專利名稱：過表達單一MicroRNA成熟體序列的新方法
過表達單一MicroRNA成熟體序列的新方法技術領域
本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及過表達單一 MicroRNA成熟體序列的新方法。
背景技術：
microRNA是一類長約22個堿基的、廣泛存在于動植物體內的內源非編碼RNA[1]。近10年來，隨著對microRNA研究的不斷深入,科學家們已經發現microRNA雖然不編碼蛋白，但是，它們可以通過堿基互補配對的方式來識別與之相對應的靶mRNA，通過抑制翻譯或是促使靶mRNA降解的方式影響基因表達[2]。microRNA能夠參與諸如生長發育、免疫防御等許多生理過程，并且microRNA的調節異常可以參與到多個疾病的病理過程[3，4]。所以，microRNA作為一種新發現的基因表達調控分子有著重要的功能。
過表達所要研究的目的基因，并觀察其產生的表型，是探索基因功能的一個不可或缺的方法。對于microRNA,過表達的方式目前主要有:轉染人工合成的microRNA類似物或microRNA莖環前體；克隆基因組中的microRNA編碼序列到過表達載體中再轉染細胞。人工合成的類似物或是前體雖然可以特異性地提高細胞中的某個microRNA的表達，但是，它只能實現瞬時表達，隨著細胞的增殖，其過表達水平會被稀釋，難以應用到需要長時間穩定表達的研究，更難以實現體內研究。通過質粒過表達的方式，尤其是通過病毒載體進行的過表達，可以實現穩定過表達，并且轉染容易，能實現體內功能的研究。
但是，目前的microRNA過表達質粒的構建,依賴于克隆基因組中的microRNA編碼序列(通常將pre-miciORNA的全部序列同其上下游各一、兩百個堿基一并克隆)。每個microRNA基因經過轉錄、加工，理論上最終都能夠產生兩種具有不同成熟序列的成熟體microRNA:5p-microRNA和3p_microRNA[5]。在生理條件下，對不同的microRNA,這兩種成熟序列會以其中的一種為主進行表達(稱為miR-X)，而另外的一種卻被淘汰降解豐度很低(稱為miR-X*);有時則會兩種序列共同表達并存在(分別稱為miR-X-5p和miR-X_3p) [6]。由于現有的質粒過表達策略是模擬細胞內部的microRNA轉錄和成熟的過程,而這一過程對成熟體序列有天然的選擇性，所以，不能大量地過表達水平低的miR-X%也不能隨心所欲地單一過表達其中的一條成熟體序列(針對miR-X-5p和miR-X-3p的情況)。
然而，隨著研究深入，microRNA的功能不僅局限于早期所鑒定的表達量豐富的成熟體序列，有越來越多的研究表明，原來被認為表達豐度低的成熟體序列，在特定的條件下表達會被上調，進而發揮調節功`能[7,8]。同時，由于5p-microRNA和3p_microRNA的序列差異，其功能往往是不同的。
因此，在原有質粒過表達優勢的基礎上，通過新的策略，單一地過表達microRNA成熟體序列中的一種，勢必為今后更精細的研究miCToRNA的功能提供了一個強有力的工具。發明內容
本發明的目的在于提供過表達單一 MicroRNA成熟體序列的新方法。在本發明的第一方面，提供一種表達單一 microRNA成熟體的方法，所述方法包括:(I)提供一種表達構建物,所述的表達構建物含有以下結構:5，Seq 正向-Y-Seq 反向 3， (I);其中，Seqfi自為該單一 microRNA成熟體相應的DNA序列；Seq1自為與Seqfi自互補的序列；Y為位于Seqj^和SeqfitJ3之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seqj^和Seq&t；i)不互補；式I所示的結構可形成如下所示的二級結構:
權利要求
1.一種表達單一 microRNA成熟體的方法,其特征在于,所述方法包括: (1)提供一種表達構建物，所述的表達構建物含有以下結構: 5’ Seq 正向-Y-Seq 反向 3’ (I)； 其中，Seqfi自為該單一 microRNA成熟體相應的DNA序列！Seq1自為與Seqfi自互補的序列；Y為位于Seq1自和Seq反自之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq1自和Seqfi自不互補；式I所示的結構可形成如下所示的二級結構:
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，式I所示的結構進入細胞并被胞內加工后，基于Seq&@結構表達所述的單一 microRNA成熟體,基于Seqirt結構表達與另一 microRNA成熟體不同的RNA，其不具備另一 microRNA成熟體的活性。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，式(II)中，以Seqi@為參照，“I”存在于與該Seqirt序列的特定位點上,該特定位點對應于所述另一microRNA成熟體發揮活性的關鍵位點。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，式(II)中，以Seq1^1為參照，“j”存在于該序列的5’端第2-10位；且“ j”存在的個數為0-5個。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Seqtt具有SEQID NO:2所示的核苷酸序列；和/或 所述的Seqfi自具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；和/或 所述的Y具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，式(I)結構的序列選自: SEQ ID NO:4中第8-60位所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO:4中第8-62位所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO:4中第6-62位所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO:4中第5-66位所示核苷酸序列。
7.—種表達單一 microRNA成熟體的表達構建物,所述的表達構建物含有以下結構: 5’ Seq 正向-Y-Seq 反向 3’ (I)； 其中，Seq反向為該單一 microRNA相應的DNA序列！Seq1自為與Seqfi自互補的序列；Y為位于Seqirt和Seq&@之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq^^^P Seq&@不互補；式I所示的結構在可形成如下所示的二級結構:
8.如權利要求7所述的表達構建物，其特征在于，所述的Seq1^1具有SEQID NO:2所示的核苷酸序列；和/或 所述的Seqfi^1具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；和/或 所述的Y具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
9.如權利要求8所述的表達構建物，其特征在于，式(I)結構的序列選自: SEQ ID NO:4中第8-60位所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO:4中第8-62位所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO:4中第6-62位所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO:4中第5-66位所示核苷酸序列。
10.權利要求7-9任一所述的表達構建物的用途,用于表達單一microRNA成熟體。
11.一種重組細胞，其中包含權利要求7-9任一所述的表達構建物。
12.如權利要求11所述的重組`細胞，其特征在于，所述的細胞是哺乳動物細胞。
全文摘要
本發明涉及過表達單一MicroRNA成熟體序列的新方法。本發明首次提供了一種全新的單一microRNA成熟體表達策略，通過對表達構建物的“莖”部位的堿基互補、配對的巧妙設計，使得表達構建物能夠形成莖環結構但不表達另一microRNA成熟體序列，從而專一性表達單一microRNA。本發明克服了現有技術中難以特異性表達microRNA兩條成熟序列中的一條的技術難題。
文檔編號C12N15/113GK103103189SQ201110359200
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月14日 優先權日2011年11月14日
發明者沈南, 曲波 申請人:中國科學院上海生命科學研究院