專利名稱：可降解亞胺類聚陽離子及其合成方法、納米顆粒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種可用于核酸(DNA與RNA)的輸送的可降解亞胺類聚陽離子及其合成方法、納米顆粒。
背景技術：
DNA和SiRNA藥物從概念走向臨床應用的關鍵性瓶頸是其體內輸送系統的研發。 各類基因載體中，聚陽離子載體和病毒及脂質體載體相比具有基因擔載密度和擔載量均大、制備簡單，便于化學修飾等優勢，也存在著化學毒性大、體內循環周期短(不利于靶向) 的缺點。高分子量的聚乙烯亞胺(PEI，25kDa)由于其氨基密度大，易于包裹帶負電荷的基因物質而成為最早在體外和體內被廣泛研究的轉染活性較高的核酸物質(DNA、RNA)輸送載體，但無法避免其高分量烷基骨架無法降解所帶來的細胞毒性。因此設計和構建可降解的聚陽離子是提高基因物質轉染活性、降低其細胞毒性的一個關鍵策略。比如，利用小分子量的聚乙烯亞胺通過在生理條件下可斷裂的連接鍵構建可降解的聚乙烯亞胺類聚陽離子基因載體是本領域科學家所熟知的一個例子。俄亥俄州立大學的Robert J. Lee等最早采用交聯劑二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)(DSP)及雙硫二丙二亞氨甲基醚(DTBP)作為連接劑分別與低分子量PEI (PEI SOODa) 交聯得到高分子量可降解的聚乙烯亞胺類聚陽離子[Gosselin MA, Guo W, Lee RJ.低分子量聚乙烯可逆交聯形成的有效輸送基因載體。生物共軛化學，[J]2001; 12:989-94.]。這兩個含有二硫鍵衍生物在中國倉鼠(CHO)卵巢細胞中具有與市售高分子量PEI (25KDa)相當的轉染活性，二硫鍵的引入使得聚合物可以被體內的還原試劑谷胱甘肽還原，從而二硫鍵斷開，降解成為細胞毒性小的低分子量PEI，但是文獻中沒有給出具體的細胞毒性數據。 隨后有大量文獻報道了將低分子量PEI (PEI SOODa)通過含有二硫鍵、酯鍵、胺酯鍵等能夠自我斷裂的連接劑交聯而成的聚合物[Kloeckner J, Wagner E, Ogris M.利用多胺低聚物構建的可降解聚陽離子基因載體。[J].歐洲藥劑學.2006 ;29 :414-25.等刊物]。這些研究雖然顯示了概念上的可行性，小分子量的PEI以及帶有各種連接劑斷裂片段的低分子量 PEI在人體的應用仍然不被接受。為了使降解后的低分子量PEI不帶有連接劑片段，猶他大學的Sung Wan Kim等人報道了采用戊二醛作為連接劑與低分子量PEI (ISOODa)交聯，生成亞胺鍵連接的可降解聚乙烯亞胺類聚陽離子[Kim YH, Park JH, Kim Sff, et al.通過酸敏感鍵構建可降解的聚乙烯亞胺類聚陽離子基因載體。[J].控制釋放研究2005;103:209-19.]。這一結構的特點是細胞攝取后，凝聚基因的聚陽離子在內吞體和溶酶體的酸性條件下，與低分子量PEI直接相連的亞胺鍵斷開，生成無細胞毒性的小分量PEI。但是亞胺鍵的聚合結構不能保證這一聚陽離子攜帶核酸進入細胞之前足夠穩定，其轉染活性較也不理想。為了改善亞胺結構的穩定性，Jin和du采用能夠與伯胺形成帶有共軛π鍵結構的亞胺的乙二醛作為連接劑，將人體內源性多氨基單體——精胺和亞精胺聚合成聚陽離子， 顯示了較好的穩定性和基因轉染活性[Du Z，Jin Τ.以人體內源性多胺單體為基本構建單元并可降解為人體內源性多胺單體的聚陽離子基因載體，用于DNA(包括DNA疫苗)包裹與輸送.Jin T, 2009. J0因此，我們通過相同的連接鍵，利用低分子量PEI為基本構建單元并可降解為初始低分子量PEI的聚陽離子基因載體。前期我們利用乙二醛作為連接劑，將低分子量的PEI聚合為可降解為初始低分子量PEI與乙二醛的聚陽離子基因載體。體外實驗顯示了良好的轉染效果與細胞活性。在此基礎上，我們進一步利用丙酮醛與低分子量的PEI 合成未見文獻報道的亞胺類聚陽離子。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種可降解亞胺類聚陽離子及其合成方法、納米顆粒。本發明采用低分子量的PEI與丙酮醛構建和降解回到多氨分子的起始狀態的聚陽離子，其中，PEI的伯胺與丙酮醛的醛基和酮羰基生成帶有共軛η鍵的亞胺結合；本發明構建的聚陽離子化學穩定性較好，能夠緊密包裹DNA和RNA，在體內循環過程中不易降解，兼顧到達靶細胞之前的穩定性和進入靶細胞之后的生物響應性。本發明的目的是通過以下技術方案實現的本發明涉及一種可降解亞胺類聚陽離子，結構式為
N Il
權利要求
1.-種可降解亞胺類聚陽離子，其特征在于，結構式為
2.一種如權利要求1所述的可降解亞胺類聚陽離子的合成方法，其特征在于，包括如下步驟a、將丙酮醛水溶液在-10°C 10°C下緩慢滴加到PEI的乙醇溶液中，同時加入干燥的分子篩；b、在10 30°C下攪拌，進行縮合反應，即得產物。
3.根據權利要求2所述的可降解亞胺類聚陽離子的合成方法，其特征在于，所述步驟a 中丙酮醛水溶液在0°C下緩慢滴加到PEI的乙醇溶液中。
4.根據權利要求2所述的可降解亞胺類聚陽離子的合成方法，其特征在于，所述PEI為低分子量PEI。
5.根據權利要求4所述的可降解亞胺類聚陽離子的合成方法，其特征在于，所述低分子量PEI的分子量為800Da。
6.根據權利要求2所述的可降解亞胺類聚陽離子的合成方法，其特征在于，對所述得到的產物進一步分離純化，所述分離純化步驟如下將所述產物置于透析袋透析后低溫凍干真空除去水。
7.根據權利要求6所述的可降解亞胺類聚陽離子的合成方法，其特征在于，所述透析袋的分子量為10000 ；所述透析的時間為12 48小時。
8.—種納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒由包括如下步驟的方法制備而得a、將權利要求1所述的可降解亞胺類聚陽離子加超純水或DEPC配置成聚陽離子溶液， 將核酸物質加超純水或DEPC配置成核酸物質溶液；b、將所述聚陽離子溶液快速加入到核酸物質溶液中，混合；c、將混合溶液于室溫下孵育，即得所述納米顆粒。
9.根據權利要求8所述的納米顆粒，其特征在于，所述核酸物質為DNA或RNA。
全文摘要
本發明涉及可用于核酸的輸送的可降解亞胺類聚陽離子及其合成方法、納米顆粒。本發明用低分子量的PEI與丙酮醛構建和降解回到低分子量的PEI的起始狀態的聚陽離子，聚陽離子的合成方法為將丙酮醛水溶液緩慢滴加到PEI的乙醇溶液，同時加入干燥的分子篩中；在室溫下利用磁力攪拌器攪拌進行伯氨基與醛基和酮羰基的縮合反應。本發明不僅可以降解，而且在降解過程中釋放出含未質子化的氨基的低分子量PEI，而且它們的降解產物不會像其他可降解的聚合物那樣產生酸性基團。能夠有助于逃逸溶酶體，在低表面電荷的細胞質中釋放基因。對于質子海綿效應，溶酶體是由于質子海綿效應產生的滲透壓破裂的。聚陽離子的氨基鍵起質子海綿作用。
文檔編號C12N15/87GK102516535SQ201110358799
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月14日 優先權日2011年11月14日
發明者吳飛, 杜子秀, 臧怡, 金拓, 黃立群 申請人:上海交通大學