專利名稱：一種轉基因水稻外源插入載體旁側序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物技術領域的基因序列。具體的說，涉及一種轉基因水稻品系SK-2的外源插入載體的旁側序列。
背景技術：
自1983年首例轉基因煙草作物問世以來，基因工程技術發展日新月異，轉基因作物新品種不斷涌現，近年來，玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等轉基因作物已在許多國家允許種植和生產，并被廣泛用作食品或飼料的加工原料。由于轉基因產品存在著生態風險和食品安全等一系列的問題，因此，世界各國政府和相關國際組織紛紛制定相應的安全管理法規，加強遺傳改良作物的規范管理，并對遺傳改良作物及其產品實施標識制度。 為了應對遺傳改良作物管理相關的法律法規和制度，建立高效、快速、特異的檢測技術十分必要，它是各國際組織和國家管理遺傳改良作物的有力技術支撐。基于核酸的聚合酶鏈反應(PCR)檢測技術因具有高靈敏度和特異性強的優點，已成為目前最重要、應用最廣泛的遺傳改良作物及其產品檢測技術。PCR檢測方法建立的主要依據是特異性的擴增遺傳改良植物的外源基因片段。在轉基因植物中，穩定表達的外源DNA插入片段一般包括啟動子、目的基因和終止子三類元件。針對擴增的外源DNA片段差異，PCR檢測策略可以分為四種，即通用元件篩選PCR檢測、基因特異性PCR檢測、構建特異性PCR檢測和品系特異性PCR檢測。品系特異性PCR檢測是通過檢測外源插入載體與植物基因組的連接區序列實現的。由于每個遺傳改良作物品系，都具有特異性的外源插入載體與植物基因組的連接區序列，并且連接區序列是單拷貝的，因此品系特異性檢測方法具有較篩選、基因特異性和構建特異性PCR檢測方法更高的特異性和準確性，能夠特異性的檢測專一的遺傳改良作物品系。因此，外源插入片段的旁側序列是建立轉基因植物品系特異性檢測方法的重要技術資料。水稻是我國最重要的糧食作物之一，隨著轉基因技術在水稻中的廣泛研究和應用，已經有多個轉基因水稻品系進行了環境釋放，申請商業化種植。為了對轉基因水稻進行監督管理，保障其健康發展，對轉基因水稻的外源插入片段的旁側序列進行分離非常關鍵。目前已經有部分專利和文獻報道了轉基因植物外源插入片段的旁側序列，例如張大兵等人于2006年利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系M0N863的外源插入片段的旁側序列，建立了轉基因M0N863玉米的品系特異性檢測方法，謝家建等人于2007年利用TAIL-PCR、genome walking和D-PCR等方法獲得了轉基因水稻克螟稻、Bt汕優63、科豐6號、科豐8號的外源插入片段的旁側序列，并建立了品系特異性的檢測方法。然而，在對現有的專利和文獻的分析中發現，還沒有任何關于轉基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁側序列的文章和專利報道。

發明內容
針對上述領域中的空白，提供了一種轉基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁側序列。進一步，本發明還提供該轉基因品系特異性的PCR檢測方法。一種轉基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁側序列，所述旁側序列為3’端旁側序列，其特征在于3’端旁側序列如SEQ ID NO: I所示。一種轉基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁側序列，所述旁側序列為5’端旁側序列，其特征在于5’端旁側序列如SEQ ID N0:2所示。3’端旁側序列的制備方法，其特征在于提取轉基因水稻品系SK-2植物基因組DNA,通過TAIL-PCR擴增得到。5’端旁側序列的制備方法，其特征在于提取轉基因水稻品系SK-2植物基因組DNA，通過PCR擴增得到。 轉基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁側序列的定性PCR檢測方法，其特征在于所述PCR反應中的兩條引物組合為3’端旁側序列的特異性引物一條引物為依據SEQID NO: I中1-2262位序列設計的正向引物，另一條引物為依據SEQ ID NO: I的2263-3221位序列設計的反向引物。合成引物如下Sk2-Fl :5’-CCACCACTTCAAGAACTCTGTAGC-3’和Sk2-R2: 5’-GTAGGGGTAGGTA ATTGGGAAGG-3’ 。轉基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁側序列的定性PCR檢測方法，其特征在于所述PCR反應中的兩條引物組合為5’端旁側序列的特異性引物一條引物為依據SEQID N0:2中1-89位序列設計的正向引物，另一條引物為依據SEQ ID NO: 2的90-518位序列設計的反向引物。合成引物如下Sk2-F2 :5’ - ATATAGGGTCCACATGTTAGG-3’ 和 Sk2_R2: 5’ -ATGACGTATCAAAGTACCGAC-3’ 。提取總DNA，利用 SK2-F1/SK2-R1 或 SK2-F2/SK2-R2 組合進行 PCR 擴增；PCR 產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產物，如存在產物則說明樣品中含有轉基因水稻品系SK-2來源的成分。根據朱常香等(朱常香等.用兩個抗蟲基因分別轉化水稻及抗蟲株系的獲得.農業生物技術學報.1999，7:259-266.)報道的用于轉化的載體pBW3的結構(見圖1)，含有由Actin啟動子和/ //終止子調控目的基因CitIA O」和由35S啟動子和Nos終止子調控的篩選標記基因Bar兩個基因。本發明采用常規方法，提取植物基因組DNA，利用TAIL-PCR分離法得到3’端旁側序列3221bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。通過分析，該3’端旁側序列包括轉化載體pBW3部分序列，其核苷酸序列與SEQ ID NO: I中1-2262位的核苷酸序列完全相同；水稻基因組序列，位于水稻8號染色體(GenBank登記號AP005734. 4)的54604-55562位，其核苷酸序列與SEQ ID NO :I中從2263-3221位的核苷酸序列完全相同。利用PCR擴增得到5’端旁側序列518bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。通過分析，該5’端旁側序列包括水稻基因組序列，位于水稻8號染色體(GenBank登記號AP005734. 4)的55444-55531位，其核苷酸序列與SEQ ID NO:2中從1_89位的核苷酸序列完全相同。轉化載體PBW3部分序列，其核苷酸序列與SEQ ID NO:2中的90-518位的核苷酸序列完全相同。轉基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁側序列的定性PCR檢測方法，以3’端旁側序列或5’端旁側序列作為目的DNA擴增片段。根據3’端旁側序列設計特異性引物，一條引物為依據SEQ ID NO: I中1-2262位序列設計的正向引物，另一條引物為依據SEQ ID NO: I的2263-3221位序列設計的反向引物正向引物Sk2-Fl :5’-CCACCACTTCAAGAACTCTGTAGC-3’ ；反向引物SK2-R1 5’ -GTAGGGGTAGGTAATTGGGAAGG-3’。據5’端旁側序列設計特異性引物，一條引物為依據SEQ ID N0:2中1-89位序列設計的正向引物，另一條引物為依據SEQ ID N0:2的90-518位序列設計的反向引物。合成引物如下Sk2-F2 :5’_ ATATAGGGTC CACATGTTAGG-3’和Sk2-R2: 5’- ATGACGTATCAAAGTACCGAC-3’ 。提取總DNA，利用 SK2-F1/SK2-R1 或 SK2-F2/SK2-R2 組合進行 PCR 擴增；PCR 產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產物，如存在產物則說明樣品中含有轉基因水稻品系SK-2來源的成分。本發明首次克隆了轉基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁側序列，并且明確了轉基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁側序列可以用作目的DNA擴增片段，建立特異性的轉基因水稻品系SK-2的品系特異性定性PCR檢測。本發明所克隆、分離的外源插入片段的旁側序列可以進一步用于建立轉基因品系特異性PCR檢測方法。


圖I pBW3載體的結構示意圖，
圖2 3’端邊界TAIL-PCR擴增圖譜，
泳道 MDNA Marker,大小依次為 5000bp,3000bp,2000bp,1500bp,IOOObp,900bp,800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，IOObp ;泳道 1，2，3:引物 ADl 的三級TAIL-PCR擴增反應產物；泳道4，5，6 :引物AD2的三級TAIL-PCR擴增反應產物；泳道7，8，9 :引物AD3的三級TAIL-PCR擴增反應產物。圖3轉基因水稻品系SK-2 5’端旁側序列PCR擴增圖譜，
M DNA Marker,大小依次為 1500bp, IOOObp, 900bp, 800bp, 700bp, 600bp, 500bp, 400bp,300bp,200bp, IOObp ;泳道 I :引物組合 0RT_F/Act-R 擴增產物。圖4轉基因水稻品系SK-2 3’端旁側序列特異性引物SK2-F1/SK2-R1檢測，
M :marker 大小依次為 1500bp,1000bp,900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,300bp，200bp，IOObp ;泳道I，轉基因水稻品系SK-2 ;泳道2 :對照圣稻301。圖5轉基因水稻品系SK-2 3’端旁側序列特異性引物SK2-F2/SK2-R2檢測，
M :marker 大小依次為 1500bp,1000bp,900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,300bp，200bp，IOObp ;泳道I，轉基因水稻品系SK-2 ;泳道2 :對照圣稻301。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用 于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如 Sambrook 等分子克隆實驗手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I
轉基因水稻品系SK-2的外源插入載體的旁側序列的克隆一、實驗材料
I、植物材料
轉基因水稻轉基因水稻品系SK-2。二、實驗方法和過程
I、水稻基因組DNA提取與檢測 I)水稻基因組DNA的提取
取苗期水稻葉片做為DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout試劑盒(天澤基因公司)的操作手冊，進行水稻材料總DNA的提取。2 )水稻基因組DNA檢測
取5ul提取的DNA溶液，以O. 8%的瓊脂糖凝膠電泳，根據其亮度和帶型來初步判斷提取DNA的質量。采用紫外分光光度計測定所提取的DNA的濃度和純度。2、轉基因水稻品系SK-2旁側序列的分離
1)TAIL-PCR分離轉基因水稻品系SK-2 3’端旁側序列
TAIL-PCR用于擴增已知區域的側翼序列。根據SK-2插入載體(圖I) Nos終止子DNA序列設計三個巢式特異性PCR引物TNos-Fl、TNos-F2和TNos_F3，依次與3個簡并引物AD1-AD3分別組合進行3次PCR擴增，引物序列見表I。PCR反應條件見表2。表I用于TAIL-PCR擴增的簡并引物和特異性引物
權利要求
1.一種轉基因水稻品系SK-2的外源插入載體的旁側序列，所述旁側序列為3’端旁側序列，其特征在于3’端旁側序列如SEQ ID NO: I所示。
2.—種轉基因水稻品系SK-2的外源插入載體的旁側序列，所述旁側序列為5’端旁側序列，其特征在于5’端旁側序列如SEQ ID N0:2所示。
3.權利要求I所述的旁側序列的制備方法，其特征在于提取轉基因水稻品系SK-2植物基因組DNA，通過TAIL-PCR擴增得到。
4.權利要求2所述的旁側序列的制備方法，其特征在于提取轉基因水稻品系SK-2植物基因組DNA，通過PCR擴增得到。
5.如權利要求I所述的轉基因水稻品系SK-2外源插入載體的旁側序列的應用，其特征是利用該序列特征設計的轉基因水稻SK-2的品系特異性定性PCR檢測方法 合成引物如下Sk2-Fl :5’-CCACCACTTCAAGAACTCTGTAGC-3’ 和 Sk2_Rl5，-GTAGGGGTAGGTAAT TGGGAAGG-3，； 提取總DNA，利用SK2-F1/SK2-R1組合進行PCR擴增；PCR產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產物，如存在產物則說明樣品中含有轉基因水稻品系SK-2來源的成分。
6.按權利要求2所述的轉基因水稻品系SK-2外源插入載體的旁側序列的應用，其特征是利用該序列特征設計的轉基因水稻SK-2的品系特異性定性PCR檢測方法 合成引物如下Sk2-F2:5’- ATATAGGGTCCACATGTTAGG-3’ 和 Sk2_R2: 5’-ATGACGTATCAAAGTACCGAC-3’ ；提取總 DNA，利用 SK2-F2/SK2-R2 組合進行 PCR 擴增；PCR 產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產物，如存在產物則說明樣品中含有轉基因水稻品系SK-2來源的成分。
全文摘要
本發明涉及一種轉基因水稻外源插入載體旁側序列及其應用，屬于生物技術領域。本發明首次克隆了轉基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁側序列，并且明確了轉基因水稻品系SK-2的外源插入片段的旁側序列可以用作目的DNA擴增片段，建立特異性的轉基因水稻品系SK-2的品系特異性定性PCR檢測。本發明所克隆、分離的外源插入片段的旁側序列可以進一步用于建立轉基因品系特異性PCR檢測方法。利用該旁側序列設計特異性引物用于目的DNA的擴增，能建立特異性的轉基因水稻品系SK-2的品系特異性定性、定量PCR檢測。
文檔編號C12N15/10GK102628040SQ20121008412
公開日2012年8月8日 申請日期2012年3月27日 優先權日2012年3月27日
發明者李文華, 楊正友, 田園, 趙鳳春 申請人:山東農業大學