化低熔點瓊脂糖凝膠后，冷卻至60°C并靜置5min。加入適量的瓊脂糖酶于60°C消化1小時，冰上放置15min后12000r/ min離心15min。取上清液并加入1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液和1倍體積的異丙醇，充分混勻后_20°C冷卻過夜。12000r/min離心15min，棄上清用70%的冷異丙醇清洗沉淀兩次， 干燥后加入適量的TE溶解DNA沉淀。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收所得DNA片段大小。可見回收DNA片段大小約為15Kb (圖2)。驗證分離所得DMs DNA純度及染色體起源1、FISH 驗證為進ー步驗證分離所得的DNA條帶為雙微體特異條帯，我們將分離所得的DNA標記為FISH探針與UACC-1598細胞中期染色體雜交，結果顯示紅色的探針信號可特異地覆蓋中期標本中幾乎所有的DMs。同時，應用DMs邊界序列特異引物來驗證DMs的特異性，結果顯示邊界內引物可擴增出產物，邊界外引物無擴增產物或有少量擴增產物，提示我們分離所得DMs具有較好的純度。FISH探針制備以分離所得DMs DNA為模板通過DOP-PCR標記FISH探針，反應體系如下表所示， 反應條件為94°C 5min ；94°C lmin，56°C lmin，72°C 1. 5min, 30cycles ；72°C 5min。1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物片段大小后-20°C保存。
權利要求
1.一種卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法，其特征在干，步驟如下(1)樣品制備人卵巢癌細胞UACC-1598在含10% FBS的RPMI-1640培養基中，于5% C02、37°C條件下進行培養；收集對數生長期、匯合率為70% 80%的人卵巣癌細胞UACC-1598，計數后重懸于PBS，使細胞密度為1 2X108細胞/mL，并在37°C水浴中孵育；加入等體積37°C的1. 4% 低熔點瓊脂糖，迅速混勻后倒入潔凈模具中，4°C放置10 15min使其凝固；將膠塊從模具中取出后置于3 5倍體積的細胞裂解液中于37°C水浴中震蕩孵育90min至膠塊透明；棄細胞裂解液并用洗液反復洗膠塊3次后置于3 5倍體積的蛋白酶K溶液，37°C水浴中震蕩孵育6 12小時；洗滌三次后，置于貯存液中4°C保存；(2)脈沖場凝膠電泳將制備好的膠塊置于0. 5%瓊脂糖凝膠的點樣孔中，用相同濃度的瓊脂糖封閉加樣孔； 在10°C的0. 5XTBE電泳緩沖液中適宜電泳條件下先進行第一向FIGE模式電泳，電泳條件為正向電壓梯度3 5V/cm，起始轉換時間50 70seconds，終止轉換時間220 260seconds ；負向電壓梯度2 4V/cm，負向起始轉換時間15 30seconds，負向終止轉換時間50 70seconds ；總電泳時間36 45hours，隨后調整方向進行第二向CHEF模式電泳，分離大片段DNA分子；電泳條件為電壓梯度3 6V/cm ；脈沖角度120，起始轉換時間100 130seconds ；終止轉換時間:270 320seconds ；電泳時間25 30hours,以商品化的H. wingi和S. cerevisiae染色體為分子量標尺；(3)瓊脂糖酶法回收DMsDNA對電泳凝膠中的垂直DNA條帶進行切膠回收，切取含有目的DNA片段的低熔點瓊脂糖凝膠，切成細塊并稱重，加入1/10體積的IOX瓊脂糖酶緩沖液用于平衡反應體系；于 70°C IOmin熔化低熔點瓊脂糖凝膠后，冷卻至60°C并靜置5min，加入瓊脂糖酶于60°C消化 1小時，冰上放置15min后12000r/min離心15min，取上清液并加入1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液和1倍體積的異丙醇，混勻后_20°C冷卻6 12小吋，之后，12000r/min離心15min， 棄上清用70%的冷異丙醇清洗沉淀兩次，干燥后加入TE溶解DNA沉淀，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收所得DNA片段大小。
2.根據權利要求1所述的卵巣癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法，其特征在于，所述的細胞裂解液由0. 01mol/L Tris-HCl pH8. 0、0. 05mol/L NaCl、l%十二烷基肌氨酸鈉、0. lmol/L EDTA和0· 2% SDS制成。
3.根據權利要求2所述的卵巣癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法，其特征在于，所述的 Washing buffer 由 0. 01mol/L Tris-HCl 和 0. lmol/L EDTA 制成。
4.根據權利要求3所述的卵巣癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法，其特征在于，所述的蛋白酶K溶液由0. lmol/L EDTA、1%十二烷基肌氨酸鈉、0. 2% SDS和Img/ mL蛋白酶K制成。
5.根據權利要求4所述的卵巣癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法，其特征在于，所述的貯存液由0. 001mol/L Tris-HCl和0. 01mol/L EDTA制成。
6.根據權利要求5所述的卵巣癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法，其特征在干，所述的電泳條件為0. 5%瓊脂糖凝膠、10°C的0. 5XTBE電泳緩沖液。
全文摘要
本發明提供了一種卵巢癌細胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法。本發明將制備好的含卵巢癌細胞全基因組DNA的膠塊置于0.5％瓊脂糖凝膠的點樣孔中，用相同濃度的瓊脂糖封閉加樣孔；在10℃的0.5×TBE電泳緩沖液中適宜電泳條件下先進行第一向FIGE模式電泳，隨后調整方向進行第二向CHEF模式電泳，分離大片段DNA分子。之后將目的片段回收，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測回收所得DNA片段大小。本發明的方法通過雙向電泳的方式對脈沖場凝膠電泳的優化可實現對雙微體簡便、高效的分離，且DMs的純度高并為后續DMs相關實驗的開展奠定了堅實的基礎。
文檔編號C12N15/10GK102586227SQ20111034083
公開日2012年7月18日 申請日期2011年11月2日 優先權日2011年11月2日
發明者傅松濱, 關榮偉, 岳志超, 白靜, 計薇, 金焰, 陳 峰 申請人:哈爾濱醫科大學