專利名稱：松弛素野生型和突變體的制備方法及其所制備的松弛素野生型和突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域的人類卵巢松弛素，特別涉及一種具有多重用途的松弛素類化合物或者是野生型和突變體的制備方法以及用途。
背景技術(shù)：
眾所周知，成熟的人類卵巢松弛素是一個大約6000道爾頓的，具有懷孕的荷爾蒙松弛重要作用的肽激素。H2松弛素可促進生殖道分娩過程，包括子宮頸成熟，增厚的子宮內(nèi)膜，增加懷孕期的血管，以及對膠原合成有影響。人松弛素主要作用于分娩前生殖道重塑，從而促進產(chǎn)程。在懷孕和分娩的過程中，它調(diào)節(jié)蛋白在靶器官的結(jié)締組織中重組，以獲得的器官結(jié)構(gòu)的必要變化。同時它還對包括早產(chǎn)和分娩時宮頸成熟有抑制作用。目前雖然主要是一個懷孕的激素，但是，松弛素也發(fā)現(xiàn)了在非懷孕女性以及男性、同時發(fā)現(xiàn)它對心血管和其他器官組織有重要功能。例如(I) H2松弛素還與哺乳有關(guān)，有松弛乳腺組織的功能；(2)增強人類精子的流動性；(3)鑒于對結(jié)締組織松弛作用，它已被認為可以改善松弛的皮膚彈性；(4)降血壓和抗心功能衰竭等。當然，近年來研究發(fā)現(xiàn)重組人松弛素對心衰和高血壓有很好的治療作用，特別是它只對升高的血壓部分有抑制作用，卻不會像其他抗高血壓化合物一樣可降低正常血壓而導(dǎo)致低血壓。而人松弛素擴血管的作用機理包括(I)人松弛素可激活人松弛素受體I和2，導(dǎo)致細胞內(nèi)cAMP水平升高⑵；誘導(dǎo)N0SII/III，作為NO，cGMP的調(diào)節(jié)劑；(3)上調(diào)內(nèi)皮細胞的內(nèi)皮素β受體水平；(4)下調(diào)與炎癥相關(guān)的細胞因子的水平，例如TNF_a ,TGF-β。人松弛素屬胰島素樣生長因子家族。與胰島素相同，松弛素由兩個肽鏈A鏈和B鏈組成，A鏈和B鏈由兩個鏈間二硫鍵相連，并在A鏈形成鏈內(nèi)二硫鍵環(huán)。人松弛素Hl和H2顯示出相當?shù)暮塑账岷桶被嵝蛄型葱裕欢灿幸恍╋@著的差異序列，特別是在A和B鏈的氨基末端區(qū)域。松弛素的結(jié)構(gòu)在進化過程中在種間分歧相當明顯只有40%至48%的氨基酸序列同源性存在于豬，老鼠，鯊魚和人類之中。人松弛素(H2)主要由一種松弛素前體而生成。松弛素前體包括25個氨基酸的信號肽，約29-33個氨基酸的B肽鏈，104-107個氨基酸的C肽鏈，以及一個24個氨基酸的A肽鏈。在松弛素的生物合成過程中，信號肽和C肽鏈被刪除形成成熟的松弛素。C肽鏈的功能現(xiàn)還不完全理解，猜測與B肽鏈和A肽鏈正確鏈折疊之間的二硫鍵形成相關(guān)。生物合成松弛素是最初由胎盤細胞的核糖體合成前松弛素原。前松弛素原是一種線性分子，由的信號肽，一個B鏈，I個C肽鏈和一個A鏈組成。當運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時，信號肽從前松弛素原裂解出來的產(chǎn)生松弛素原。松弛素原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵，從而形成一個三維結(jié)構(gòu)。松弛素原經(jīng)相關(guān)激素原轉(zhuǎn)化酶裂解切割C肽鏈，產(chǎn)生成熟松弛素。
如圖I所示為人松弛素前體示意圖。人松弛素前體包括24個氨基酸的信號肽，約29-33個氨基酸的B肽鏈，104-108個氨基酸的C肽鏈，以及一個24個氨基酸的A肽鏈。激素原轉(zhuǎn)化酶裂解位點為箭頭所示。
如圖2所示為成熟人松弛素示意圖。人松弛素包括約29-33個氨基酸的B肽鏈，一個24個氨基酸的A肽鏈及三個二硫鍵。A鏈第10和15位半胱氨酸間形成鏈內(nèi)二硫鍵，B鏈第11位與A鏈第11位半胱氨酸間形成鏈間二硫鍵，B鏈第23位與A鏈第24位半胱氨酸間形成鏈間二硫鍵。然而，正是因為我們清楚地了解了人松弛素的重要功能作用，其具體到結(jié)構(gòu)組成以及作用機理，因此，我們迫切的需要將這一重大發(fā)現(xiàn)通過人類的智慧而轉(zhuǎn)換為對人類自身有益的發(fā)明。因此，針對目前人松弛素在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的零發(fā)明利用，一種新的可以在提供良好的性能的松弛素類化合物或者是野生型和突變體的制備方法以及用途的發(fā)明勢在必行
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是突破人松弛素在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的零發(fā)明利用，提供一種利用基因工程手段制備重組人松弛素野生型和突變體的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種利用基因工程手段制備重組人松弛素野生型和突變體的方法，其包括以下步驟(I)設(shè)計并合成重組人松弛素野生型和突變體的酵母所喜愛的氨基酸密碼子基因序列；(2)設(shè)計重組野生型和突變體人松弛素前體的氨基酸序列；(3)構(gòu)建人松弛素野生型和突變體的分泌型重組酵母表達載體；(4)重組野生型和松弛素突變體的分泌表達；即一種細胞松弛素野生型和突變體的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟設(shè)計并合成重組人松弛素野生型和突變體的酵母所喜愛的氨基酸密碼子基因序列；設(shè)計重組野生型和突變體人松弛素前體的氨基酸序列；構(gòu)建人松弛素野生型和突變體的分泌型重組酵母表達載體；重組野生型和松弛素突變體的分泌表達。所述構(gòu)建人松弛素野生型和突變體的分泌型重組酵母表達載體通過巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)，并利用經(jīng)過改造的分泌型表達載體，對人松弛素突變體進行高效表達。所述設(shè)計并合成重組人松弛素野生型和突變體的酵母所喜愛的氨基酸密碼子基因序列根據(jù)酵母所喜愛的氨基酸密碼子構(gòu)成，包括N端組氨酸肽鏈為純化用以及內(nèi)在3個蛋白酶切位點為切除N端組氨酸肽鏈和C肽鏈用，24個氨基酸的A肽鏈，29個氨基酸的B肽鏈，12個氨基酸的C肽鏈。且突變體序列中A肽鏈含5個突變點，B肽鏈含I個突變點。所述重組人松弛素野生型和突變體表達載體被轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母中進行誘導(dǎo)表達，其過程包括0. 5%甲醇被用于誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)24，48，72和96小時后，分別取培養(yǎng)液上清。一種細胞松弛素突變體的制備方法，還包括如下步驟重組人松弛素野生型和突變體的切割，分離和純化；重組人松弛素野生型和突變體的結(jié)構(gòu)確定，以及；重組人松弛素野生型和突變體的活性鑒定。所述重組人松弛素野生型和突變體前體用Ni-NTA親和層析純化；純化的重組人松弛素野生型和突變體前體經(jīng)過蛋白酶切除N端組氨酸肽鏈和C肽鏈形成成熟的重組人松弛素野生型和突變體；成熟的重組人松弛素野生型和突變體經(jīng)凝膠過濾層析分離純化。所述本發(fā)明的人松弛素突變體的氨基酸序列中A肽鏈包括5個突變點，B肽鏈包括I個突變點，以及，僅含12個氨基酸的C肽鏈。所述本發(fā)明的野生型和突變體人松弛素前體氨基酸序列，其包括N端6個組氨酸肽鏈為純化用；三個凝血酶原蛋白酶切位點甘氨酸-精氨酸-甘氨酸，分別在N端6個組氨酸肽鏈與B肽鏈連接外B，肽鏈與C肽鏈連接處，和C肽鏈與A肽鏈連接處；含12個氨基酸的C肽鏈為連接肽鏈；29個氨基酸的B肽鏈；以及一個24個氨基酸的A肽鏈。所述兩種松弛素前體均包括三個凝血酶原蛋白酶切位點甘氨酸-精氨酸-甘氨酸，分別在N端6個組氨酸肽鏈與B肽鏈連接處B，肽鏈與C肽鏈連接處，和C肽鏈與A肽鏈連接處。
所述兩種松弛素前體經(jīng)凝血酶原蛋白酶切割形成成熟的野生型和突變體松弛素；切割后，在B鏈的氨基端將有一個附加的甘氨酸，羧基端將有附加的甘氨酸-精氨酸；在A鏈的氨基端將有一個附加的甘氨酸。所述本發(fā)明強調(diào)以下任何一種或多種突變的位點B肽鏈第5位谷氨酸，A肽鏈第1，2，3，4和23位的谷氨酰胺，亮氨酸，酪氨酸，絲氨酸和脯氨酸。所述本發(fā)明所描述的突變體松弛素包含以上所示6個位點中任何一個或任何多個位點突變成任何一種氨基酸的所有突變體松弛素的總和。所述B肽鏈第5位突變?yōu)樘於彼幔珹肽鏈第I，2，3，4和23突變?yōu)楣劝彼幔惲涟彼幔z氨酸，酪氨酸和纈氨酸。所述的松弛素野生型和突變體的制備方法所制備的松弛素野生型和突變體，其所述構(gòu)建人松弛素野生型和突變體的分泌型重組酵母表達載體通過巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)，并利用經(jīng)過改造的分泌型表達載體，對人松弛素野生型和突變體進行高效表達。所制備的松弛素野生型和突變體，其所述設(shè)計并合成重組人松弛素野生型和突變體的酵母所喜愛的氨基酸密碼子基因序列根據(jù)酵母所喜愛的氨基酸密碼子構(gòu)成，包括N端組氨酸肽鏈為純化用以及內(nèi)在3個蛋白酶切位點為切除N端組氨酸肽鏈和C肽鏈用，24個氨基酸的A肽鏈，29個氨基酸的B肽鏈，和12個氨基酸的C肽鏈。且人松弛素突變體序列中含包括5個突變點的A肽鏈，I個突變點的B肽鏈。所制備的松弛素野生型和突變體，其所述重組人松弛素野生型和突變體表達載體被轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母中進行誘導(dǎo)表達，其過程包括0. 5%甲醇被用于誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)24，48，72和96小時后，分別取培養(yǎng)液上清收集表達的重組蛋白。所制備的松弛素野生型和突變體，其所述重組人松弛素野生型和突變體前體用Ni-NTA親和層析純化；純化的重組人松弛素野生型和突變體前體經(jīng)過蛋白酶切除N端組氨酸肽鏈和C肽鏈形成成熟的重組人松弛素野生型和突變體；成熟的重組人松弛素野生型和突變體經(jīng)凝膠過濾層析分離純化。所制備的松弛素野生型和突變體，所述本發(fā)明的人松弛素突變體的氨基酸序列中A肽鏈包括6個突變點，B肽鏈包括4個突變點，以及，僅含8個氨基酸的C肽鏈。所制備的松弛素野生型和突變體，其特征在于，所述本發(fā)明的野生型人松弛素前體氨基酸序列，其包括N端6個組氨酸肽鏈為純化用；三個凝血酶原蛋白酶切位點甘氨酸-精氨酸-甘氨酸，分別在N端6個組氨酸肽鏈與B肽鏈連接處，B肽鏈與C肽鏈連接處，和C肽鏈與A肽鏈連接處；含12個氨基酸的C肽鏈為連接肽鏈；29個氨基酸的B肽鏈；以及一個24個氨基酸的A肽鏈。所制備的松弛素野生型和突變體，所述兩種松弛素前體均包括三個凝血酶原蛋白酶切位點甘氨酸-精氨酸-甘氨酸，分別在N端6個組氨酸肽鏈與B肽鏈連接處，B肽鏈與C肽鏈連接處，和C肽鏈與A肽鏈連接處。所制備的松弛素野生型和突變體，所述兩種松弛素前體經(jīng)凝血酶原蛋白酶切割形成成熟的野生型和突變體松弛素；切割后，在B鏈的氨基端將有一個附加的甘氨酸，羧基端將有附加的甘氨酸-精氨酸；在A鏈的氨基端將有一個附加的甘氨酸。所制備的松弛素野生型和突變體，所述本發(fā)明強調(diào)以下任何一種或多種突變的位點B肽鏈第5位谷氨酸，A肽鏈第I，2，3，4和23位的谷氨酰胺，亮氨酸，酪氨酸，絲氨酸和脯氨酸。所制備的松弛素野生型和突變體，所述本發(fā)明所描述的突變體松弛素包含以上所示6個位點中任何一個或任何多個位點突變成任何一種氨基酸的所有突變體松弛素的總和。所制備的松弛素野生型和突變體，所述B肽鏈第5位突變?yōu)樘於彼幔珹肽鏈第1，2，3，4和23突變?yōu)楣劝彼幔惲涟彼幔z氨酸，酪氨酸和纈氨酸。所制備的松弛素野生型和突變體，所述本發(fā)明所描述的人重組松弛素野生型和突變體的基因序列。所制備的松弛素野生型和突變體，所述本發(fā)明所描述的人重組松弛素野生型和突變體的蛋白序列。所制備的松弛素野生型和突變體，所述本發(fā)明中連接肽鏈包含一部分或全部人野生型松弛素前體C肽鏈；而肽鏈連接處蛋白酶切位點為甘氨酸-精氨酸-甘氨酸；表達的重組野生型和突變體人松弛素前體為分泌型。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明公開了一種利用基因工程手段制備人松弛素野生型和突變體的方法。本發(fā)明通過巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)，利用經(jīng)過改造的分泌型表達載體PPICZ，對人松弛素野生型和突變體進行了高效表達。本發(fā)明所公開的方法具有產(chǎn)量高，簡便易行，費用低廉等優(yōu)點。重組人松弛素突變體有擴血管作用，可用于心血管疾病，如高血壓，心衰的治療，傷口愈合和分娩時擴張子宮頸的治療。


通過以下對本發(fā)明的實施例結(jié)合其附圖的描述，可以進一步理解其發(fā)明的目的、具體結(jié)構(gòu)特征和優(yōu)點。其中，附圖為圖I是人松弛素前體示意圖；圖2是成熟人松弛素示意圖；圖3是本發(fā)明設(shè)計的野生型人松弛素前體基因序列示意圖；圖4是本發(fā)明設(shè)計的突變體人松弛素前體基因序列示意圖；圖5是本發(fā)明設(shè)計的野生型人松弛素前體氨基酸序列示意圖；圖6是本發(fā)明設(shè)計的成熟野生型人松弛素示意圖；圖7是本發(fā)明設(shè)計的突變體人松弛素前體氨基酸序列示意圖；、
圖8是本發(fā)明設(shè)計的成熟突變體人松弛素示意圖；圖9是本發(fā)明設(shè)計的野生型與突變體人松弛素前體在巴斯德畢赤酵母中分泌表達不意具體實施例方式本發(fā)明是應(yīng)用在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的制備人松弛素野生型和突變體的方法，是在對現(xiàn)有的制備人松弛素野生型的方法缺點的基礎(chǔ)上作出的重大改進，具有非常重要的實踐意義。如圖所示，本發(fā)明公開了一種利用基因工程手段制備人松弛素野生型和突變體的方法。本發(fā)明通過巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)，利用經(jīng)過改造的分泌型表達載體pPICZ，對人松弛素野生型和突變體進行了高效表達。本發(fā)明所公開的方法具有產(chǎn)量高，簡便易行，費用低廉等優(yōu)點。重組人松弛素野生型和突變體有擴血管作用，可用于心血管疾病，如高血壓，心衰的治療，和傷口愈合的治療。如下將以具體的試驗步驟及數(shù)據(jù)來詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案設(shè)計并合成重組人松弛素野生型和突變體基因根據(jù)人松弛素的晶體結(jié)構(gòu)和其與受體結(jié)合的位點，我們設(shè)計了人松弛素突變體的氨基酸序列；其中A肽鏈包括6個突變點，B肽鏈包括4個突變點，僅含8個氨基酸的C肽鏈。我們通過這些突變不影響其與人松弛素受體I的結(jié)合，但會消除其與人松弛素受體2的結(jié)合。人松弛素野生型和突變體基因的設(shè)計根據(jù)酵母所喜愛的氨基酸密碼子構(gòu)成，包括N端組氨酸肽鏈為純化用以及內(nèi)在3個蛋白酶切位點為切除N端組氨酸肽鏈和C肽鏈用。構(gòu)建人松弛素野生型和突變體的重組酵母表達載體人松弛素野生型和突變體基因經(jīng)合成后克隆入分泌型表達載體PPICZ，含N端alpha因子信號肽。所有載體均經(jīng)測序確證。重組松弛素野生型和突變體的表達重組人松弛素野生型和突變體表達載體被轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母中進行誘導(dǎo)表達。表達量最高的克隆被篩選為進一步大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)。重組人松弛素野生型和突變體的切割，分離和純化培養(yǎng)液上清經(jīng)離心制備。重組人松弛素野生型和突變體前體用Ni-NTA親和層析純化。純化的重組人松弛素野生型和突變體前體經(jīng)過適當?shù)牡鞍酌盖谐齆端組氨酸肽鏈和C肽鏈形成成熟的重組人松弛素野生型和突變體。成熟的重組人松弛素野生型和突變體經(jīng)凝膠過濾層析分離純化。技術(shù)方案詳情(I)設(shè)計了野生型和突變體人松弛素前體基因序列(圖3和圖4)。本設(shè)計根據(jù)酵母所喜愛的氨基酸密碼子構(gòu)成，包括N端組氨酸肽鏈為純化用以及內(nèi)在3個蛋白酶切位點為切除N端組氨酸肽鏈和C肽鏈用(圖5和圖6)。(2)設(shè)計重組野生型和突變體人松弛素前體的氨基酸序列根據(jù)人松弛素的晶體結(jié)構(gòu)和其與受體結(jié)合的位點，我們設(shè)計了人野生型和突變體松弛素前體的氨基酸序列(圖5-8)。i.本設(shè)計中人野生型松弛素前體含24個氨基酸的A肽鏈，29個氨基酸的B肽鏈， 僅含12個氨基酸的C肽鏈。野生型松弛素可與人松弛素受體I和2的結(jié)合(圖5，6)。ii.本設(shè)計中突變體松弛素前體的A肽鏈包括5個突變點，B肽鏈包括I個突變點，僅含12個氨基酸的C肽鏈。我們通過這些突變不影響其與人松弛素受體I的結(jié)合，但會消除其與人松弛素受體2的結(jié)合(圖5，6)。iii.本設(shè)計中兩種松弛素前體均包括N端6個組氨酸肽鏈為純化用(圖5，6)。iv.本設(shè)計中兩種松弛素前體均包括三個凝血酶原蛋白酶切位點甘氨酸-精氨酸-甘氨酸，分別在N端6個組氨酸肽鏈與B肽鏈連接處，B肽鏈與C肽鏈連接處，和C肽 鏈與A肽鏈連接處(圖5，7)。V.本設(shè)計中兩種松弛素前體經(jīng)凝血酶原蛋白酶切割形成成熟的野生型和突變體松弛素。切割后，在B鏈的氨基端將有一個附加的甘氨酸，羧基端將有附加的甘氨酸-精氨酸；在A鏈的氨基端將有一個附加的甘氨酸(圖5-7)。vi.本發(fā)明強調(diào)以下任何一種或任何多種突變的位點B肽鏈第5位谷氨酸，A肽鏈第1，2，3，4和23位的谷氨酰胺，亮氨酸，酪氨酸，絲氨酸和脯氨酸(圖7，8)。vii.本發(fā)明所描述的突變體松弛素包含以上(F)所示6個位點中任何一個或任何多個位點突變成任何一種氨基酸的所有突變體松弛素的總和。viii.本設(shè)計中，特別地，B肽鏈第5位突變?yōu)樘於彼幔珹肽鏈第1，2，3，4和23突變?yōu)楣劝彼幔惲涟彼幔z氨酸，酪氨酸和纈氨酸(圖7，8)。ix.本設(shè)計中連接肽鏈包含一部分或全部人野生型松弛素前體C肽鏈(圖5，7)。X.本設(shè)計中肽鏈連接處蛋白酶切位點為甘氨酸-精氨酸-甘氨酸(圖5，7)。xi.本設(shè)計中表達的重組野生型和突變體人松弛素前體為分泌型。(3)構(gòu)建野生型和突變體人松弛素的重組酵母表達載體野生型和突變體人松弛素基因經(jīng)合成后克隆入分泌型表達載體pPICZ中，含N端alpha因子信號肽。所有載體均經(jīng)測序確證。(4)重組野生型和突變體松弛素的表達重組野生型和突變體表達載體被轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母中進行誘導(dǎo)表達。O. 5%甲醇被用于誘導(dǎo)表達。48小時后，表達量達最高。此發(fā)明為進一步大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)和純化制備作準備。重組野生型和突變體人松弛素有擴血管作用，可用于心血管疾病，如高血壓，心衰的治療，傷口愈合的治療(圖9)。圖3如上述的基因序列，本發(fā)明設(shè)計的野生型人松弛素前體基因序列。此序列根據(jù)酵母所喜愛的氨基酸密碼子構(gòu)成，包括N端組氨酸肽鏈為純化用以及內(nèi)在3個蛋白酶切位點為切除N端組氨酸肽鏈和C肽鏈用。含12個氨基酸的C肽鏈為連接肽鏈。圖4如上述的基因序列，本發(fā)明設(shè)計的突變體人松弛素前體基因序列。此序列根據(jù)酵母所喜愛的氨基酸密碼子構(gòu)成，包括N端組氨酸肽鏈為純化用以及內(nèi)在3個蛋白酶切位點為切除N端組氨酸肽鏈和C肽鏈用。此序列中含包括5個突變點的A肽鏈，I個突變點的B肽鏈，12個氨基酸的C肽鏈。如圖5所示本發(fā)明設(shè)計的野生型人松弛素前體氨基酸序列。其包括N端6個組氨酸肽鏈為純化用；三個凝血酶原蛋白酶切位點甘氨酸-精氨酸-甘氨酸，分別在N端6個組氨酸肽鏈與B肽鏈連接處B，肽鏈與C肽鏈連接處，和C肽鏈與A肽鏈連接處；含12個氨基酸的C肽鏈為連接肽鏈；29個氨基酸的B肽鏈；以及一個24個氨基酸的A肽鏈。凝血酶原蛋白酶裂解位點為箭頭所示。如圖6所示，本發(fā)明設(shè)計的成熟野生型人松弛素示意圖。成熟人松弛素經(jīng)凝血酶原蛋白酶裂解野生型人松弛素前體而形成包括約29個氨基酸的B肽鏈，一個24個氨基酸的A肽鏈及三個二硫鍵。鏈第10和15位半胱氨酸間形成鏈內(nèi)二硫鍵，B鏈第11位與A鏈第11位半胱氨酸間形成鏈間二硫鍵，B鏈第23位與A鏈第24位半胱氨酸間形成鏈間二硫鍵。凝血酶原切割后，在B鏈的氨基端將有一個附加的甘氨酸，羧基端將有附加的甘氨酸-精氨酸；在A鏈的氨基端將有一個附加的甘氨酸。
如圖7所示，本發(fā)明設(shè)計的突變體人松弛素前體氨基酸序列。包括N端6個組氨酸肽鏈為純化用；三個凝血酶原蛋白酶切位點甘氨酸-精氨酸-甘氨酸，分別在N端6個組氨酸肽鏈與B肽鏈連接處B，肽鏈與C肽鏈連接處，和C肽鏈與A肽鏈連接處；含12個氨基酸的C肽鏈為連接肽鏈；29個氨基酸的B肽鏈；以及一個24個氨基酸的A肽鏈。B肽鏈第5位突變?yōu)樘於彼幔珹肽鏈第1，2，3，4和23突變?yōu)楣劝彼幔惲涟彼幔z氨酸，酪氨酸和纈氨酸。凝血酶原蛋白酶裂解位點為箭頭所示。如圖8所示，本發(fā)明設(shè)計的成熟突變體人松弛素示意圖。成熟人松弛素經(jīng)凝血酶原蛋白酶裂解突變體人松弛素前體而形成包括約29個氨基酸的B肽鏈，一個24個氨基酸的A肽鏈及三個二硫鍵。A鏈第10和15位半胱氨酸間形成鏈內(nèi)二硫鍵，B鏈第11位與A鏈第11位半胱氨酸間形成鏈間二硫鍵，B鏈第23位與A鏈第24位半胱氨酸間形成鏈間二硫鍵。B肽鏈第5位突變?yōu)樘於彼幔珹肽鏈第I，2，3，4和23突變?yōu)楣劝彼幔惲涟彼幔z氨酸，酪氨酸和纈氨酸。凝血酶原切割后，在B鏈的氨基端將有一個附加的甘氨酸，羧基端將有附加的甘氨酸-精氨酸；在A鏈的氨基端將有一個附加的甘氨酸。如圖9所示，野生型與突變體人松弛素前體在巴斯德畢赤酵母中分泌表達。人松弛素野生型和突變體基因經(jīng)合成后克隆入分泌型表達載體PPICZ中，含N端alpha因子信號肽。所有載體均經(jīng)測序確證。重組人松弛素野生型和突變體表達載體被轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母中進行誘導(dǎo)表達。O. 5%甲醇被用于誘導(dǎo)表達。誘導(dǎo)24,48,72和96小時后,分別取培養(yǎng)液上清。抗組氨酸肽鏈抗體和Western印跡被用于檢測人松弛素前體的分泌表達。上述優(yōu)選實施例的描述使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能制造或使用本發(fā)明。這些實施例的各種修改對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的，這里定義的一般原理可以被應(yīng)用于其它實施例中而不背離本發(fā)明的精神或范圍。因此，本發(fā)明并不限于這里示出的實施例，而要符合與這里揭示的原理和新穎特征一致的最寬泛的范圍。
權(quán)利要求
1.一種松弛素野生型和突變體的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟 設(shè)計并合成重組人松弛素野生型和突變體的酵母所喜愛的氨基酸密碼子基因序列； 設(shè)計重組野生型和突變體人松弛素前體的氨基酸序列； 構(gòu)建人松弛素野生型和突變體的分泌型重組酵母表達載體； 重組野生型和松弛素突變體的分泌表達。
2.如權(quán)利要求I所述的松弛素野生型和突變體的制備方法，其特征在于，所述構(gòu)建人松弛素野生型和突變體的分泌型重組酵母表達載體通過巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)，并利用經(jīng)過改造的分泌型表達載體，對人松弛素野生型和突變體進行高效表達。
3.如權(quán)利要求I所述的松弛素野生型和突變體的制備方法，其特征在于，所述設(shè)計并合成重組人松弛素野生型和突變體的酵母所喜愛的氨基酸密碼子基因序列根據(jù)酵母所喜愛的氨基酸密碼子構(gòu)成，包括N端組氨酸肽鏈為純化用以及內(nèi)在3個蛋白酶切位點為切除N端組氨酸肽鏈和C肽鏈用，24個氨基酸的A肽鏈，29個氨基酸的B肽鏈，和12個氨基酸的C肽鏈。且人松弛素突變體序列中含包括5個突變點的A肽鏈，I個突變點的B肽鏈。
4.如權(quán)利要求I所述的松弛素野生型和突變體的制備方法，其特征在于，所述重組人松弛素野生型和突變體表達載體被轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母中進行誘導(dǎo)表達，其過程包括O.5%甲醇被用于誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)24，48，72和96小時后，分別取培養(yǎng)液上清收集表達的重組蛋白。
5.如權(quán)利要求1-4之一所述的松弛素野生型和突變體的制備方法，其特征在于，還包括如下步驟 重組人松弛素野生型和突變體的切割，分離和純化； 重組人松弛素野生型和突變體的結(jié)構(gòu)確定，以及； 重組人松弛素野生型和突變體的活性鑒定。
6.如權(quán)利要求5所述的松弛素野生型和突變體的制備方法，其特征在于，所述重組人松弛素野生型和突變體前體用Ni-NTA親和層析純化；純化的重組人松弛素野生型和突變體前體經(jīng)過蛋白酶切除N端組氨酸肽鏈和C肽鏈形成成熟的重組人松弛素野生型和突變體；成熟的重組人松弛素野生型和突變體經(jīng)凝膠過濾層析分離純化。
7.如權(quán)利要求I所述的松弛素野生型和突變體的制備方法，其特征在于，所述本發(fā)明的人松弛素突變體的氨基酸序列中A肽鏈包括6個突變點，B肽鏈包括4個突變點，以及，僅含8個氨基酸的C肽鏈。
8.如權(quán)利要求I所述的松弛素野生型和突變體的制備方法，其特征在于，所述本發(fā)明的野生型人松弛素前體氨基酸序列，其包括N端6個組氨酸肽鏈為純化用；三個凝血酶原蛋白酶切位點甘氨酸-精氨酸-甘氨酸，分別在N端6個組氨酸肽鏈與B肽鏈連接處，B肽鏈與C肽鏈連接處，和C肽鏈與A肽鏈連接處；含12個氨基酸的C肽鏈為連接肽鏈；29個氨基酸的B肽鏈；以及一個24個氨基酸的A肽鏈。
9.如權(quán)利要求I所述的松弛素野生型和突變體的制備方法，其特征在于，所述兩種松弛素前體均包括三個凝血酶原蛋白酶切位點甘氨酸-精氨酸-甘氨酸，分別在N端6個組氨酸肽鏈與B肽鏈連接處，B肽鏈與C肽鏈連接處，和C肽鏈與A肽鏈連接處。
10.如權(quán)利要求I所述的松弛素野生型和突變體的制備方法，其特征在于，所述兩種松弛素前體經(jīng)凝血酶原蛋白酶切割形成成熟的野生型和突變體松弛素；切割后，在B鏈的氨基端將有一個附加的甘氨酸，羧基端將有附加的甘氨酸-精氨酸；在A鏈的氨基端將有一個附加的甘氨酸。
11.如權(quán)利要求I所述的松弛素突變體的制備方法，其特征在于，所述本發(fā)明強調(diào)以下任何一種或多種突變的位點=B肽鏈第5位谷氨酸，A肽鏈第1，2，3，4和23位的谷氨酰胺，亮氨酸，酪氨酸，絲氨酸和脯氨酸
12.如權(quán)利要求11所述的松弛素突變體的制備方法，其特征在于，所述本發(fā)明所描述的突變體松弛素包含以上所示6個位點中任何一個或任何多個位點突變成任何一種氨基酸的所有突變體松弛素的總和。
13.如權(quán)利要求11所述的細胞松弛素突變體的制備方法，其特征在于，所述B肽鏈第5位突變?yōu)樘於彼幔珹肽鏈第I，2，3，4和23突變?yōu)楣劝彼幔惲涟彼幔z氨酸，酪氨酸和纈氨酸。
14.如權(quán)利要求I所述的松弛素野生型和突變體的制備方法，其特征在于，所述本發(fā)明所描述的人重組松弛素野生型和突變體的基因序列。
15.如權(quán)利要求I所述的細胞松弛素野生型和突變體的制備方法，其特征在于，所述本發(fā)明所描述的人重組松弛素野生型和突變體的蛋白序列。
16.如權(quán)利要求I所述的松弛素野生型和突變體的制備方法所制備的松弛素野生型和突變體，其特征在于，所述構(gòu)建人松弛素野生型和突變體的分泌型重組酵母表達載體通過巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)，并利用經(jīng)過改造的分泌型表達載體，對人松弛素野生型和突變體進行聞效表達。
17.如權(quán)利要求16所述的所制備的松弛素野生型和突變體，其特征在于，所述設(shè)計并合成重組人松弛素野生型和突變體的酵母所喜愛的氨基酸密碼子基因序列根據(jù)酵母所喜愛的氨基酸密碼子構(gòu)成，包括N端組氨酸肽鏈為純化用以及內(nèi)在3個蛋白酶切位點為切除N端組氨酸肽鏈和C肽鏈用，24個氨基酸的A肽鏈，29個氨基酸的B肽鏈，和12個氨基酸的C肽鏈。且人松弛素突變體序列中含包括5個突變點的A肽鏈，I個突變點的B肽鏈。
18.如權(quán)利要求16所述的所制備的松弛素野生型和突變體，其特征在于，所述重組人松弛素野生型和突變體表達載體被轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母中進行誘導(dǎo)表達，其過程包括O.5%甲醇被用于誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)24，48，72和96小時后，分別取培養(yǎng)液上清收集表達的重組蛋白。
19.如權(quán)利要求16-18任一所述的所制備的松弛素野生型和突變體，其特征在于，所述重組人松弛素野生型和突變體前體用Ni-NTA親和層析純化；純化的重組人松弛素野生型和突變體前體經(jīng)過蛋白酶切除N端組氨酸肽鏈和C肽鏈形成成熟的重組人松弛素野生型和突變體；成熟的重組人松弛素野生型和突變體經(jīng)凝膠過濾層析分離純化。
20.如權(quán)利要求16所述的所制備的松弛素野生型和突變體，其特征在于，所述本發(fā)明的人松弛素突變體的氨基酸序列中A肽鏈包括5個突變點，B肽鏈包括I個突變點，以及，僅含12個氨基酸的C肽鏈。
21.如權(quán)利要求16所述的所制備的松弛素野生型和突變體，其特征在于，所述本發(fā)明的野生型人松弛素前體氨基酸序列，其包括N端6個組氨酸肽鏈為純化用；三個凝血酶原蛋白酶切位點甘氨酸-精氨酸-甘氨酸，分別在N端6個組氨酸肽鏈與B肽鏈連接處，B肽鏈與C肽鏈連接處，和C肽鏈與A肽鏈連接處；含12個氨基酸的C肽鏈為連接肽鏈；29個氨基酸的B肽鏈；以及一個24個氨基酸的A肽鏈。
22.如權(quán)利要求16所述的所制備的松弛素野生型和突變體，其特征在于，所述兩種松弛素前體均包括三個凝血酶原蛋白酶切位點甘氨酸-精氨酸-甘氨酸，分別在N端6個組氨酸肽鏈與B肽鏈連接處，B肽鏈與C肽鏈連接處，和C肽鏈與A肽鏈連接處。
23.如權(quán)利要求16所述的所制備的松弛素野生型和突變體，其特征在于，所述兩種松弛素前體經(jīng)凝血酶原蛋白酶切割形成成熟的野生型和突變體松弛素；切割后，在B鏈的氨基端將有一個附加的甘氨酸，羧基端將有附加的甘氨酸-精氨酸；在八鏈的氨基端將有一個附加的甘氨酸。
24.如權(quán)利要求16所述的所制備的松弛素野生型和突變體，其特征在于，所述本發(fā)明強調(diào)以下任何一種或多種突變的位點B肽鏈第5位谷氨酸，A肽鏈第1，2，3，4和23位的谷氨酰胺，亮氨酸，酪氨酸，絲氨酸和脯氨酸。
25.如權(quán)利要求24所述的所制備的松弛素野生型和突變體，其特征在于，所述本發(fā)明所描述的突變體松弛素包含以上所示6個位點中任何一個或多個位點突變成任何一種氨基酸的所有突變體松弛素的總和。
26.如權(quán)利要求24所述的所制備的松弛素野生型和突變體，其特征在于，所述B肽鏈第.5位突變?yōu)樘於彼幔珹肽鏈第1，2，3，4和23突變?yōu)楣劝彼幔惲涟彼幔z氨酸，酪氨酸和纈氨酸。
27.如權(quán)利要求16所述的所制備的松弛素野生型和突變體，其特征在于，所述本發(fā)明所描述的人重組松弛素野生型和突變體的基因序列。
28.如權(quán)利要求16所述的所制備的松弛素野生型和突變體，其特征在于，所述本發(fā)明所描述的人重組松弛素野生型和突變體的蛋白序列。
29.如權(quán)利要求16所述的所制備的松弛素野生型和突變體，其特征在于，所述本發(fā)明中連接肽鏈包含一部分或全部人野生型松弛素前體C肽鏈；而肽鏈連接處蛋白酶切位點為甘氨酸-精氨酸-甘氨酸；表達的重組野生型和突變體人松弛素前體為分泌型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用基因工程手段制備重組人松弛素野生型和突變體的方法，包括以下步驟(1)設(shè)計并合成重組人松弛素野生型和突變體的酵母所喜愛的氨基酸密碼子基因序列；(2)設(shè)計重組野生型和突變體人松弛素前體的氨基酸序列；(3)構(gòu)建人松弛素野生型和突變體的分泌型重組酵母表達載體；(4)重組野生型和松弛素突變體的分泌表達；本發(fā)明公開了一種利用基因工程手段表達人松弛素野生型和突變體的方法。本發(fā)明通過巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)，利用經(jīng)過改造的分泌型表達載體pPICZ，對人松弛素突變體進行了高效表達；本發(fā)明公開的方法具有產(chǎn)量高，簡便易行，費用低廉等優(yōu)點。重組人松弛素野生型和突變體有擴血管作用，可用于心血管疾病，如高血壓，心衰的治療，傷口愈合和分娩時擴張子宮頸的治療。
文檔編號C12N15/81GK102643825SQ20111036619
公開日2012年8月22日 申請日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者周永剛, 譚文斌 申請人:上海佑科生物技術(shù)有限公司