專利名稱：一種縮短dna模板的dna測序方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術中基因測序技術領域，具體涉及一種縮短DNA模板的DNA測序方法及其應用，尤其適合高通量DNA測序。
背景技術：
人類基因組計劃和各種模式生物基因組計劃的開展和完成，使人類步入了后基因 時代，對當代的生物學研究和醫學研究產生了巨大的影響，分子生物學相關學科得到了迅猛的發展。從基因水平上認識生命的差異，疾病發生、發展的規律，以及藥物與生命體的相互作用將成為可能。就基因序列分析而言，后基因時代的重點已由全基因組序列測定轉移到了對基因組中個體遺傳差異及物種間遺傳差異的比較。在基礎研究方面，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎，研究疾病基因的遺傳規律，克隆致病基因；在應用方面，直接尋找疾病的易感基因突變位點，通過對某一特定疾病的基因組樣本中突變基因型進行大規模鑒定和檢測，可以獲得有關與該疾病相關基因型的信息。目前，最為廣泛應用的測序技術是Sanger等(1977)發明的雙脫氧鏈末端終止法，傳統的Sanger DNA測序法仍處于無可替代的地位，但這一方法存在通量低和價格高的問題。第一個人類基因組序列測定的費用大約為10億美元，目前這一費用已經降低到大約2千萬美元，因此，功能基因組的研究進展仍然受限于DNA測序技術。為此，美國Venter基金會在2003年提出了 1000美金人類全基因組測序的研究目標。2004年初，美國國立衛生院投入7千多萬美元支持DNA 測序新技術的研究計劃，其目標是發展10萬美金的測序技術，并最終減低為1千美金。目前，全基因組DNA測序技術已經成為國際上一個競爭十分激烈的研究領域。美國的454Life kiences公司基于乳液PCR產物的高通量并行焦測序技術；Illumina(Solexa)公司的橋式擴增-DNA芯片延伸測序技術；以及AppliedBiosestems (SOLiD)公司基于乳液PCR產物的雜交-酶連接-酶切割高通量測序技術都有成熟的商品化儀器上市。此外，一些基于單分子測序的高通量測序儀也開始面世。然而，所有這些高通量測序儀儀器不管是采用標記染料核苷酸的合成法，還是采用標記探針的連接法，其特點均是測序引物的不斷延長。然而不管合成、還是連接測序方法，效率總不可能達到100 %，每步測序反應均要消耗掉一定的“正確”測序引物，而產生一些“錯誤”的測序引物，因此，隨著合成(或者連接)次數的不斷增加，這種累積的錯誤便越來越多，而測序的準確性是由正確合成(或者連接)的標記物信號給出的，于是，其測序準確性便越來越差。

發明內容
解決的技術問題本發明的目的是提供一種縮短DNA模板的DNA測序方法及其應用，該方法采用循環“測序引物”的高通量測序技術，即將已經測定的DNA模板中的一段序列切割掉(縮短DNA模板)，并重新連接測序引物片段后，繼續對未測定DNA模板進行序列測定，為全基因組DNAD序列分析提供一種新方法，建立準確，增加測序長度的，便宜基因組
4序列測定技術。技術方案一種縮短DNA模板的DNA測序方法，(1)引入一段包含IIS限制性內切酶識別位點的目標寡核苷酸序列作為序列測定的起點，采用合成或者連接測序方法將固定 DNA模板中的一小段序列測定；(2)停止該測序引物的測序，并加入四種dNIPs(dATP、dGTP、 dCTP、dTTP)單體延伸測序引物鏈，使DNA模板成為雙鏈；C3)縮短DNA模板用限制性內切酶處理預先設定包含酶識別序列的連接子，將已經測定的DNA模板中的一小段序列斷裂； (4)將測序引物、且包含酶識別序列的雙鏈寡核苷酸片段，連接到上述切割后的縮短DNA模板上；(5)變性，除去未固定的DNA鏈，重新獲得DNA模板；(6)雜交測序引物，繼續對固定 DNA模板中的一小段序列進行測定；(7)重復步驟O)到(6)，直到未測定DNA模板序列測定完成；所述DNA模板中的一小段序列測定是根據酶切位點距離酶識別位點的核苷酸個數確定的，已經被測序的序列片段是酶識別位點切割DNA模板的位置；DNA模板的每次制備過程中均需引入酶識別位點，酶切位點距離酶識別位點的核苷酸個數是確定的。所述酶識別序列是指限制性內切酶識別位點，其斷裂位點為距離識別位點的2-30 個堿基。所述酶識別序列是指限制性內切酶識別位點，，最佳斷裂位點為距離識別位點 8-25個堿基。縮短DNA模板的DNA測序方法在測定人基因組中的應用，步驟為(1)將人基因組用I酶在37°C處理2小時后，超聲破碎成大小為50-1000堿基的片段，并在連接酶的作用下將這些片段化核酸序列用一對通用連接子進行連接，其中的一個通用連接子的寡核酸序列與擴增引物的序列完全互補，而另一個連接子的寡核酸序列包含了 Mly I酶能識別序列，且該特定區域位于模板測序最開始位置；(2)將這些連接臂連接的片段化核酸序列與固定連接子互補序列到微珠進行乳液并行PCR反應，擴增片段化的人全基因組，并將這些微珠固定到平板基片上，并通過變性得到人全基因組單鏈DNA測序模板；(3)將3’末端含有Mly I酶能識別序列的測序引物與固定的DNA模板雜交；(4)在DNA模板指導下，采用商業化的SOLiD連接測序試劑及其測序方法，測定所有DNA模板的前9個堿基；(5)當第9個堿基測定完成后，清洗反應池，加入四種dNIPs(dATP、dGTP、dCTP、 dTTP)單體，在DNA聚合酶的作用下，37。C反應0. 5小時，延伸測序引物鏈，并與DNA模板成為雙鏈，并清洗反應池；(6)將Mly I酶及其緩沖液加于上述反應池中，在37°C反應2小時，切割雙鏈DNA 其斷裂位點為識別序列3'末端下游9或者5'末端下游11個堿基處，并用T4激酶將5末
端磷酸化；(7)將新測序引物片段，且包含下列酶Mly I識別序列，所述上游引物應補齊2堿
基缺口 對應測序弓I物序列5 ‘ ... GGCGGA (N) 2 ；對應測序引物序列互補序列，ρ表示磷酸基團3' ...CCGCCT' ρ ；以雙鏈寡核苷酸片段，與上述切割、縮短的雙鏈DNA模板在Τ4連接酶作用下反應 0. 5小時；
(8)用0. IM NaOH處理上述連接后的雙鏈DNA模板10分鐘，變性獲得新單鏈DNA 模板。(9)重復步驟⑷，得到新模板上1-9個堿基的序列信息；(10)重復步驟⑷到(9)，進行循環測序，每重復一次增加9個堿基位置的序列測定長度；(11)將所有位置上DNA模板的堿基序列片段完成組裝，得到人全基因組DNA序列。縮短DNA模板的DNA測序方法在測定大腸桿菌基因組中的應用，步驟為(1)將大腸桿菌基因組用Mme I酶在37 °C處理2小時后，超聲破碎成大小為 50-1000堿基的片段，并在連接酶的作用下將這些片段化核酸序列用一對通用連接子進行連接，其中的一個通用連接子的寡核酸序列與擴增引物的序列完全互補，而另一個連接子的寡核酸序列包含了 Mme I酶能識別序列，且該特定區域位于模板測序最開始位置；(2)將這些連接臂連接的片段化核酸序列與固定連接子互補序列到微珠進行乳液并行PCR反應，擴增片段化的大腸桿菌基因組，并將這些微珠固定到平板基片上，并通過變性得到大腸桿菌基因組單鏈DNA測序模板。(3)將3’末端含有Mme I酶能識別序列的測序引物與固定的DNA模板雜交；(4)在DNA模板指導下，采用商業化的Solexa延伸測序試劑及其測序方法，測定所有DNA模板的前18個堿基；(5)當第18個堿基測定完成后，清洗反應池，加入四種dNIPs (dATP、dGTP、dCTP、 dTTP)單體，在DNA聚合酶的作用下，37。C反應0. 5小時，延伸測序引物鏈，并與DNA模板成為雙鏈，并清洗反應池；(6)將Mme I酶及其緩沖液加于上述反應池中，在37°C反應2小時，切割雙鏈DNA 其斷裂位點為識別序列3'末端下游18或者5'末端下游20個堿基處，并用T4激酶將5 末端磷酸化；(7)將新測序引物片段，且包含下列酶Mly I識別序列，上游引物需要補齊2堿基
缺口 對應測序引物序列5‘ ... TCCRAC(N)2 ；對應測序引物序列互補序列，ρ表示磷酸基團3' ... AGGYTGp ；以雙鏈寡核苷酸片段，與上述切割、縮短的雙鏈DNA模板在T4連接酶作用下反應 0. 5小時；(8)用0. IM NaOH處理上述連接后的雙鏈DNA模板10分鐘，變性獲得新單鏈DNA 模板；(9)重復步驟⑷，得到新模板上1-18個堿基的序列信息；(10)將所有位置上DNA模板的36個堿基序列片段完成組裝，得到大腸桿菌基因組全基因組DNA序列。有益效果IIS限制性內切酶具有在識別位點之處降解DNA的能力。這些酶的大小約為400-650個氨基酸左右，它們識別連續的非對稱序列，有一個結合識別位點的域和一個專門切割DNA的功能域。比如Mly I酶能識別序列下列特定區域，其斷裂位點為識別序列3'末端下游9或者5'末端下游11個堿基處5' . . . GGCGGA(N)11". . . 3'
3' ... CCGCCT(N)9". ·· 5'而Mme I酶能識別序列下列特定區域，其斷裂位點為識別序列3 ‘末端下游18或者5'末端下游20個堿基處5' . . . TCCRAC(N)20". . . 3'3' . . .AGGYTG(N)18". . . 5'根據限制性內切酶這一特點，本發明在DNA測序模板制備時，引入一段包含IIS限制性內切酶識別位點的寡核苷酸序列作為序列測定的起點，當采用合成(或者連接)測序法測定若干個堿基序列后，在聚合酶和dNIPs (dATP、dGTP、dCTP、dTTP)的作用下，測序引物剩下的單鏈區變為雙鏈，在選定的限制性內切酶作用下(切割已知個數的堿基數目)，限制性內切酶位點的內切酶進行固相切割使待測模板縮短若干個堿基(對應上次序列測定的數目)。然后重新連接測序引物(該引物依然含有限制性內切酶識別位點)，按照同樣的方法，進行下一輪測序反應。經過多輪這樣的測序，便可以達到提高測序閱讀長度的目的。因而本發明與現有技術相比，具有如下優點1.本發明的最大優點是每個測序引物測定的模板序列的長度有限，因而其測序的
準確度高。2.由于通過不斷地縮短DNA模板，在保證高測序準確度的前提下，可以提高DNA序列的閱讀長度。3.本發明的采用成熟的常規分子生物學技術，因而實施不存在技術問題。


圖1是本發明一種縮短DNA模板的DNA測序方法的DNA序列測定示意圖。圖中有DNA模板載體1，未知DNA模板序列2 (其中兩端分別為人工引入的連接子2_1和2_2， 且2-1中含有內切酶識別序列片段)，測序引物3，通過合成(或者連接)測序測定一段序列后測序引物的延長鏈4，測序引物的延伸鏈與與DNA模板成為雙鏈5，內切酶識別序列片段切口 6(其斷裂位點為識別序列3'末端下游M或者5'末端下游N個堿基處)，切割 DNA模板連接含內切酶識別序列片段的雙鏈寡核苷酸序列7，縮短DNA模板8，新測序引物 9(可以和3相同，也可以不相同)。經過處理的未知DNA模板序列⑵通過5’端固定到載體(1)上，當測序引物(3)與未知完成雜交(a)后，可以采用標記核苷酸延伸(Bentley DR, Balasubramanian S， Swerdlow HP, Smith GP, et a 1.Accurate whole human genome sequencingusing reversible terminator chemistry. Nature，2008，456，53-59)、標記探針連接(Shendure J，Porreca GJ，Reppas NB，Lin X，et al. Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterialgenome· Science，2005，309，1728-1732)、及其它測序方法(b)進行序列測定未知DNA模板序列的一小段片段(4)后，加入四種dNTPs單體，在 DNA聚合酶作用下延伸(c)測序引物鏈，使之與DNA模板成為雙鏈(5)，然后用內切酶處理 (d，e)為雙鏈DNA，使DNA模板在切口(6)斷裂。將包含酶識別序列的雙鏈寡核苷酸片段 (7)，連接⑴到上述切割后的模板上；并經變性(g)，重新獲得單鏈DNA模板⑶；重新雜交 (h)測序引物(8)，對定DNA模板(8)中的一小段序列進行測定。圖2是用I酶處理人工合成寡核苷酸互補雙鏈序列的電泳圖。具體實驗如下 合成如下兩條人工寡核苷酸序列
5’ -Cy3-TTGTCTTTC |GGATq ATCTGCTGCAGCTCGGGCGGCGTATAGTGAGTCGTATTAGGATC C 3 ’ -AACAGAAAG CCTAC| TAGACGACGTCGAGCCCGCCGCATATCACTCAGCATAATCCTAGG兩條序列完全互補，且含有I酶識別的特定區域(序列中方框黑體部分)，其中一條標記Cy3染料，以方便電泳觀察。將標記序列0. 5nmol與Inmol的非標記序列雜交30分鐘(放置在200微升PCR 管中加熱至80度，慢慢冷至室溫)，然后分成2份于PCR管中。一份加入50U的I酶于PCR管中，37°C處理2小時；一份不做任何處理。將上述I酶處理和未做任何處理的產物，分別進行電泳分析結果表明，處理后的熒光染料條帶( 要比未做任何處理的條帶(1)片段“短”。這一結果和與I酶識別特定序列，且其斷裂位點為識別序列3 ‘末端下游9或者13個堿基處的理論結果相一致。
具體實施例方式實施例1 縮短DNA模板的連接測序法測定人基因組(1)將人基因組用I酶在37°C處理2小時后，超聲破碎成大小為50-1000堿基的片段，并在連接酶的作用下將這些片段化核酸序列用一對通用連接子進行連接(假定均為20個堿基)，其中的一個通用連接子的寡核酸序列與擴增引物的序列完全互補，而另一個連接子的寡核酸序列包含了 Mly I酶能識別序列，且該特定區域位于模板測序最開始位置。(2)將這些連接臂連接的片段化核酸序列與固定連接子互補序列到微珠進行乳液并行PCR反應，擴增片段化的人全基因組。并將這些微珠固定到平板基片上，并通過變性得到人全基因組單鏈DNA測序模板。(3)將測序引物(3末端含有Mly I酶能識別序列)與固定的DNA模板雜交。(4)參照附圖1，在DNA模板指導下，采用商業化的SOLiD連接測序試劑及其測序方法(Shendure J, Porreca GJ, Reppas NB, Lin X, et al. Accurate multiplex polony sequencing of anevolved bacterial genome. Science, 2005, 309,1728-1732),測定所有 DNA模板的前9個堿基。(5)當第9個堿基測定完成后，清洗反應池，加入dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)單體，在DNA聚合酶的作用下，37。C反應0. 5小時，延伸測序引物鏈，并與DNA模板成為雙鏈， 并清洗反應池。(6)加Mly I酶及其緩沖液于上述反應池中，在37°C反應2小時，切割雙鏈DNA其斷裂位點為識別序列3'末端下游9或者5'末端下游11個堿基處。并用T4激酶將5末
端磷酸化(7)將新測序引物片段，且包含下列酶Mly I識別序列(上游引物需要補齊2堿基缺口)5' ... GGCGGA (N) 2 (對應測序弓|物序列)3' ...CCGCCT' ρ (對應測序引物序列互補序列，ρ表示磷酸基團)以雙鏈寡核苷酸片段，與上述切割、縮短的雙鏈DNA模板在Τ4連接酶作用下反應 0. 5小時。
(8)用0. IM NaOH處理上述連接后的雙鏈DNA模板10分鐘，變性獲得新單鏈DNA 模板。(9)重復步驟G)，得到新模板上1-9個堿基的序列信息(相當于原DNA模板10-18 個堿基位置的序列信息)。(10)重復步驟⑷到(9)，進行循環“縮短DNA模板法序，每重復一次增加9個堿基位置的序列測定長度。(11)將所有位置上DNA模板的堿基序列片段完成組裝，得到人全基因組DNA序列。實施例2 縮短DNA模板的延伸測序法測定大腸桿菌基因組(1)將大腸桿菌基因組用Mme I酶在37 °C處理2小時后，超聲破碎成大小為 50-1000堿基的片段，并在連接酶的作用下將這些片段化核酸序列用一對通用連接子進行連接(假定均為20個堿基)，其中的一個通用連接子的寡核酸序列與擴增引物的序列完全互補，而另一個連接子的寡核酸序列包含了 Mme I酶能識別序列，且該特定區域位于模板測序最開始位置。(2)將這些連接臂連接的片段化核酸序列與固定連接子互補序列到微珠進行乳液并行PCR反應，擴增片段化的大腸桿菌基因組。并將這些微珠固定到平板基片上，并通過變性得到大腸桿菌基因組單鏈DNA測序模板。(3)將測序引物(3末端含有Mme I酶能識別序列)與固定的DNA模板雜交。(4)參照附圖1，在DNA模板指導下，采用商業化的Solexa延伸測序試劑及其測序方法(Bentley DR, Balasubramanian S, Swerdlow HP, Smith GP, et a 1. Accurate whole humangenome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature,2008,456, 53-59)，測定所有DNA模板的前18個堿基。(5)當第18個堿基測定完成后，清洗反應池，加入dNIPs單體，在DNA聚合酶的作用下，37°C反應0. 5小時，延伸測序引物鏈，并與DNA模板成為雙鏈，并清洗反應池。(6)加Mme I酶及其緩沖液于上述反應池中，在37°C反應2小時，切割雙鏈DNA其斷裂位點為識別序列3'末端下游18或者5'末端下游20個堿基處。并用T4激酶將5末
端磷酸化；(7)將新測序引物片段，且包含下列酶Mly I識別序列(上游引物需要補齊2堿基缺口)5' ...TCCRAC(N)2 (對應測序引物序列)3' ... AGGYTGp (對應測序引物序列互補序列，P表示磷酸基團)以雙鏈寡核苷酸片段，與上述切割、縮短的雙鏈DNA模板在T4連接酶作用下反應 0. 5小時。(8)用0. IM NaOH處理上述連接后的雙鏈DNA模板10分鐘，變性獲得新單鏈DNA 模板。(9)重復步驟G)，得到新模板上1-18個堿基的序列信息(相當于原DNA模板 19-36個堿基位置的序列信息)。(10)將所有位置上DNA模板的36個堿基序列片段完成組裝，得到大腸桿菌基因組全基因組DNA序列。
權利要求
1.一種縮短DNA模板的DNA測序方法，其特征在于(1)引入一段包含IIS限制性內切酶識別位點的目標寡核苷酸序列作為序列測定的起點，采用合成或者連接測序方法將固定 DNA模板中的一小段序列測定；(2)停止該測序引物的測序，并加入四種dNIPs單體延伸測序引物鏈，使DNA模板成為雙鏈；(3)縮短DNA模板用限制性內切酶處理預先設定包含酶識別序列的連接子，將已經測定的DNA模板中的一小段序列斷裂；(4)將測序引物、且包含酶識別序列的雙鏈寡核苷酸片段，連接到上述切割后的縮短DNA模板上；(5)變性，除去未固定的DNA鏈，重新獲得DNA模板；(6)雜交測序引物，繼續對固定DNA模板中的一小段序列進行測定；(7)重復步驟(2)到(6)，直到未測定DNA模板序列測定完成；所述DNA模板中的一小段序列測定是根據酶切位點距離酶識別位點的核苷酸個數確定的，已經被測序的序列片段是酶識別位點切割DNA模板的位置；DNA模板的每次制備過程中均需引入酶識別位點，酶切位點距離酶識別位點的核苷酸個數是確定的。
2.根據權利要求1所述的縮短DNA模板的DNA測序方法，其特征在于酶識別序列是指限制性內切酶識別位點，其斷裂位點為距離識別位點的2-30個堿基。
3.根據權利要求1所述的縮短DNA模板的DNA測序方法，其特征在于酶識別序列是指限制性內切酶識別位點，，最佳斷裂位點為距離識別位點8-25個堿基。
4.縮短DNA模板的DNA測序方法在測定人基因組中的應用，其特征在于步驟為(1)將人基因組用I7OkI酶在37°C處理2小時后，超聲破碎成大小為50-1000堿基的片段，并在連接酶的作用下將這些片段化核酸序列用一對通用連接子進行連接，其中的一個通用連接子的寡核酸序列與擴增引物的序列完全互補，而另一個連接子的寡核酸序列包含了 Mly I酶能識別序列，且該特定區域位于模板測序最開始位置；(2)將這些連接臂連接的片段化核酸序列與固定連接子互補序列到微珠進行乳液并行 PCR反應，擴增片段化的人全基因組，并將這些微珠固定到平板基片上，并通過變性得到人全基因組單鏈DNA測序模板；(3)將3’末端含有MlyI酶能識別序列的測序引物與固定的DNA模板雜交；(4)在DNA模板指導下，采用商業化的SOLiD連接測序試劑及其測序方法，測定所有DNA 模板的前9個堿基；(5)當第9個堿基測定完成后，清洗反應池，加入四種dNIPs單體，在DNA聚合酶的作用下，37°C反應0. 5小時，延伸測序引物鏈，并與DNA模板成為雙鏈，并清洗反應池；(6)將MlyI酶及其緩沖液加于上述反應池中，在37°C反應2小時，切割雙鏈DNA其斷裂位點為識別序列3'末端下游9或者5'末端下游11個堿基處，并用T4激酶將5末端磷酸化；(7)將新測序引物片段，且包含下列酶MlyI識別序列，所述上游引物應補齊2堿基缺Π 對應測序引物序列5’. . . GGCGGA(N)2 ；對應測序引物序列互補序列，ρ表示磷酸基團3， ... CCGCCT'ρ ；以雙鏈寡核苷酸片段，與上述切割、縮短的雙鏈DNA模板在Τ4連接酶作用下反應0. 5 小時；(8)用0.IM NaOH處理上述連接后的雙鏈DNA模板10分鐘，變性獲得新單鏈DNA模板；(9)重復步驟(4)，得到新模板上1-9個堿基的序列信息；(10)重復步驟(4)到(9)，進行循環測序，每重復一次增加9個堿基位置的序列測定長度；(11)將所有位置上DNA模板的堿基序列片段完成組裝，得到人全基因組DNA序列。
5.縮短DNA模板的DNA測序方法在測定大腸桿菌基因組中的應用，其特征在于步驟為(1)將大腸桿菌基因組用MmeI酶在37°C處理2小時后，超聲破碎成大小為50-1000 堿基的片段，并在連接酶的作用下將這些片段化核酸序列用一對通用連接子進行連接，其中的一個通用連接子的寡核酸序列與擴增引物的序列完全互補，而另一個連接子的寡核酸序列包含了 Mme I酶能識別序列，且該特定區域位于模板測序最開始位置；(2)將這些連接臂連接的片段化核酸序列與固定連接子互補序列到微珠進行乳液并行 PCR反應，擴增片段化的大腸桿菌基因組，并將這些微珠固定到平板基片上，并通過變性得到大腸桿菌基因組單鏈DNA測序模板；(3)將3’末端含有MmeI酶能識別序列的測序引物與固定的DNA模板雜交；(4)在DNA模板指導下，采用商業化的Solexa延伸測序試劑及其測序方法，測定所有 DNA模板的前18個堿基；(5)當第18個堿基測定完成后，清洗反應池，加入四種dNIPs單體，在DNA聚合酶的作用下，37°C反應0. 5小時，延伸測序引物鏈，并與DNA模板成為雙鏈，并清洗反應池；(6)將MmeI酶及其緩沖液加于上述反應池中，在37°C反應2小時，切割雙鏈DNA其斷裂位點為識別序列3'末端下游18或者5'末端下游20個堿基處，并用T4激酶將5末端磷酸化；(7)將新測序引物片段，且包含下列酶MlyI識別序列，上游引物需要補齊2堿基缺口 對應測序引物序列5’ ... TCCRAC (N)2 ；對應測序引物序列互補序列，P表示磷酸基團3’ ... AGGYTGp ； 以雙鏈寡核苷酸片段，與上述切割、縮短的雙鏈DNA模板在T4連接酶作用下反應0. 5 小時；(8)用0.IM NaOH處理上述連接后的雙鏈DNA模板10分鐘，變性獲得新單鏈DNA模板；(9)重復步驟(4)，得到新模板上1-18個堿基的序列信息；(10)將所有位置上DNA模板的36個堿基序列片段完成組裝，得到大腸桿菌基因組全基因組DNA序列。
全文摘要
一種縮短DNA模板的DNA測序方法及其應用，(1)采用合成或者連接測序方法將固定DNA模板中的一小段序列測定；(2)停止該測序引物的測序，并加入四種dNTPs單體延伸測序引物鏈，使DNA模板成為雙鏈；(3)縮短DNA模板用限制性內切酶處理預先設定包含酶識別序列的連接子，將已經測定的DNA模板中的一小段序列斷裂；(4)將測序引物、且包含酶識別序列的雙鏈寡核苷酸片段，連接到上述切割后的縮短DNA模板上；(5)變性，除去未固定的DNA鏈，重新獲得DNA模板；(6)雜交測序引物，繼續對固定DNA模板中的一小段序列進行測定；(7)重復步驟(2)到(6)，直到未測定DNA模板序列測定完成。
文檔編號C12Q1/68GK102344967SQ201110341269
公開日2012年2月8日 申請日期2011年11月2日 優先權日2011年11月2日
發明者浦丹, 王文捷, 肖鵬峰, 謝宏梅, 陸祖宏 申請人:東南大學