專利名稱：一種檢測熒光原位雜交質量控制的方法
技術領域：
本發明涉及熒光原位雜交技術，具體的說是一種熒光原位雜交過程的質量控制方法。
背景技術：
熒光原位雜交(fluorescencein situ hybridization，FISH)技術是利用核酸序列互補的原理，對形態固定的染色體、細胞、組織切片上的目的核酸序列利用熒光分子進行標記和檢測的一項分子細胞生物學技術。FISH實驗流程復雜，存在諸多環節，任何一個環節處理不好均可能導致最終結果的失敗。FISH的主要流程包括染色體及探針的制備、雜交、免疫檢測等幾個關鍵的環節，而每個環節又涉及到數個步驟，各步驟均有出現問題的可能。然而盡管存在如此多可能出現問題的環節，當前FISH技術尚缺乏相應的監控措施，整個實驗過程猶如進行黑箱操作，只有最終結果出來之后才能知道實驗是否成功。對于缺乏經驗的研究者而言，一旦實驗出現陰性結果，很難快速的鎖定問題所在，這對于實驗平臺的建立和維持極為不利。FISH實驗最常見的陰性結果是完全觀察不到信號。諸多原因均可以導致這種情況的出現，而探針標記的成功與否及抗體的免疫親和反應是否發生是雜交信號產生的基礎。因此，探針標記是否成功以及免疫檢測條件是否合適是兩個首先應當考慮的原因。對于PCR標記的探針，其成功與否可以采用探針在瓊脂糖凝膠電泳時明顯滯后的方法簡單的檢測。然而對于其他一些方法標記的探針，其分子量大小不定或缺乏分子量對照，如缺口平移法、隨機引物法以及體外轉錄法制備的探針等，則無法采用這種策略，因此亟需一種可以鑒定是否標記成功的方法。此外，抗體作為一種蛋白質，有許多環節可能出現問題比如抗體需要在合適的濃度下和合適的緩沖液中發揮作用，而不同的抗體其最適濃度和最適緩沖液成分并不盡相同；經常凍融抗體可能會引起抗體的失活，甚至有的批次的抗體本身就質量不合格，也需要有相應的質量控制方法。近年來，通過復雜的條件優化過程，我們成功地在中國明對蝦和櫛孔扇貝中建立了 FISH技術平臺，同時也深深的體會到FISH技術的復雜和繁瑣。為了解決FISH諸多環節的質量控制問題，我們建立了一種質量控制方法，可以對FISH過程中的大多數中間環節，包括探針標記、雜交條件、抗體質量及免疫檢測條件等進行質量監控。應用這種監控方法，初次進行FISH操作的研究者可以快速的鎖定出問題的中間環節，并進行相應的糾正，從而快速高效的應用FISH技術。這種監控體系的建立，對FISH技術在不同物種，尤其是基礎研究缺乏的海洋生物中迅速普及有重要意義。除此之外，這些方法還可以進行相應的推廣，從而應用于其他雜交技術的質量監控上，比如Southern/Northern blot、組織原位雜交(Tissue in situ hybridization)及整裝原位雜交(Whole amount in situ hybridization)等。在以往的報道中，也有類似的實驗技術被使用。Roche公司的產品說明書上介紹了一種方法，用來確定探針標記的效率，稱為Spot Test (Catalog No. :11175025910,其是將地高辛標記的RNA探針與對照RNA點到尼龍膜上，再進行免疫檢測。但是這種方法存在其自身的局限性，應用范圍較窄。首先，雜交所用的尼龍膜常帶有很強的自發熒光，熒光抗體產生的信號被掩蓋而無法觀測到，由此導致FISH等采用熒光抗體的實驗無法采用這種方法檢測。其次，FISH等在載玻片上進行的原位雜交實驗，其某些技術參數與在膜上進行的實驗并不相同，如封閉液的選擇，抗體的濃度，雜交液的用量等等。因此對于載玻片上進行的實驗，相關的質量控制實驗也最好在玻片上進行。最后，上述提到的方法只是簡單的將抗體和偶聯到膜上的探針孵育，其用途僅僅限于探針及免疫檢測條件的控制。

發明內容
本發明目的在于提供一種熒光原位雜交過程的質量控制方法。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為1. 一種熒光原位雜交過程的質量控制方法，其特征在于載玻片經多聚賴氨酸處理后，設置不同的DNA樣品區，將不同DNA樣品溶液分別加到其上，風干后經紫外交聯儀照射，使DNA結合到玻片上，得到簡化的染色體片，而后進行免疫檢測，通過不同區域信號的反應得出熒光原位雜交過程的質量反饋。2.按權利要求1所述的熒光原位雜交過程的質量控制方法，其特征在于載玻片經多聚賴氨酸處理后，分別設置待測DNA樣品(T)、陽性對照(P)、陰性對照(N)不同的DNA 樣品區，將不同DNA樣品溶液分別加到其上，風干后用紫外交聯儀照射達450mJOUle，使DNA 結合到玻片上，得到簡化的染色體片，而后進行免疫檢測，即可分別從檢測探針質量、免疫檢測以及雜交流程方面得到相應的質量信息。3.按權利要求1所述的熒光原位雜交過程的質量控制方法，其特征在于針對探針質量和免疫檢測實驗中得到的結果和對策A.標記的探針DNA樣品⑴和陽性對照⑵位置上顯示明亮的熒光信號，未標記的DNA陰性對照(N)位置無信號時，即熒光原位雜交過程中探針質量與免疫檢測條件正常；B.陽性對照⑵顯示信號，待測DNA樣品⑴和陰性對照(N)無信號時，即熒光原位雜交過程中探針標記失敗；需重新合成探針；C.待測DNA樣品(T)、陽性對照(P)、陰性對照(N)均不顯示信號時，即熒光原位雜交過程中抗體失活或其他免疫檢測條件不合適；需重新制備抗體或檢查免疫檢測條件；D.待測DNA樣品(T)、陽性對照(P)、陰性對照(N)均顯示信號，即熒光原位雜交過程中抗體發生非特異性吸附；采取的措施為降低抗體濃度、加大洗脫強度、更換抗體所用緩沖液或更換整個抗體體系。4.按權利要求1所述的熒光原位雜交過程的質量控制方法，其特征在于針對雜交流程的檢測實驗中得到的結果和對策A.與探針序列同源的DNA樣品處⑴(P)獲得了明亮的信號，無關DNA樣品(N)處則無信號時，即熒光原位雜交過程中雜交的流程正常；B.陽性對照⑵顯示信號，已知包含探針序列的模板樣品⑴和陰性對照(N) 無信號時，即熒光原位雜交過程中雜交的流程異常；需提高探針濃度或調節雜交及洗脫條件；
C.陽性對照⑵顯示信號、已知包含探針序列的模板樣品⑴和陰性對照(N)均不顯示信號時，即熒光原位雜交過程中表示抗體失活或免疫檢測條件不合適；需重新制備抗體或采用更加寬松的雜交及洗脫條件；D.陽性對照⑵顯示信號、已知包含探針序列的模板樣品⑴和陰性對照(N)均顯示信號，即熒光原位雜交過程中出現非特異性雜交；需降低探針濃度或采取更加嚴謹的雜交及洗脫條件。5.按權利要求1所述的熒光原位雜交過程的質量控制方法，其特征在于所述檢測熒光原位雜交質量的方法可以適用于RNA探針及酶標抗體、組織原位雜交或整裝原位雜交中。本發明所具有的優點1.本發明質量檢測方法可以檢測熒光原位雜交(FISH)的大部分環節。通過合理的陰性對照和陽性對照的使用，可以快速的鎖定問題環節，并進行相應的糾正，從而快速高效的應用FISH技術，因而具有一系列優點如下表1所示表1 “本發明簡化染色體片”和真實染色體片的比較
權利要求
1.一種熒光原位雜交過程的質量控制方法，其特征在于載玻片經多聚賴氨酸處理后，設置不同的DNA樣品區，將不同DNA樣品溶液分別加到其上，風干后經紫外交聯儀照射， 使DNA結合到玻片上，得到簡化的染色體片，而后進行免疫檢測，通過不同區域信號的反應得出熒光原位雜交過程的質量反饋。
2.按權利要求1所述的熒光原位雜交過程的質量控制方法，其特征在于載玻片經多聚賴氨酸處理后，分別設置待測DNA樣品(T)、陽性對照(P)、陰性對照(N)不同的DNA樣品區，將不同DNA樣品溶液分別加到其上，風干后用紫外交聯儀照射達450mJOUle，使DNA結合到玻片上，得到簡化的染色體片，而后進行免疫檢測，即可分別從檢測探針質量、免疫檢測以及雜交流程方面得到相應的質量信息。
3.按權利要求1所述的熒光原位雜交過程的質量控制方法，其特征在于針對探針質量和免疫檢測實驗中得到的結果和對策A.標記的探針DNA樣品(T)和陽性對照(P)位置上顯示明亮的熒光信號，未標記的DNA 陰性對照(N)位置無信號時，即熒光原位雜交過程中探針質量與免疫檢測條件正常；B.陽性對照(P)顯示信號，待測DNA樣品(T)和陰性對照(N)無信號時，即熒光原位雜交過程中探針標記失敗；需重新合成探針；C.待測DNA樣品(T)、陽性對照(P)、陰性對照(N)均不顯示信號時，即熒光原位雜交過程中抗體失活或其他免疫檢測條件不合適；需重新制備抗體或檢查免疫檢測條件；D.待測DNA樣品(T)、陽性對照(P)、陰性對照(N)均顯示信號，即熒光原位雜交過程中抗體發生非特異性吸附；采取的措施為降低抗體濃度、加大洗脫強度、更換抗體所用緩沖液或更換整個抗體體系。
4.按權利要求1所述的熒光原位雜交過程的質量控制方法，其特征在于針對雜交流程的檢測實驗中得到的結果和對策A.與探針序列同源的DNA樣品處⑴(P)獲得了明亮的信號，無關DNA樣品(N)處則無信號時，即熒光原位雜交過程中雜交的流程正常；B.陽性對照(P)顯示信號，已知包含探針序列的模板樣品(T)和陰性對照(N)無信號時，即熒光原位雜交過程中雜交的流程異常；需提高探針濃度或調節雜交及洗脫條件；C.陽性對照(P)顯示信號、已知包含探針序列的模板樣品(T)和陰性對照(N)均不顯示信號時，即熒光原位雜交過程中表示抗體失活或免疫檢測條件不合適；需重新制備抗體或采用更加寬松的雜交及洗脫條件；D.陽性對照(P)顯示信號、已知包含探針序列的模板樣品(T)和陰性對照(N)均顯示信號，即熒光原位雜交過程中出現非特異性雜交；需降低探針濃度或采取更加嚴謹的雜交及洗脫條件。
5.按權利要求1所述的熒光原位雜交過程的質量控制方法，其特征在于所述檢測熒光原位雜交質量的方法可以適用于RNA探針及酶標抗體、組織原位雜交或整裝原位雜交中。
全文摘要
本發明涉及熒光原位雜交技術，具體的說是一種熒光原位雜交(FISH)過程的質量控制方法。載玻片經多聚賴氨酸處理后，設置不同的DNA樣品區，將不同DNA樣品溶液分別加到其上，風干后紫外交聯儀照射，使DNA結合到玻片上，得到簡化的染色體片，而后進行免疫檢測，通過不同區域信號的反應得出熒光原位雜交質量反饋。采用本發明監控方法，初次進行FISH操作的研究者可以快速的鎖定雜交過程中出現問題的中間環節，并進行相應的糾正，從而快速高效的應用FISH技術。這種質量控制體系的建立，對FISH以及其他雜交技術在不同物種中迅速普及具有重要意義。
文檔編號C12Q3/00GK102433398SQ20111034181
公開日2012年5月2日 申請日期2011年10月28日 優先權日2011年10月28日
發明者張曉軍, 李富花, 相建海, 趙翠, 郇聘 申請人:中國科學院海洋研究所