專利名稱：一種脂肽生物表面活性劑的工業化制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物表面活性劑的生產方法，尤其是涉及一種脂肽生物表面活性劑的工業化制備方法。
背景技術：
脂肽又名脂酰肽，屬于含氨基酸類脂。脂肽類生物表面活性劑一般是革蘭氏陽性的芽孢桿菌的代謝物。脂肽分子由親水的肽鍵和親油的脂肪烴鏈兩部分組成，由于其特殊的化學組成和兩親型分子結構，脂肽類生物表面活性劑在醫藥、食品、化妝品及微生物采油等領域有重要的應用前景。脂肽類表面活性劑一般由革蘭氏陽性的芽孢桿菌代謝產生，能產生脂肽類表面活性劑的菌株有很多，如枯草芽孢桿菌(Bacillussu btilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslic heniformis)等。除了細菌可以產生脂肽類表面活性劑外，酵母、真菌也可以產生。脂肽類生物表面活性劑按其結構分類可以分為環狀脂肽和線形脂肽兩大類。環狀脂肽。環狀脂肽是指分子中具有環狀結構的一類脂肽，肽鏈的C-端氨基酸的羧基與肽或脂肪酸中的氨基或羥基相連構成環狀結構。根據形成環的成分的差異，又可將環狀脂肽分為脂肪酸成環的環狀脂肽、脂肪酸接環的環狀脂肽及脂肪酸離環的環狀脂肽。 含氨基酸類脂是以低縮氨基酸為親水基團的生物表面活性劑。典型產物有脂肽、脂蛋白、脂氨基酸。這是一類表面性能優良的表面活性劑，其乳化性能好，去污能力強，與其他各種表面活性劑的相容性也很好，同時具有很好的抗菌性能。許多生物分子具有親水和親油基團，他們在性能上和化學合成的表面活性劑非常相似。通常把那些具有兩親性，表現出很高表面活性由微生物、動植物或植物產生的天然表面活性劑稱為生物表面活性劑(Biosurfactant，簡稱BS)。其中由微生物產生的生物表面活性劑活性較高，具有很好的親水、親油性能和界面優先分配能力，較為適合于工業化大規模生產。但現有的表面活性劑，由于產量低、周期長、裝料系數低、工藝復雜等缺陷，能大規模生產的還不多。

發明內容
本發明旨在于克服現有技術的不足，提供了一種脂肽生物表面活性劑的工業化制備方法，這種生產工藝具有產量高、效率高、裝料系數高、發酵周期短、工藝簡單，使產品綜合成本降低，完全適合工業化生產，對脂肽生物表面活性劑的推廣及大規模應用起到了重要的作用。本發明的一種脂肽生物表面活性劑的工業化制備方法，是由枯草芽孢桿菌 ACCC01430經發酵培養制得，其具體步驟如下
A、將斜面固體枯草芽孢桿菌(ACCC01430)菌種接入搖瓶培養，搖瓶中每500ml培養基接入1環菌種，溫度為35士2°C、120轉/分震蕩培養12 16小時，得到搖瓶菌種；
B、一級發酵培養將A步驟制得的搖瓶菌種轉接入裝有培養基的一級發酵罐中，搖瓶菌種與培養基的體積比為1 19 20，在溫度為；35士2°C、pH6 7. 5、通風比1: 0. 3 0. 5 及攪拌速度為100 150轉/分的條件下發酵培養10 14小時，得到一級發酵菌種；
C、二級發酵培養將B步驟制得的一級發酵菌種轉接入裝有培養基的二級發酵罐中， 一級發酵菌種與培養基的體積比為1:10，在溫度為35士2°C、pH 6 7. 5、通風比1: 0. 3 0. 5及攪拌速度為100 110轉/分的條件下發酵培養10 14小時，得到二級發酵菌種；
D、發酵培養將C步驟制得的二級發酵菌種轉接入裝有培養基的三級發酵罐中，二級發酵菌種與培養基的體積比為1 :10，在溫度為35士2°C、pH 6 7. 5、通風比1: 0.3 0.5、 攪拌速度為80 100轉/分，在菌體處于衰落期進行補料，發酵培養M 沈小時，得到脂肽生物表面活性劑。作為本發明的進一步改進，搖瓶及各級發酵罐培養基配方是米糠油2 5%、尿素 0. 2 1. 5%、糖蜜 10 15%,KCl 0. 05 1. 0%,KH2PO4 0. 05 1. 2%,K2HPO4 0. 05 1. 5%、 酵母膏0. 005 0. 1%、復合微量元素0. 005 0. 01%，余量為水，pH為6. 0 -7. 5 ；
所述的復合微量元素為硫酸鋅1. 1 g/L、氧化錫1.3 g/L、氯化錳1.0 g/L、硫酸銅 1.0 g/L、氧化鈷1.0g/L及溶劑水復配而成。作為本發明的進一步改進，所述的補料是米糠油，每次補料量按發酵液總體積量的3% 5%補加。作為本發明的進一步改進，各級發酵罐的裝料系數是60 80%。一種脂肽生物表面活性劑的工業化制備方法，整個生產制備過程是逐級擴大發酵純培養的過程。得到的脂肽生物表面活性劑發酵液經過殺菌和離心分離后，根據各種用途的需要純化成不同等級的產品，廣泛應用于三次采油、日化、農藥、食品、土壤修復等行業。本發明的一種脂肽生物表面活性劑的工業化制備方法，具有產量高、周期短、裝料系數高、工藝簡單等特點，實現了脂肽生物表面活性劑的工業化生產。本發明的一種脂肽生物表面活性劑的工業化制備方法，其脂肽含量達到7 10%g/L，并取得了工業化生產實驗的成功，發酵周期縮短到48小時，大大降低了生產成本； 本發明首次將工業化生產的脂肽發酵液應用現場，將其注入地下油層，使原來難以注水的區塊水順利注入，并且使原油采收率提高了 5 12% ；效率高。


圖1為表面張力；
圖2生物脂肽表面活性劑在不同濃度時的界面張力值。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明 本發明采用的菌的名稱及菌種來源如下
枯草芽孢桿菌(ACCC01430)，中國農業微生物菌種保藏中心。本發明實施例1 4中菌體的衰落期的標準，見高等教育出版社2002年5月第二版《微生物學教程》周德慶編著。在下述實施例中，進入三級發酵后，每小時檢測一次。實施例1
搖瓶及發酵罐培養基配方為米糠油2%、尿素1%、糖蜜11%、KC1 0. 1%、KH2P04 0. 05%、K2HP04 0. 3%、酵母膏0. 005%、復合微量元素0. 008%，其余為水，pH為7. 0，所述的復合微量元素為硫酸鋅1.1 g/L、氧化錫1.3 g/L、氯化錳1.0 g/L、硫酸銅1.0 g/L、氧化鈷 1.0g/L及溶劑水復配而成。搖瓶及發酵罐培養
將斜面枯草芽孢桿菌(ACCC01430)接入到7個3L搖瓶中，搖瓶裝入IL的培養基，每個搖瓶接入2環菌種，溫度為35士2°C、120 rpm培養14 h，血球計數板檢測菌數達到2億以上，即為得到搖瓶菌種；再轉接入200升的一級發酵罐，裝料系數為70%，接種量5%、溫度為 35士2°C、通風比為1 :0. 5、pH為7. 0、攪拌轉速為110 rpm培養12 h，得到一級發酵菌種； 再轉接入2噸二級發酵罐，裝料系數為70%，接種量10%、溫度為35士2°C、通風比為1 :0. 5、 PH為7.0、攪拌轉速為100 rpm培養12 h，得到二級發酵菌種，再轉接入20噸三級發酵罐， 裝料量為14噸，三級發酵罐的工藝參數為溫度35士2°C、滅菌前用0. 1噸固體NaOi^fpH 調到7.0，通風比為1 :0. 5、攪拌轉速為80 rpm，期間累計補加米糠油0.5噸，發酵培養M小時后用臨界膠束濃度反推法檢測脂肽含量為7. 5g/L。實施例2
搖瓶及發酵罐培養基配方為米糠油3%、尿素1. 5%、糖蜜17%、KCl 1. 0%、KH2PO4O. 2%、 K2HPO4L 5%、酵母膏0. 02%、復合微量元素0. 01%，其余為水，pH為7. 0，所述的復合微量元素為硫酸鋅1.1 g/L、氧化錫1.3 g/L、氯化錳1.0 g/L、硫酸銅1.0 g/L、氧化鈷1. Og/L及溶劑水復配而成。搖瓶及發酵罐培養
將斜面固體枯草芽孢桿菌(ACCC01430)菌種，轉接入4個3L搖瓶(各裝入IL培養基)， 每500ml培養基接入1環菌種，在溫度為35士2°C、120 rpm培養13. 5 h，血球計數板檢測菌數達到2億以上后，轉接入200升的一級發酵罐，裝料系數為67%，接種量3%、溫度為 35士2°C、通風比為1 :0.4、pH為7. 0、攪拌轉速為120 rpm培養12 h，轉接入2噸二級發酵罐，裝料系數為67%，接種量10%、溫度為35 士 2°C、通風比為1 :0. 4、pH為7. 0、攪拌轉速為 100 rpm培養12 h，轉接入20噸三級發酵罐，裝料量為14噸，三級發酵罐的工藝參數為溫度35士2°C、滅菌前用0. 10噸NaOH將pH控制在7.0，通風比為1 :0. 4、攪拌轉速為80 rpm, 期間累計補加米糠油0. 6噸，發酵培養25小時后用臨界膠束濃度反推法檢測脂肽含量為 8.8g/L0實施例3
搖瓶及發酵罐培養基配方為米糠油5%、尿素0. 2%、糖蜜20%、KC1 0. 05%,KH2PO4 1. 2%、 K2HPO4 0. 05%、酵母膏0. 1%、復合微量元素0. 005%,其余為水，pH為7. 5，所述的復合微量元素為硫酸鋅1.1 g/L、氧化錫1.3 g/L、氯化錳1.0 g/L、硫酸銅1.0 g/L、氧化鈷l.Og/ L及溶劑水復配而成。搖瓶及發酵罐培養
將斜面固體枯草芽孢桿菌(ACCC01430)菌種，轉接入6個3L搖瓶(裝入IL培養基)， 35士2°C、120 rpm培養12h，血球計數板檢測菌數達到2億以上，轉接入200升的一級發酵罐，裝料系數為60%，接種量5%、溫度為35士2°C、通風比為1 :1、？11為7.5、攪拌轉速為 120rpm培養12 h，轉接入2噸二級發酵罐，裝料系數為60%，接種量10%、溫度為35士2°C、 通風比為1 :1、？11為7.5、攪拌轉速為IOOrpm培養12 h，轉接入20噸三級發酵罐，裝料量為16噸，三級發酵罐的工藝參數為溫度35士2°C、滅菌前pH調到7. 5左右，后期用0. 12噸 NaOH將pH控制在7.0，通風比為1 1、攪拌轉速為100 rpm，期間累計補加米糠油0. 7噸， 發酵培養M小時后用臨界膠束濃度反推法檢測脂肽含量為10. 4g/L。實施例4
搖瓶及發酵罐培養基配方為米糠油3%、尿素1%、糖蜜20%、KCl 0. 5%、KH2PO4 0. 5%、 K2HPO4 0. 5%、酵母膏0. 05%及復合微量元素0. 005%，其余為水，pH為6. 5，所述的復合微量元素為硫酸鋅1.1 g/L、氧化錫1.3 g/L、氯化錳1.0 g/L、硫酸銅1.0 g/L、氧化鈷l.Og/ L及溶劑水復配而成。搖瓶及發酵罐培養
將斜面固體枯草芽孢桿菌(ACCC01430)菌種，轉接入7個3L搖瓶(裝入IL培養基)，接種量5%、35士2°C、120 rpm培養12h，轉接入200升的一級發酵罐，裝料系數為65%，接種量 5%、35士2°C、通風比為1 :0. 3、pH為6. 5，攪拌轉速為120 rpm培養12 h，轉接入2噸二級發酵罐，裝料系數為65%，接種量10%、溫度為35士2°C、通風比為1 :0. 3、pH為6. 5、攪拌轉速為120 rpm培養12 h，轉接入20噸三級發酵罐，裝料量為15噸，三級發酵罐的工藝參數為溫度35 士 2 °C、滅菌前pH調到6左右，后期用0. 23噸NaOH將pH控制在7. 0，通風比為 1 0. 3、攪拌轉速為120 rpm，期間累計補加米糠油0. 6噸，發酵培養25小時后用臨界膠束濃度反推法檢測脂肽含量為9. 7g/L。由上述幾個實例可以看出采用此生產工藝發酵脂肽含量可達到7 - 10 g/L。將經實施例1-4制得的脂肽表面活性劑，測定脂肽含量、發酵液表面張力及驅油效果，結果如下
(1)、發酵液中脂肽表面活性劑的臨界膠束濃度反推法檢測含量如圖1所示； O)、生物表面活性的界面張力檢測如圖2所示。A.實驗儀器JJ2000B型旋轉滴界面張力測量儀、全自動表面張力儀、萬分之一電子天平、電子秤、燒杯、吸管等。B.實驗材料生物表面活性劑枯草芽孢桿菌(ACCC01430)的發酵液濃度為1 5%、水大慶油田地層水、原油大慶原油，密度為0. 8806g/m3、氫氧化鈉固體片狀；
C.檢測方法參見中華人民共和國石油天然氣行業標準SY/T 5370-1999。D.檢測結果
生物表面活性劑濃度為1. 0%時與大慶原油之間的界面張力值，見圖2。總結將枯草芽孢桿菌ACCC01430其經發酵后脂肽含量可達到5 10%g/L，35°C、 0. 5 1 %濃度的脂肽發酵液在PH為8-9時，能使原油與地層水界面張力降低至0. 07 0. 2mN/m，在水相有效滲透率50 — 400md、殘余油飽和度30 50%、注入量為0. Ipv脂肽發酵液濃度為1_5%、50°C的條件下，原油采收率比水驅提高了 5-10%左右。
權利要求
1.一種脂肽生物表面活性劑的工業化制備方法，其特征在于該脂肽生物表面活性劑是由枯草芽孢桿菌ACCC01430經發酵培養制得，其具體步驟如下A、將斜面固體枯草芽孢桿菌ACCC01430菌種接入搖瓶培養，搖瓶中每500ml培養基接入1環菌種，溫度為35士2°C、120轉/分震蕩培養12 16小時，得到搖瓶菌種；B、一級發酵培養將A步驟制得的搖瓶菌種轉接入裝有培養基的一級發酵罐中，搖瓶菌種與培養基的體積比為1 19 20，在溫度為；35士2°C、pH6 7. 5、通風比1: 0. 3 0. 5 及攪拌速度為100 150轉/分的條件下發酵培養10 14小時，得到一級發酵菌種；C、二級發酵培養將B步驟制得的一級發酵菌種轉接入裝有培養基的二級發酵罐中， 一級發酵菌種與培養基的體積比為1:10，在溫度為35士2°C、pH 6 7. 5、通風比1: 0. 3 0. 5及攪拌速度為100 110轉/分的條件下發酵培養10 14小時，得到二級發酵菌種；D、發酵培養將C步驟制得的二級發酵菌種轉接入裝有培養基的三級發酵罐中，二級發酵菌種與培養基的體積比為1 :10，在溫度為35士2°C、pH 6 7. 5、通風比1: 0.3 0.5、 攪拌速度為80 100轉/分，在菌體處于衰落期進行補料，發酵培養M 沈小時，得到脂肽生物表面活性劑。
2.根據權利要求1所述的一種脂肽生物表面活性劑的工業化制備方法，其特征在于 搖瓶及各級發酵罐培養基配方是米糠油2 5%、尿素0. 2 1. 5%、糖蜜10 15%、KCl 0. 05 1. 0%、KH2PO4 0. 05 1. 2%、K2HPO4 0. 05 1. 5%、酵母膏 0. 005 0. 1%、復合微量元素0. 005 0. 01%,余量為水，pH為6. 0 -7. 5 ；所述的復合微量元素為硫酸鋅1. 1 g/L、氧化錫1.3 g/L、氯化錳1.0 g/L、硫酸銅 1.0 g/L、氧化鈷1.0g/L及溶劑水復配而成。
3.根據權利要求1所述的一種脂肽生物表面活性劑的工業化制備方法，其特征在于 步驟D中所述的補料是米糠油，每次補料量按發酵液總體積量的3% 5%補加。
4.根據權利要求1或2或3所述的一種脂肽生物表面活性劑的工業化制備方法，其特征在于各級發酵罐的裝料系數是60 80%。
全文摘要
本發明的一種脂肽生物表面活性劑的工業化制備方法涉及一種生物表面活性劑的生產方法，是由枯草芽孢桿菌ACCC01430經發酵培養制得，其具體步驟如下將斜面固體枯草芽孢桿菌菌種接入搖瓶培養，溫度為35±2℃、120轉/分震蕩培養12～16小時，得到搖瓶菌種；將制得的搖瓶菌種轉接入裝有培養基的一級發酵罐中，制得一級發酵菌種；將一級發酵菌種轉接入裝有培養基的二級發酵罐中，制得二級發酵菌種；將二級發酵菌種轉接入裝有培養基的三級發酵罐中，發酵培養24～26小時，即制得脂肽生物表面活性劑。本發明的一種脂肽生物表面活性劑的工業化制備方法，其脂肽含量達到7～10%g/L，并取得了工業化生產實驗的成功，發酵周期縮短到48小時，大大降低了生產成本；本發明首次將工業化生產的脂肽發酵液應用現場，將其注入地下油層，使原來難以注水的區塊水順利注入，并且使原油采收率提高了5～12％；效率高。
文檔編號C12R1/125GK102373258SQ20111034341
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者孫彥達, 張麗茹, 李國軍, 段寶顏, 沈玉江, 王柱 申請人:大慶華理能源生物技術有限公司