專利名稱：一種綠色糖單孢菌α-淀粉酶的基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種α-淀粉酶的基因，特別是一種綠色糖單孢菌α-淀粉酶的基因及其應用。
背景技術：
淀粉酶是可作用于可溶性淀粉、支鏈淀粉、糖元和α-1，4-葡聚糖等多糖，水解 α-1，4-糖苷鍵的一類酶。一般來說根據淀粉酶的作用方式可分簡單為α-淀粉酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和異淀粉酶，其中α-淀粉酶廣泛應用于食品、輕化工業、釀造、制藥、 谷物加工、石油開采等領域。根據來源的不同α-淀粉酶又可分為真菌α-淀粉酶和細菌 α_淀粉酶，真菌α-淀粉酶是由曲霉屬微生物發酵產生的一種α-淀粉酶。與細菌α-淀粉酶不同的是，真菌α-淀粉酶的最適作用溫度為55°C左右，超過60°C開始失活，其水解淀粉的產物主要是高含量的麥芽糖和一些低聚糖及少量的葡萄糖。而細菌α-淀粉酶最適作用溫度高(中溫α-淀粉酶70 80°C，耐高溫α-淀粉酶為95 105°C )，水解淀粉的主要產物是糊精。因此，細菌α-淀粉酶只能用于發酵工業，而真菌α-淀粉酶則廣泛地應用于淀粉糖漿、低聚糖、啤酒、烘焙食品、面制品等的生產，具有十分廣闊的市場前景。真菌 α-淀粉酶從20世紀50年代開始相繼在英國和美國作為食品添加劑應用于面包生產行業， 在現代的淀粉糖漿、焙烤制品、啤酒釀制、生料酒精等行業已得到廣泛的應用。隨著現代制糖工業與發酵工業的發展及其對真菌α-淀粉酶的使用需求，使得真菌α-淀粉酶在現代工業酶制劑中占有顯著地位，在淀粉糖行業真菌α-淀粉已逐漸替代β-淀粉酶而成為以淀粉為原料生產麥芽糖漿的關鍵酶。隨著真菌α-淀粉酶需求量的日益增加及其相對較昂貴的價格，使得近年來越來越多的國內研究者開始關注真菌α-淀粉酶研究與開發工作。真菌α-淀粉可以水解淀粉內部的α-1，4-糖苷鍵，終產物中主要物質為麥芽糖和低聚寡糖及少量葡萄糖的糖漿。真菌α-淀粉酶的一個重要的用途就是用于生產高麥芽糖漿，目前，歐美各國大多采用真菌α-淀粉酶作為糖化劑生產高麥芽糖漿，得到的麥芽糖漿其組成中麥芽糖占40% 60%，麥芽三糖約10% 20%，其它為葡萄糖、低聚糖和糊精等。在工業生產中真菌α-淀粉可以與β-淀粉酶和普魯蘭酶等脫枝酶配合使用，用于生產超高麥芽糖漿，其麥芽糖含量超過70%，甚至更高。關于用于生產麥芽糖的α -淀粉酶的相關專利和研究報道，美國兩項專利U. S Patent4604355 和 U. S Patent 6274355 是關于麥芽糖淀粉酶(maltogenic amylase enzyme)的制備方法和使用的專利，這種酶已經由諾維信公司商品化，這種酶轉化淀粉的直接產物不是麥芽糖而是麥芽三糖以上的高麥芽糖寡糖，比真菌α -淀粉酶容易控制而且生成的葡萄糖少，所以可以進一步結合用其它脫支酶的共同作用就可以將淀粉轉化成高麥芽糖糖漿。Petricek M也報道了從Thermomonospora curvata克隆到的一個新的芽糖α-淀粉酶基因，可以水解淀粉生成50%以上的麥芽糖和少量的葡萄糖(Petricek M， Tichy P，KuncovaM. Characterization of thealpha-amylase-encoding gene from Thermomonospora curvata. Gene. 1992，112(1) :77_83) ；YangCH 也才艮道了從 Thermobifida
3fusca克隆到一個新的芽糖α-淀粉酶基因，可以水解淀粉生成50%以上的麥芽糖和少量的葡萄糖，其同源性和前面Petricek M報道的有98 %的同源性(Yang CH, Liu WH. Cloning and characterization of a maltotriose-producing alpha-amylase gene from Thermobifida fusca. J Ind Microbiol Biotechnol. Epub,2007,34(4) 325-330)； 2002年Ammar YB報道從Str印tomyces sp菌屬分離純化到一種新型的麥芽糖α -淀粉酶(Maltose-forming α -Amylase)，這種酶在轉化淀粉時在4小時內就可以將淀粉轉化成 58%的麥芽糖，27. 5%的麥芽三糖，14. 5%的麥芽四糖和五糖，而且不會產生葡萄糖(Ammar Y B, Matsubara T, Ito K, Iizuka M, Limpaseni T, Pongsawasdi P, Minamiura N. New action pattern of a maltose-forming alpha-amylase from Streptomyces sp. and its possible application in bakery. J Biochem Mol Biol. 2002,35(6) :568_575)，它的水解淀粉的特性似乎是一種很有應用前景的麥芽糖α “淀粉酶，可惜其沒有相關基因克隆的報道。國內關于麥芽糖α-淀粉酶基因的報道只有訾楠等報道從地衣芽孢桿菌克隆到生麥芽糖α-淀粉酶的基因，其水解淀粉的產物主要是麥芽糖和葡萄糖(訾楠，沈微，石貴陽，王正祥.地衣芽孢桿菌生麥芽糖α-淀粉酶的基因克隆與鑒定.應用與環境生物學報.2009， 15(1) :130 133)。本人也從嗜熱鏈霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)菌屬中克隆到一個麥芽糖α-淀粉酶基因，可以水解淀粉生成麥芽糖的含量達到50%的糖漿(中國專利申請號201010045645. 9)。

發明內容
本發明的目的是提供一種綠色糖單孢菌α -淀粉酶的基因及其應用，可以水解淀粉生成麥芽糖漿。本發明人研究分析GenBank上綠色糖單孢菌基因組DNA序列中的一個假定為糖苷酶的0RF(GI =256583961)的DNA序列，并進行了信號肽預測，并將該ORF序列導入大腸桿菌進行表達和功能鑒定。實驗表明該ORF編碼一種α-淀粉酶，它與可溶性淀粉、六糖、五糖、 四糖、三糖反應，經HPLC檢測產物均為麥芽三糖、麥芽糖和葡萄糖的混合物，不能與二糖、 α-環糊精和β-環糊精反應，說明該ORF編碼的是一種水解性的α-淀粉酶，水解淀粉得到主要產物是麥芽糖和麥芽三糖以及少量葡萄糖的糖漿。本發明所述的α -淀粉酶基因克隆自綠色糖單孢菌(Saccharomonospora viridis)這些菌種可以從國內外的微生物中心購買，也可以通過野外分離培養以及其他途
徑來獲得。從綠色糖單孢菌(Saccharomonospora viridis)分離得到的α -淀粉酶具有以下特征1.分子量約為50kD2.酶的適合反應溫度為55 65°C，優選60°C3.酶的反應的pH在5. 5 7. 5，優選pH為6. 5 7. O ；4.酶活力的熱穩定性受外加Ca2+的影響很小，不需要外加Ca2+來激活酶的活力。5.酶對淀粉的水解的主要產物是麥芽糖、麥芽三糖和葡萄糖。本發明所克隆到的α -淀粉酶基因在Genbank中注釋為糖苷酶(glycosidase)基因，但目前還沒有相關的實驗驗證和具體功能的報道，而其編碼的α -淀粉酶的DNA序列與已發表的淀粉酶家族蛋白的DNA序列同源性為都很低，同源性僅為14%，但其氨基酸序列和糖苷酶家族有很大的同源性，同源性達到90%以上。糖苷酶是作用各種糖苷或寡糖使糖苷鍵水解的酶之總稱，種類繁多，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、異淀粉酶和糖苷轉移酶的糖苷鍵水解相關的酶，所以對某一糖苷酶必須要進行相關的功能鑒定才能確定是具體屬于那種酶。α -淀粉酶是屬于種類繁多的水解酶，在生物體中的生理生化活動扮演著十分重要的角色，因而分布十分廣泛，遍及微生物至高等植物。不同來源的α-淀粉酶即使存在一定的同源性，但其分子量大小不同，最適反應溫度，最適反應PH以及水解淀粉所得到產物組成等酶學特性上都會有很大差異，因而在用途上也有所不同。本發明通過基因克隆，外源基因表達，表達產物的酶學研究等多種復雜的實驗步驟，證實這一基因編碼是的α-淀粉酶，該淀粉酶是與前人發現的淀粉酶具有完全不同特征，這些不同的特性特征包括了氨基酸序列和DNA序列的不同，酶的分子量大小不同，酶的最適反應溫度和最適反應PH不同，以及酶對淀粉水解產物組成差異等特性的差異。本發明與現有技術相比，具有實質性特點和顯著的優勢1.和大多數的細菌α-淀粉酶屬于液化型的淀粉酶相比，本發明的α-淀粉酶屬于糖化型的淀粉酶，水解淀粉的產物簡單，主要產物麥芽糖和麥芽三糖及少量的葡萄糖，酶活力的熱穩定性受Ca2+的影響很小，在水解淀粉反應中不需要添加Ca2+來激活酶的活力，在水解淀粉制備麥芽糖漿上具有一定優勢。2.和真菌α -淀粉酶相比，真菌α _淀粉水解淀粉的產物主要是麥芽糖和一些低聚糖及少量的葡萄糖，真菌α -淀粉酶的最適作用溫度為55°C左右，超過60°C開始失活，最適反應pH為4. 8 5. 4，真菌α -淀粉酶水解淀粉產物只能得到50%左右的麥芽糖，而本發明的α -淀粉酶具有更高適于反應溫度55 65°C，因而更適于工業化水解淀粉對酶耐較高反應溫度的要求，最適反應pH在5. 5 7. 5，更接近中性反應條件，在生產中不需要添加酸來調節PH值，本發明的α -淀粉酶水解產物也更簡單，主要產物麥芽糖和麥芽三糖及少量的葡萄糖，沒有低聚糖，水解淀粉產物中麥芽糖能達到60%左右，在水解淀粉制備麥芽糖漿上具有一定優勢。3.目前商品花真菌α-淀粉酶大多數采用曲霉屬微生物發酵生產，本發明的 α-淀粉酶不僅具有適合制備麥芽糖漿的性質，而且是來源細菌的基因，因而比來自真菌的基因更容易實現利用基因工程菌來生產重組，有利于降低生產成本。


圖1是溫度對酶水解淀粉活力的影響的曲線圖。圖2是pH對酶水解淀粉活力的影響的曲線圖。圖3是外加Ca2+離子對酶穩定性的影響的曲線圖。圖4酶水解淀粉產物HPLC分析色譜圖。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明的技術方案作進一步說明。實施例1.綠色糖單孢菌的培養及總DNA的提取
綠色糖單孢菌(Saccharomonospora viridis 4. 1335)購買自中國微生物菌種保存中心，接種于以下培養基(克/升)葡萄糖4. O克，酵母提取物4. O克，麥芽提取物10. O 克，pH7. 2，然后在50°C恒溫搖床上振蕩48小時，培養至菌體飽和后離心收集菌體用于總 DNA的提取，總DNA提取采用CTAB法提取。2.綠色糖單孢菌α-淀粉酶基因的表達及重組酶的制備根據α _淀粉酶基因成熟肽的DNA序列設計相應引物擴增其成熟肽序列并連接到表達載體上導入大腸桿菌進行表達，設計引物如下上游引物5-ATACATATGATGGCACCACCCGGCGAAC-3下游引物5-ATCGAATTCTCATACGCGAGCGCCGACG-3用設計好的引物擴增α-淀粉酶成熟肽的DNA序列，命名為sv，擴增產物利用 Ncol和HindIII進行雙酶切，然后與同樣利用Ncol和HindIII進行雙酶切的表達載體 pSEe380進行連接，然后經過篩選驗證得到重組質粒pSE380-sv。把重組載體重組質粒 pSE380-sv轉化到大腸桿菌感受態細胞中，將轉化子在37°C搖床中培養，當0D600達到0. 8 左右時，加入IPTG使其終濃度達到lmmol/L在37°C繼續培養20小時進行誘導表達。誘導表達培養好的發酵液離心收集菌體，利用破胞緩沖液洗滌菌體一次，再利用破胞緩沖液重懸菌體后在冰浴條件下利用超聲波進行破胞，破胞至菌液澄清，用1200rpm/min離心15分鐘離心收集上清，所收集的上清液即為重組的粗酶液，可用于下一步的水解淀粉產物試驗。3.酶水解淀粉最適的反應溫度分析取50 μ L的酶液與450 μ L ρΗ為7. O的1 %可溶性淀粉溶液混合，分別在30°C、 35°C、340°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70V下反應IOmin后測定淀粉酶活力，結果表明酶的最適溫度為60°C，在50°C到65°C之間該酶有80%以上的活性，65°C以后酶活性急劇下降，結果如圖1所示。4.酶水解淀粉最適的反應ρΗ分析分別用ρΗ4· 5、ρΗ5· 0、ρΗ5· 5、ρΗ6· 0、ρΗ6· 5、ρΗ7· 0、ρΗ7· 5、ρΗ8· 0、ρΗ8· 5、ρΗ9· O 的
緩沖液配制ι %的可溶性淀粉溶液，然后分別450 μ L加入50 μ L的酶液，在65°C的條件下反應IOmin后測定淀粉酶活力，結果表明酶的最適反應ρΗ為pH6. 5，在pH5. 5到pH8. O之間該酶有80%以上的活性，pH8以后酶活性急劇下降，結果如圖2所示。5.外加Ca2+離子對酶穩定性的分析用CaC12溶液把酶稀釋成Ca2+終濃度分別為0、0. 5、l、2、3、4、5、6mmol/L的酶液， 于60°C恒溫水浴中保溫30分鐘，然后取50 μ L酶液與ρΗ為6. 5的1 %可溶性淀粉450 μ L 反應10分鐘后測定酶活，結果如圖3所示，結果表明酶的熱穩定性受外加的Ca2+的影響很小。6.酶水解淀粉產物成分的分析取50 μ L的酶液與450 μ L ρΗ為6. 5的1 %可溶性淀粉溶液混合，在60°C的反應條件反應12小時，然后通過HPLC分析酶產物的組成。檢測條件為色譜柱Alltima Amino 100A 5u柱(4.6_X250mm)；檢測器Alltech 2000ES型蒸發光散射檢測器；流動相65% 乙腈35% H20 ；流速lmL/min，柱溫28°C。酶與可溶性淀粉反應產物經HPLC檢測，結果如圖4所示，結果表明酶水解的產物主要為麥芽糖和麥芽三糖還有少量的葡萄糖，產物組成為6. 17%的葡萄糖、60. 97%的麥芽糖和32. 86%的麥芽三糖。
7.以淀粉制備麥芽糖糖漿在100升的不銹鋼容器加入市售木薯淀粉25公斤，加入0. lmol/L,pH為7. 0磷酸氫二鈉和磷酸二氫90升，混勻后在90°C保溫10分鐘使淀粉。糊化完成后使淀粉溶液溫度降至60°C，加入制備好的酶液10升，在60°C條件下保溫12小時進行水解，然后用HPLC對水解產物進行各種糖含量的分析，結果如表1 :表1 反應12小時后水解產物中各組分的含量(％ )

商品的木薯淀粉中組成為淀粉85%，水分14%，蛋白質和其它成分1%。按此計算商品的木薯淀粉25公斤含可降解的淀粉為21. 25公斤，水解后得到的糖漿中的麥芽糖重量約為12. 73kg，糖漿中的麥芽糖含量為59. 91%。
權利要求
1.一種綠色糖單孢菌α-淀粉酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ IDN0. 1 所示。
2.根據權利要求1的基因所編碼的α-淀粉酶蛋白質，其特征在于，其氨基酸序列如 SEQIDN0. 2 所示。
3.—種表達載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的基因。
4.一種宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求1所述基因的原核細胞或真核細胞。
5.權利要求2所述的基因所編碼的α-淀粉酶蛋白質在水解淀粉中的應用，其特征在于水解淀粉得到的產物是主要由麥芽糖和麥芽三糖以及少量葡萄糖組成的糖漿，其中麥芽糖含量可以達到60%。
全文摘要
一種綠色糖單孢菌α-淀粉酶的基因及其應用，該基因克隆自綠色糖單孢菌(Saccharomonospora viridis)，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，該基因編碼的α-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。該基因可以用于構建表達載體并導入相應的宿主細胞進行表達獲得重組的α-淀粉酶，該酶在水解淀粉中的應用能單獨水解淀粉得到麥芽糖含量在60％的糖漿，這種麥芽糖漿可以直接應用在食品工業，也可以進一步加工成高純度的麥芽糖。
文檔編號C12P19/14GK102382849SQ201110340320
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月1日 優先權日2011年11月1日
發明者杜麗琴, 汪小波, 韋宇拓, 黃日波 申請人:廣西大學