專利名稱：一種利用pcr-rflp技術(shù)鑒別西花薊馬品系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用PCR-RFLP技術(shù)鑒別西花薊馬品系的方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)，其屬于纓翅目(Thysanoptera)薊馬科(Thripidae)花薊馬屬(Frankliniella)，最初起源于美國西部，20世紀80年代開始迅速擴散至全球各大洲，目前已在69個國家和地區(qū)有報道，是當今世上對作物危害最嚴重的世界性害蟲之一(Kirk，2001 ;Kirk and Terry，2003)。該害蟲不僅取食寄主植物汁液，在果實表明形成傷痕，降低果品質(zhì)量，而且能以持久性的方式傳播番茄斑萎病毒病(TSWV)和鳳仙花壞死斑病毒(INSV) (Kritzman A，2002)。并且，傳播的病毒所造成的經(jīng)濟損失遠遠大于其本身所造成的損失。我國農(nóng)業(yè)部于1996年將其列為進境地植物檢疫潛在性害蟲。Brunner等Q010)基于mtCOI基因序列發(fā)現(xiàn)世界各地西花薊馬種群存在2個遺傳支系，并建議將這2個遺傳支系定義為2個生態(tài)型(ecotypes)，而Rugman-Jones等Q010) 建議將其定義為2個種。為了論述方便，本專利文件中分別將其稱為G型和L型。資料表明，G型和L型西花薊馬在產(chǎn)卵量、寄主適應性、生境適應性、抗藥性等生物學方面存在差異 (deKogel et al.，1997 ；Brdsgaard,1994 ；Brunner et al.，2010 ；Rugman-Jones et al.， 2010)。因此準確區(qū)分兩種類型，對于進一步研究其入侵機制和生物學具有重要的理論意義與參考價值。目前，兩種類型西花薊馬從形態(tài)學上無法明確的區(qū)分，僅可以從分子遺傳學角度區(qū)分。Rugman-Jones等OOIO)基于rDNA 28s設(shè)計了一組引物，通過PCR擴增，檢測PCR 產(chǎn)物的多態(tài)性來區(qū)分兩種類型。此方法區(qū)分了美國原產(chǎn)地兩種類型的西花薊馬。PCR-RFLP (限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應)技術(shù)，又稱為CAPS技術(shù) (Cleaved Amplilfed Polymorphism kquences)，它實質(zhì)上是 PCR 技術(shù)與 RFLP 技術(shù)結(jié)合的一種方法。它的基本原理是先利用已知位點的DNA序列資源(基因數(shù)據(jù)庫、基因組或cDNA 克隆及克隆的RAPD條帶等)設(shè)計一套特異性的PCR引物(19 27bp)，然后用這些引物擴增該位點上的某一 DNA片段，接著用一種專一性的限制性內(nèi)切酶切割所得擴增產(chǎn)物，凝膠電泳分離酶切片段，染色并進行RFLP分析。該技術(shù)揭示的是特異PCR片段的限制性長度變異的信息。PCR-RFLP是一類共顯性分子標記，其優(yōu)點是避免了 RFLP分析中膜轉(zhuǎn)印這一步驟，又能保持RFLP分析的精確度-能夠揭示單個堿基的差異。另外，由于很多限制性內(nèi)切酶均可與DNA擴增片段酶切，所以檢測到多態(tài)性機會較大(趙淑清，2000)。PCR-RFLP技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于植物、動物、微生物以及昆蟲的物種檢測與鑒定、遺傳分化鑒定等方面(王孝宣，2003 ；張婷，2005 ；馬玉紅，2006 ；滕齊輝，2006)。利用該技術(shù)已區(qū)分和鑒定出了西花薊馬、美棘薊馬、煙薊馬和棕櫚薊馬等物種(MoritZ，2000 ；Brunner, 2002 ；Toda and Komazaki，2002)。PCR-RFLP技術(shù)同樣適用于物種以下介元的區(qū)分。周建峰等Q003)運用PCR-RFLP方法分析了 3個亞種線粒體DNA的DNA5/6區(qū)段，利用3種內(nèi)切酶，區(qū)分了 3個鯉魚亞種。但利用PCR-RFLP技術(shù)構(gòu)建區(qū)分西花薊馬兩個品系的方法目前還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用PCR-RFLP技術(shù)鑒別西花薊馬品系的方法。術(shù)語解釋G型西花薊馬目前將組成西花薊馬入侵種主體的西花薊馬品系稱為溫室系 (greenhouse strain)，本專利文件中稱其為G型西花薊馬。L型西花薊馬因該品系最早發(fā)現(xiàn)與新西蘭的羽扇豆上，并表現(xiàn)出與溫室系差異明顯的生物學特性，故將其稱為羽扇豆系(lupin strain)，本專利文件中稱其為L型西花薊馬。一種利用PCR-RFLP技術(shù)鑒別西花薊馬品系的方法，步驟如下(1)提取西花薊馬基因組DNA;(2)以西花薊馬基因組DNA為模板對其線粒體COI基因進行PCR擴增；PCR體系中，引物序列如下正義引物5，GGATCACCTGATATAGCATTCCC3，；SEQID NO. 1反義引物5，ACTGTAAATATATGATGAGCTCA3，；SEQID NO. 2(3)對步驟⑵制得的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EarI酶切，得酶切產(chǎn)物；(4)對步驟(3)制得的酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，當PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品有兩條不同長度的條帶時，則該被檢測樣品為L型西花薊馬；當PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品有一條條帶時，則為G型西花薊馬。所述PCR擴增體系為基因組DNA 2μ 1，20μΜ 引物 0·4μ l，5U/y 1 Taq 酶 0·2μ l，10XTaq Buffer 5 μ 1,IOmM dNTP 0· 4 μ 1，ddH20 補至 20 μ 1 ；所述PCR 擴增條件如下94°C，5min ；進行；35 個循環(huán)的 94°C 50sec,53°C 40sec, 72°C 50sec ；72°C延伸 7min ；4°C，保溫。所述步驟(3)中EarI酶切反應條件如下37°C，2hr0上述步驟(1)可參照(Frohlich，D.R.，I. Torres-Jerez, I. D. Bedford, P. G. Markham, and J.K. Brown. 1999. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers.Mol.Ecol.8 1683-1691.)中的方法進行操作。有益效果1、本發(fā)明所述的限制性內(nèi)切酶為常用的限制性內(nèi)切酶，為篩選兩種類型西花薊馬提供了簡便穩(wěn)定的酶切標記。2、本發(fā)明所述的PCR引物用于擴增西花薊馬線粒體COI基因，為鑒定西花薊馬，提供了簡便穩(wěn)定的分子標記，解決了區(qū)分兩種類型西花薊馬的關(guān)鍵技術(shù)。3、本發(fā)明從分子水平探索了兩種類型西花薊馬線粒體COI基因的不同，探索建立了兩種類型西花薊馬的鑒別技術(shù)，為今后的兩種類型西花薊馬的種群動態(tài)鑒定、生物學以及入侵機制的研究奠定了基礎(chǔ)。


圖1是PCR產(chǎn)物經(jīng)EarI酶切后的電泳圖；其中1，未酶切的G型西花薊馬PCR產(chǎn)物；2_5，EarI內(nèi)切酶酶切G型西花薊馬PCR 產(chǎn)物；6-8，EarI內(nèi)切酶酶切L型西花薊馬的PCR產(chǎn)物，M, IOObp DNAMarker0
具體實施例方式下面結(jié)合實例及附圖對本發(fā)明的內(nèi)容做進一步的說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。 實施例中所述G型西花薊馬于2011年采集于山東省，L型西花薊馬于2011年分別采集于山東省青島市、威海市區(qū)以及榮成市；EarI內(nèi)切酶購自New England Biolabs(NEB) 公司。實施例1西花薊馬樣品材料的分析(1)西花薊馬基因組DNA的提取將單頭薊馬個體置于含60μ 1堿裂解液的0.2ml的離心管中，堿裂解液為 50mmol · I^1Tris-HCl (pH8. 0)、20mmol · L-1NaClUmmol · L-1EDTAU % SDS，用封口槍頭充分研磨勻漿后，置于水浴鍋65°C水浴15min，然后在95°C水浴IOmin后，制得西花薊馬基因組 DNA溶液。(2)西花薊馬COI基因的PCR擴增以西花薊馬基因組DNA為模板對其COI基因進行PCR擴增，得PCR產(chǎn)物；所述PCR擴增體系為基因組DNA :3μ 1 ；20 μ M 弓丨物0. 5μ 1 ； 5U/y 1 Taq 酶0· 5μ 1 ； 10 X Taq Buffer 5μ 1 ；IOmM dNTP 1 μ 1 ；ddH20 補至 50 μ 1 ；擴增引物序列如下正義引物5，GGATCACCTGATATAGCATTCCC3，；SEQID NO. 1反義引物5，ACTGTAAATATATGATGAGCTCA3，；SEQID NO. 2PCR 擴增條件如下94 "C，5min ；進行；35 個循環(huán)的 94 "C 50sec, 53 "C 40sec, 72°C 50sec ；72°C延伸 7min ；4°C保溫。(3) PCR產(chǎn)物用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，若檢測有條帶且長度均在620bp左右，將 PCR產(chǎn)物進行雙向測序，得到序列如SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4所示。(4)利用限制性內(nèi)切酶酶切位點分析軟件WatCut (該分析軟件可登陸如下網(wǎng)址使用 http//watcut. uwaterloo. ca/watcut/watcut/template, php ？ act = restriction ΠΜ)，分析可得在片段179bp處兩種類型西花薊馬有堿基差異，并且發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶 EarI (CTCTTC)。經(jīng)比對分析，采集于山東省青島市、威海市區(qū)以及榮成市的L型西花薊馬具有SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列，采集于山東省的G型西花薊馬具有SEQ ID N0. 4所示核苷酸序列。
實施例2一種利用PCR-RFLP技術(shù)鑒別西花薊馬品系的方法，步驟如下(1)西花薊馬基因組DNA的提取將單頭薊馬個體置于含60μ 1堿裂解液的0.2ml的離心管中，堿裂解液為 50mmol · I^1Tris-HCl (pH8. 0)、20mmol · L-1NaClUmmol · L-1EDTAU % SDS，用封口槍頭充分研磨勻漿后，置于水浴鍋65°C水浴15min，然后在95°C水浴IOmin后，制得西花薊馬基因組 DNA溶液。(2)西花薊馬COI基因的PCR擴增以西花薊馬基因組DNA為模板對其COI基因進行PCR擴增，得PCR產(chǎn)物；所述PCR擴增體系為基因組DNA 2 μ 1，20 μ M 弓I 物 0.4 μ 1，5U/μ ITaq 酶 0.2 μ 1，IOXTaq Buffer 2μ 1，IOmM dNTP 0· 4 μ 1，ddH20 補至 20 μ 1 ；擴增引物序列如下正義引物5，GGATCACCTGATATAGCATTCCC3，；SEQID NO. 1反義引物5，ACTGTAAATATATGATGAGCTCA3，；SEQID NO. 2PCR 擴增條件如下94 "C，5min ；進行；35 個循環(huán)的 94 "C 50sec, 53 "C 40sec, 72°C 50sec ；72°C延伸 7min ；4°C保溫。(3) PCR產(chǎn)物進行EarI酶切酶切體系如下10 X NEB緩沖液2μ 1 ；PCR產(chǎn)物5μ 1 ；EarI內(nèi)切酶0. 5μ 1 ；滅菌雙蒸水至15 μ 1。反應條件如下37°C溫育2小時。經(jīng)限制性內(nèi)切酶EarI酶切后，得酶切產(chǎn)物；(4)將酶切產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后在紫外凝膠成像儀上成像，觀察其多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L型西花薊馬的COI片段被切開，而G型西花薊馬的COI片段沒有被切開。結(jié)果如圖1所示。
權(quán)利要求
1.一種利用PCR-RFLP技術(shù)鑒別西花薊馬品系的方法，其特征在于，步驟如下(1)提取西花薊馬基因組DNA;(2)以西花薊馬基因組DNA為模板對其線粒體COI基因進行PCR擴增； PCR體系中，引物序列如下正義引物5，GGATCACCTGATATAGCATTCCC3，；SEQ ID NO. 1 反義引物5’ ACTGTAAATATATGATGAGCTCA3，；SEQ ID NO. 2(3)對步驟(2)制得的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EarI酶切，得酶切產(chǎn)物；(4)對步驟C3)制得的酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，當PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品有兩條不同長度的條帶時，則該被檢測樣品為L型西花薊馬；當PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品有一條條帶時，則為G型西花薊馬。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增體系為基因組 DNA 2 μ 1，20 μ M 引物 0.4 μ 1，5υ/μ 1 Taq 酶 0· 2 μ 1，IOXTaq Buffer 5μ 1， IOmMdNTP 0. 4 μ 1，ddH20 補至 20 μ 1。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增條件如下94°C，5min；進行35 個循環(huán)的 94°C 50sec，53°C 40sec，72°C 50sec ；72°C延伸 7min ；4°C，保溫。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中EarI酶切反應條件如下 37°C，2hr。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用PCR-RFLP技術(shù)鑒別西花薊馬品系的方法，步驟如下(1)提取西花薊馬基因組DNA；(2)以西花薊馬基因組DNA為模板對其線粒體COI基因進行PCR擴增；(3)對步驟(2)制得的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EarI酶切，得酶切產(chǎn)物；(4)對步驟(3)制得的酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。本發(fā)明所述的限制性內(nèi)切酶為常用的限制性內(nèi)切酶，為篩選兩種類型西花薊馬提供了簡便穩(wěn)定的酶切標記，同時探索建立了兩種類型西花薊馬的鑒別技術(shù)，為今后的兩種類型西花薊馬的種群動態(tài)鑒定、生物學以及入侵機制的研究奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/68GK102392075SQ20111036609
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者于毅, 國棟, 張安盛, 段惠生, 褚棟 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所