專利名稱：牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑和制備及應用方法
技術領域：
本發明涉及一種能快速檢測是否被牛輪狀病毒與牛冠狀病毒感染的分子檢測技術，特別是提供了不僅能夠分別用于檢測牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的分子檢測，還可以用于同時檢測上述兩種病毒的分子檢測試劑的制備及其應用，屬于動物疫病檢測技術領域。
背景技術：
牛腹瀉病是養牛業中最常見疾病之一，主要以拉稀便、軟便或水樣便，嘔吐、脫水和體重減輕為主要臨床特征。對于犢牛，腹瀉可導致新生犢牛生長發育不良和大量死亡，又被稱為新生犢牛的殺手。致命的腹瀉多侵害生后2周內的犢牛，發病率可達80%，病死率最高可達70%，給養牛業造成巨大的經濟損失。因此，如何預防牛腹瀉病已成為養牛業的迫切需要解決的重要問題。根據腹瀉發生病因的不同，腹瀉可分為傳染性腹瀉和非傳染性腹瀉。傳染性腹瀉是目前大多數養牛場最常見的疾病，而牛輪狀病毒(Bovine rotavirus, BRV)和牛冠狀病毒(Bovine coronavirus, BCoV )是牛發生傳染性腹瀉的兩種重要病原。BRV可引起1 3月齡犢牛和成年嚴重腹瀉，在我國的發病率為60% 80%，給養牛業造成很大經濟損失。 BCoV是引起10日齡新生犢牛腹瀉的一種重要的病原。自美國Mebus等首次報道BCoV以來，隨后證明BCoV在世界范圍內廣泛分布，在我國許多地區牛群中流行。BCoV引起的犢牛腹瀉僅次于輪狀病毒，并且可導致人的腹瀉。BRV屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，病毒基因組為分節段的單股RNA。BRV基因組含有11個片段，共編碼6個結構蛋白(VPl VP4，VP6和VP7)和6個非結構蛋白(NSP1 NSP6)。VP7蛋白由基因片段7、8或9編碼，分子量為37Da，由3 個AA組成，占病毒蛋白的30%。VP7是BRV外殼的主要糖蛋白和保護性抗原，決定了病毒的G型(C-serotype)。 目前已知輪狀病毒有16個C型，在牛群中有10血清型被發現，分別為G1-G3、G5-G8、G10、 G12、G15，其中在全球范圍內G6、G10和G8較流行，而我國GlO株流行廣泛。BCoV屬牛冠狀病毒科血清II群成員，病毒基因組為不分節段的單股正鏈RNA。 BCoV基因組5’端有帽子結構，3’端有poly (A)尾，中間包含約10個ORFs，編碼約8種蛋白。其中編碼的5種結構蛋白，分別為纖突蛋白(Spike protein, S)、膜蛋白(Membrane protein, Μ)、血凝素-酉旨酶(Hemagglutinin-esterase, HE)、小膜蛋白(Small membrane protein, SM或Ε)和核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein, N)。S蛋白是BCoV的主要保護性抗原，能誘導機體產生具有保護能力的中和抗體。在5種結構蛋白中，N蛋白保守性最高。目前，檢測BRV和BCoV常用的實驗室方法包括病毒分離法、電鏡觀察、ELISA等。 雖然敏感性和特異性較高，但費時費力；ELISA法雖然敏感性較高，但其缺點是當檢測樣品存在污染時特異性較差；而且上述方法通過一次試驗只能檢測一種病原，對這兩種病原的混合感染無法進行。隨著分子生物學的發展，核酸探針和RT-PCR也逐漸建立起來。RT-PCR 方法可以針對不同的靶序列進行快速、準確的診斷，在國內外得到了廣泛應用。

發明內容
本發明的目的之一在于提供一種利用牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因保守序列設計合成了 2對既能夠分別完成又同時完成檢測牛輪狀病毒與牛冠狀病毒分子檢測試劑。本發明的另一目的是提供了上述檢測試劑的制備方法。本發明的再一目的是利用上述分子檢測試劑建立能夠快速便捷、具有良好的特異性和敏感性及重復性、可分別或同時檢測牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的聯合RT-PCR檢測應用方法。本發明公開了一種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑，其特征在于包含能擴增牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因的2對特異性引物，其中一對是Pl和P2引物擴增牛輪狀病毒VP7基因片段，擴增長度為519 bp ；另一對P3和P4引物擴增牛冠狀病毒N基因片段，擴增長度為879 bp ；引物序列為
Pl <210>1 ； P2 <210>2 ； P3 <210>3 ； P4 <210>4。一種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑的制備方法，其特征在于主要包括以下步驟
(1 )、牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因保守序列的選擇從DNA序列數據庫中下載已經公布的牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因序列，分別用基因序列分析軟件進行序列比對，選擇兩個基因保守的靶序列，其中牛輪狀病毒VP7基因擴增的靶序列(519 bp)為<210>5 ；其中牛冠狀病毒N基因擴增的靶序列(879bp)為<210>6 ； (2)、特異性引物的設計及合成
根據上述選擇的牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因的靶序列，用PCR引物設計軟件分別進行引物的設計，將設計的引物進行最佳配對篩選試驗，得到2對最佳引物P1、 P2及P3、P4，用全自動DNA合成儀進行引物的合成，Pl和P2引物擴增牛輪狀病毒VP7基因片段，擴增長度為519 bp ;P3和P4引物擴增牛冠狀病毒N基因片段，擴增長度為879 bp, 所述引物序列為 Pl <210>1 ； P2 <210>2 ； P3 <210>3 ； P4 <210>4。一種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑的應用方法，其特征在于主要包括以下步驟
(1)、樣品的處理:
糞便樣品的處理，取腹瀉牛糞便，滅菌，離心，取離心液上清加入Eppendorf管中，置于冰上待用；
(2)、糞便樣品中RNA的提取；
(3)、聯合RT-PCR反應采用50μ PCR反應體系，反應體系的組成為10XPCR緩沖液5PL，25mmol/L MgCl2 5μ ,2. 5mmol/L dNTP 4μ ，Ρ1、Ρ2、Ρ3、和 Ρ4 (25pmol/^L)各 μ ，RT 產物 2 6 μ , Taq DNA聚合酶(5U/>L)0. 3μ ，補加去離子水至50 μ 。最佳循環參數均為96°C，150 s ；94°C, 40 s;72°C，80 s;52°C，50 s，最后 72°C延伸 IOmin ； (4)、結果判定
取聯合RT-PCR產物在瓊脂糖凝膠上，電泳，用溴化乙錠染色，然后在紫外光透射儀下觀察拍照，以標準 DNA marker (D, L-2000，標準分子大小 2000、1000、750、500、200、100)作參考，若電泳后，若瓊脂糖凝膠中同時出現2條核酸帶，其中一條片段大小約為519 bp，另一條片段大小約為879 bp，說明樣品中同時含有牛輪狀病毒與牛冠狀病毒；如果僅出現519 bp大小的核酸片段，則表明樣品中只含有牛輪狀病毒；如果僅出現879 bp大小的核酸片段，則表明樣品中只含有牛冠狀病毒；若不出現任何核酸片段，則表明樣品中不含有牛輪狀病毒與牛冠狀病毒。步驟(1)樣品的處理中具體步驟為取腹瀉牛糞便，加入IOmL離心管中，根據樣品的稀稠，加適量的滅菌的PBS，攪勻，然后12000r/min離心8min ；取離心液上清1 mL加入滅菌的1. 5mL的Eppendorf管中，置于冰上待用。步驟(2)糞便樣品中RNA的提取中具體步驟為取200 μ 處理好的糞便樣品溶液，加入200μ Trizol液，混勻；室溫放置5min，然后加入400μ 氯仿，蓋緊離心管，用手搖蕩離心管15秒；取上層水相于一新的離心管，按照1 :2體積比加入異丙醇，搖勻后冰凍 IOmin, 12000r/min離心IOmin ；棄去上清液，加入ΙΟΟμ 75%乙醇洗滌沉淀，然后小心棄去上清液，將沉淀在室溫下干燥5-lOmin ；加入20μ 無RNA酶的水，將總RNA溶于水中，-80°C 保存。步驟(3)糞便樣品中RNA的提取中具體還包括步驟為取6 yL糞便提取的總 RNA，力口入 5XRT buffer 4μ L,200U/y L SuperscriptTM II RNase !Γ Reverse Transcriptase 反轉錄酶 1 μ L，10 mmol/L dNTP 1 μ L,40 U/μ L RNA 酶抑制劑 1 μ L， 25pmol/yL P2和P4引物各1 μ L，用無RNA酶的三蒸水補足體積為20 yL，于42°C反應1 小時。步驟(4)結果判定中取10μ 1聯合RT-PCR產物在1. 5%瓊脂糖凝膠上，75V電泳1 小時，用溴化乙錠染色。本發明所述的快速檢測并鑒別牛輪狀病毒與牛冠狀病毒聯合RT-PCR檢測技術在實際應用中主要由以下步驟組成
1、篩選牛輪狀病毒VP7基因和牛冠狀病毒N基因擴增的靶序列；
2、用primerpremier 5. 0軟件分別設計VP7基因和N基因特異性引物；
3、引物的合成采用β-乙腈亞磷酸胺化學合成法，使用全自動DNA合成儀進行特異性引物的合成；
4、將合成的多對引物進行最佳配對篩選試驗，確定候選引物；、
5、先建立兩種病毒的單項RT-PCR，然后經過大量的RT-PCR條件優化，得到權利要求1 所述的特異性強、擴增效率高、不相互干擾的引物，并建立特異性強、敏感性高、重復性好的檢測牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的聯合RT-PCR技術。與現有技術相比，本發明的優點本發明建立的檢測牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的方法具有快速、特異性強、敏感性高、重復性好等優點。本發明通過聯合RT-PCR技術可以快速、有效地同時檢測BRV和BCoV，分別擴增出 519 bp和879 bp的目的條帶，與分別檢測兩種病毒的RT-RT-PCR方法相比，很大程度上降低了檢測成本和檢測時間，同時具有很好的特異性和敏感性，具有省時、省力的優點，可以應用于這兩種疾病的快速鑒別診斷和犢牛腹瀉流行病學調查工作中。


圖1為本發明實施例檢測結果示意圖，左邊為樣品中同時含有牛輪狀病毒和牛冠狀病毒檢測結果示意圖。右邊為樣品中含有牛輪狀病毒檢測結果示意圖，圖中所示M D, L-2000, Sl =Sample 1，S2 =Sample 2。圖2為本發明實施例檢測結果示意圖，左邊為樣品中含有牛冠狀病毒檢測結果示意圖。右邊為樣品中不含有牛輪狀病毒和牛冠狀病毒檢測結果示意圖，圖中所示M D, L-2000, S3 =Sample 3，S4=Sample 4。圖3為牛輪狀病毒與牛冠狀病毒性腹瀉二聯PCR檢測方法特異性試驗擴增結果示意圖。圖中所示M:DNA marker，BP DL-2000 (2000, 1000, 750, 500, 250, 100) ；1 3 為牛病毒性腹瀉病毒核酸樣品；4為PBS ；5、6為牛傳染性鼻氣管炎病毒核酸樣品；7、8為口蹄疫病毒核酸樣品；9為大腸桿菌核酸樣品；10為沙門氏桿菌核酸樣品。圖4為臨床糞便樣品中牛輪狀病毒和牛冠狀病毒二聯PCR擴增結果示意圖。圖中所示:M :DNA marker，即 DL-2000 (2000, 1000，750，500，250，100) ；1、2 6、9 為腹瀉牛糞便樣品中不含有牛輪狀病毒和牛冠狀病毒；7、8為腹瀉牛糞便樣品中含有牛冠狀病毒。圖5為臨床糞便樣品中牛輪狀病毒和牛冠狀病毒二聯PCR擴增結果示意圖。圖中所示M:DNA marker，即 DL_200(K2000，1000，750，500，250，100) ;1、2、4、5、10 為腹瀉牛糞便樣品中不含有牛冠狀病毒和牛輪狀病毒；3、6、10為腹瀉牛糞便樣品中含有牛冠狀病毒；8為腹瀉牛糞便樣品中同時含有牛輪狀病毒和牛冠狀病毒；9為腹瀉牛糞便樣品中含有牛輪狀病毒。
具體實施例方式實施例1
參照圖1 圖5。1、BRV VP7基因和BCoV N基因擴增靶序列的選擇
從GenBank中下載已經公布的BRV VP7基因(GenBank登錄號U14999，AB044293, EU835945, AF545859, AF039524, FJ206084, FJ206082, FJ206068, AB077054, AB077057, U01054, DQ487202)和 BCoV N 基因序列(GenBank 登錄號:M36656，DQ811784, AF058944, AF058942, U00735, AF220295, AB354579, EF424618, EF424617, EF424616, EF424620, DQ915164，AF391542，AF391541)，將其轉化為擴展名為.seq文件后，分別用DNAstar進行序列比對，選擇沒有發生基因變異、插入和缺失的保守序列，分別作為VP7基因和N基因擴增的靶序列。其中牛輪狀病毒VP7基因擴增的靶序列(519 bp)為<210>5;其中牛冠狀病毒 N基因擴增的靶序列(879bp)為:<210>6。
2、特異性引物的設計及合成
將篩選出的BRV VP7基因和BCoV N基因的靶序列分別輸入primer premier 5. O軟件程序中，分別設計兩種基因的特異性引物。VP7基因引物設計具體的要求為G+C含量為 45 55%，引物長度18 25 nt，Tm值70 80°C，擴增產物長度400 600 bp。N基因引物要求與VP7基因大致相同，但擴增產物長度控制在800 900 bp之間。將得到的引物序列進行引物之間的最佳配對篩選試驗，得到候選的引物對，采用β -乙腈亞磷酸胺化學合成法，用全自動DNA合成儀進行候選引物的合成。即Pl和Ρ2引物擴增牛輪狀病毒VP7基因片段，擴增長度為519 bp ；P3和P4引物擴增牛冠狀病毒N基因片段，擴增長度為879 bp, 所述引物序列為
Pl <210>1 ；P2 <210>2 ；P3 <210>3 ；P4 <210>4。3、BRV與BCoV標準毒株的培養及其基因組RNA的提取
3.1 BRV與BCoV標準毒株的培養
BRV NCDV株(RIT4237)用MA-104細胞培養。接種前，先用Hanks液洗MA-104細胞單層2次，然后每瓶接種經胰蛋白酶處理的病毒液WL。置37°C吸附1小時，棄去細胞瓶中毒液，每瓶加入IOPL維持掖(含胰蛋白酶0.5mg / μι)。置37°C靜止培養。當80%細胞出現病變(CPE)時，反復凍融3詞后收毒。將BCoV用HCT-8細胞培養，培養方法與BRV相同。3. 2 BRV與BCoV標準毒株基因組RNA的提取
采用Trizol法提取兩種病毒的總RNA。分別取細胞培養液200 μ ，加入200μ Trizol 液，混勻；室溫放置5min，然后加入400μ 氯仿，蓋緊離心管，用手搖蕩離心管15秒；取上層水相于一新的離心管，按照1 :2體積比加入異丙醇，搖勻后冰凍lOmin，12000r/min離心 IOmin ；棄去上清液，加入IOOPL 75%乙醇洗滌沉淀，然后小心棄去上清液，將沉淀在室溫下干燥5-10min ；加入20μ 無RNA酶的水，將總RNA溶于水中，_80°C保存。4、單項RT-PCR反應條件的確定
4.1 RT反應
RT采用20μ 反應體系。分別取2 μ L不同病毒提取的總RNA，加入5 X RT buffer 4yL, 200U/ μ L SuperscriptTM II RNase W Reverse Transcriptase 反轉錄酶 1 μ L, 10 mmol/ L dNTP 1 μ L，40 U/μ L RNA 酶抑制劑 1 μ L, 25pmol/μ L Ρ2 或 Ρ4 弓丨物 1 μ L，用無 RNA 酶的三蒸水補足體積為20 μ L，于42°C反應1小時。4.2 PCR 反應
PCR采用50μ 反應體系。PCR反應體系的組成為10\ 0 緩沖液5口1^，25讓01/1 MgCl2 4 μ , 2. 5mmol/L dNTP 4 μ ，PI、P2 或 P3、P4 (25 pmol/^L)各 μ ，BRV 或 BCoV 反轉錄產物2PL，Taq plus DNA聚合酶(5U/^L) 0. 3μ ，補加去離子水至50μ 。循環參數為96°C， 150 s;94°C，40 s; 52°C，50 s;72°C，80 s ；最后 72°C延伸 lOmin。5、聯合RT-PCR的建立及條件的優化
5.1 聯合RT-PCR的建立
采用50μ RT-PCR反應體系。RT-PCR反應體系的組成為10XPCR緩沖液5 PL，25mmol/ L MgCl2 5 μ , 2. 5mmol/L dNTP 4μ ，Ρ1、Ρ2、Ρ3、Ρ4 (25pmol/^L)各 μ ，BRV 和 BCoV 基因組反轉錄產物各2PL，Taq plus DNA聚合酶(5U/^L) 0. 3μ ，補加去離子水至50 μ 。循環參數為96°C，150 s ；94°C,40 s ； ；52°C，60 s;72°C，80 s ；最后 72°C延伸 lOmin。5.2聯合RT-PCR擴增條件優化
以BRV或BCoV反轉錄產物為模板，在聯合RT-RT-PCR中對VP7基因和N基因各自的引物量進行優化。實驗分兩步進行第一步，先測定VP7基因單項RT-PCR的最佳引物量；第二步，在聯合RT-PCR反應體系中分別加入BRV VP7基因最佳引物量及不同濃度的BCoV N基因引物，進行聯合RT-PCR，以篩選出VP7-N基因聯合RT-PCR反應體系中VP7和N基因引物的最佳工作濃度和擴增模式。6、聯合RT-PCR特異性和敏感性試驗
將牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、口蹄疫病毒、大腸桿菌、沙門氏桿菌培養物的核酸樣品和PBS作為RT-PCR模板，置于上述VP7-N基因聯合RT-PCR擴增系統中進行擴增，觀察并記錄試驗結果。與此同時，用DNA回收試劑盒回收RT-PCR產物，對PCR產物進行測序，以驗證擴增的特異性。將BRV或BCoV的細胞培養物分別在MA-104和HCT-8傳代細胞測定病毒液TCID5tl，并將兩種病毒液混合，然后進行KT1 10_1(1稀釋倍數稀釋，分別提取不同稀釋度的病毒混合液的總RNA，并加入VP7-N基因聯合RT-PCR反應體系中進行擴增，以檢測其敏感性。7、聯合RT-PCR穩定性和重復性試驗
將已測定過TCID5tl的BRV和BCoV混勻，提取病毒混合液的總RNA，分為6管，按照上述優化過的反應條件做6個平行的反應，并重復6次，來測定聯合RT-PCR反應的穩定性和重復性。8、聯合RT-PCR產物的檢測
取10 μ L聯合RT-PCR產物在1. 5%瓊脂糖凝膠上，75V電泳1小時，用溴化乙錠染色，然后在紫外光透射儀下觀察拍照，以標準DNA marker (D, L-2000 :2000，1000，750，500，250， 100)作參考，記錄并分析結果。若電泳后，若瓊脂糖凝膠中同時出現2條核酸帶，其中一條片段大小約為519 bp，另一條片段大小約為879 bp，說明樣品中同時含有牛輪狀病毒與牛冠狀病毒(圖1中左圖)；如果僅出現519 bp大小的核酸片段，則表明樣品中只含有牛輪狀病毒(圖1中的右圖)；如果僅出現879 bp大小的核酸片段，則表明樣品中只含有牛冠狀病毒(圖2中的左圖);若不出現任何核酸片段(圖2中的右圖)，則表明樣品中不含有牛輪狀病毒與牛冠狀病毒。實施例2
與實施例1相比，本實施例的不同之處在于 1、聯合RT-PCR試劑標準化
根據上述試驗結果，按照反應條件優化，對RT和PCR試劑進行標準化。1. 1 RT反應標準化試劑組成為
成分用量5XRTBuffer2. Ομ RNase-freedistiIledwater4. Ομ dNTPMixture (10mmol/L)2. Ομ RNaseInhibitor (401Ι/μ1)1. Ομ ReverseTranscriptase (2001Ι/μ )1. Ομ Ρ2 (20pmolM)1. Ομ Ρ4 (20pmolM)1. Ομ
權利要求
1.一種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑，其特征在于包含能擴增牛輪狀病毒VP7 基因與牛冠狀病毒N基因的2對特異性引物，其中一對是Pl和P2引物擴增牛輪狀病毒 VP7基因片段，擴增長度為519 bp ；另一對P3和P4引物擴增牛冠狀病毒N基因片段，擴增長度為879 bp ；引物序列為Pl <210>1 ； P2 <210>2 ； P3 <210>3 ； P4 <210>4。
2.一種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑的制備方法，其特征在于主要包括以下步驟(1 )、牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因保守序列的選擇從DNA序列數據庫中下載已經公布的牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因序列，分別用基因序列分析軟件進行序列比對，選擇兩個基因保守的靶序列，其中牛輪狀病毒VP7基因擴增的靶序列(519 bp)為<210>5 ；其中牛冠狀病毒N基因擴增的靶序列(879bp)為<210>6 ； (2)、特異性引物的設計及合成根據上述選擇的牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因的靶序列，用PCR引物設計軟件分別進行引物的設計，將設計的引物進行最佳配對篩選試驗，得到2對最佳引物P1、 P2及P3、P4，用全自動DNA合成儀進行引物的合成，Pl和P2引物擴增牛輪狀病毒VP7基因片段，擴增長度為519 bp ;P3和P4引物擴增牛冠狀病毒N基因片段，擴增長度為879 bp, 所述引物序列為 Pl <210>1 ； P2 <210>2 ； P3 <210>3 ； P4 <210>4。
3.一種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑的應用方法，其特征在于主要包括以下步驟(1)、樣品的處理:糞便樣品的處理，取腹瀉牛糞便，滅菌，離心，取離心液上清加入Eppendorf管中，置于冰上待用；(2)、糞便樣品中RNA的提取；(3)、聯合RT-PCR反應采用50μ PCR反應體系，反應體系的組成為10XPCR緩沖液5PL，25mmol/L MgCl2 5μ ,2. 5mmol/L dNTP 4μ ，Ρ1、Ρ2、Ρ3、和 Ρ4 (25pmol/^L)各 μ ，RT 產物 2 6 μ , Taq DNA聚合酶(5U/>L)0. 3μ ，補加去離子水至50 μ ，最佳循環參數均為96°C，150 s ；94°C，40 s ；72°C，80 s ；52°C，50 s，最后 72°C延伸 IOmin ；(4)、結果判定取聯合RT-PCR產物在瓊脂糖凝膠上，電泳，用溴化乙錠染色，然后在紫外光透射儀下觀察拍照，以標準 DNA marker (D, L-2000，標準分子大小 2000、1000、750、500、200、100)作參考，若電泳后，若瓊脂糖凝膠中同時出現2條核酸帶，其中一條片段大小約為519 bp，另一條片段大小約為879 bp，說明樣品中同時含有牛輪狀病毒與牛冠狀病毒；如果僅出現519 bp大小的核酸片段，則表明樣品中只含有牛輪狀病毒；如果僅出現879 bp大小的核酸片段，則表明樣品中只含有牛冠狀病毒；若不出現任何核酸片段，則表明樣品中不含有牛輪狀病毒與牛冠狀病毒。
4.如權利要求3所述的種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑的應用方法，其特征在于步驟(1)樣品的處理中具體步驟為取腹瀉牛糞便，加入IOmL離心管中，根據樣品的稀稠，加適量的滅菌的PBS，攪勻，然后12000r/min離心8min ；取離心液上清1 mL加入滅菌的 1. 5mL的Eppendorf管中，置于冰上待用。
5.如權利要求3或4所述的種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑的應用方法，其特征在于步驟(2)糞便樣品中RNA的提取中具體步驟為取200 μ 處理好的糞便樣品溶液， 加入200μ Trizol液，混勻；室溫放置5min，然后加入400μ 氯仿，蓋緊離心管，用手搖蕩離心管15秒；取上層水相于一新的離心管，按照1 :2體積比加入異丙醇，搖勻后冰凍lOmin， 12000r/min離心IOmin ；棄去上清液，加入ΙΟΟμ 75%乙醇洗滌沉淀，然后小心棄去上清液，將沉淀在室溫下干燥5-lOmin ；加入20μ 無RNA酶的水，將總RNA溶于水中，_80°C保存。
6.如權利要求3所述的種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑的應用方法，其特征在于步驟(3)糞便樣品中RNA的提取中具體還包括步驟為取6 μ L糞便提取的總RNA，加入 5 X RT buffer 4 μ L, 200U/ μ L SuperscriptTM II RNase !Γ Reverse Transcriptase 反轉錄酶 1 μ L, 10 mmol/L dNTP 1 μ L,40 U/μ L RNA 酶抑制齊[J 1 μ L, 25pmol/y L P2 禾口 P4 弓 | 物各1 μ L，用無RNA酶的三蒸水補足體積為20 μ L，于42°C反應1小時。
7.如權利要求5所述的種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑的應用方法，其特征在于步驟(3)糞便樣品中RNA的提取中具體還包括步驟為取6 μ L糞便提取的總RNA，加入 5XRT buffer 4μ L,200U/y L SuperscriptTM II RNase !Γ Reverse Transcriptase反轉錄酶 1 μ L, 10 mmol/L dNTP 1 μ L,40 U/μ L RNA 酶抑制齊[J 1 μ L, 25pmol/y L P2 禾口 P4 弓 | 物各1 μ L，用無RNA酶的三蒸水補足體積為20 μ L，于42°C反應1小時。
8.如權利要求3所述的種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑的應用方法，其特征在于步驟(4)結果判定中取10 μ 1聯合RT-PCR產物在1. 5%瓊脂糖凝膠上，75V電泳1小時， 用溴化乙錠染色。
9.如權利要求5所述的種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑的應用方法，其特征在于步驟(4)結果判定中取10 μ 1聯合RT-PCR產物在1. 5%瓊脂糖凝膠上，75V電泳1小時， 用溴化乙錠染色。
10.如權利要求7所述的種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑的應用方法，其特征在于步驟(4)結果判定中取10 μ 1聯合RT-PCR產物在1. 5%瓊脂糖凝膠上，75V電泳1小時，用溴化乙錠染色。
全文摘要
本發明公開了一種牛輪狀病毒與牛冠狀病毒的檢測試劑，包含能擴增牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因的2對特異性引物；又公開了制備方法，包括以下步驟牛輪狀病毒VP7基因與牛冠狀病毒N基因保守序列的選擇；特異性引物的設計及合成。還公開了其應用方法，包括樣品的處理；糞便樣品中RNA的提取；聯合RT-PCR反應；結果判定。本發明通過聯合RT-PCR技術可以快速、有效地同時檢測BRV和BCoV，很大程度上降低了檢測成本和檢測時間，同時具有很好的特異性和敏感性，具有省時、省力的優點。
文檔編號C12Q1/70GK102367491SQ20111035942
公開日2012年3月7日 申請日期2011年11月14日 優先權日2011年11月14日
發明者喬軍, 孟慶玲, 張再超, 楊麗紅, 王為升, 王俊偉, 田振中, 蔡擴軍, 陳創夫 申請人:石河子大學