專利名稱：小鼠脂肪干細胞的分離、培養及純化方法
小鼠脂肪干細胞的分離、培養及純化方法本發明涉及動物干細胞的分離方法，尤其涉及一種小鼠脂肪干細胞分離、培養及純化的方法。脂肪干細胞具有多向分化的潛能，在體外可定向分化為脂肪、成骨、軟骨、肝臟、心肌細胞等，在人源方面，相比于骨髓干細胞，其具有取材容易、獲取量大、減少供體取材時痛苦的優點，因此在再生醫學上具有重要的意義。小鼠作為一個重要的模式動物，在基礎研究方面有著廣泛的應用，但是小鼠脂肪干細胞的體外培養卻一直是個難題，涉及所用的消化液、培養液等各個方面，以及所采取的分離方法與培養方法。對于現有資料的方法，紛繁蕪雜，經實際操作后發現效果并不是十分的理想，其不足之處在于可操作性不強，有需要改進的地方。為此本發明針對實踐過程中出現的一些問題，在相關環節上做了一些改進，經過多次嘗試，形成了一個相對較完善，可操作性強的小鼠脂肪干細胞的消化分離體系和分離后細胞的培養方法。本發明要解決的技術問題是提供一種小鼠脂肪干細胞分離、培養及純化的方法。為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是一種小鼠脂肪干細胞的分離、 培養及純化方法，包括以下步驟一、細胞的分離(1)取材取4周齡的ICR雄鼠，處死，對其全身消毒；(2)無菌條件下切取腹股溝處的脂肪組織，放入含青霉素和鏈霉素的DPBS液中洗凈血污；(3)去除脂肪組織中的血管，再次洗滌，轉入一個新的培養皿中，充分剪碎，加入消化液(10% FBS, 0. 09%膠原酶I，其余成分為DMEM/F12)，用連接有Iml吸嘴的移液器充分吹打，直至組織能夠很通暢的出入吸嘴，將脂肪組織轉入離心管中；記錄加入消化液的量和最終懸液的體積，以計算脂肪組織的量，并使最終消化液的體積是脂肪組織的2-3倍；(4) 37°C消化lh，定期搖動，使組織塊與消化液充分接觸；(5)消化完后，反復吹打消化液，分散組織塊，制成細胞懸液；(6)低速離心5min，將上層的脂肪組織反復吹打至少lmin，再次離心；(7)棄掉上層成熟脂肪細胞和中層的消化液，再用基礎培養基重懸底層的細胞；(8)將細胞懸液用尼龍濾網過濾，所得濾液再次過濾，除去大部分成熟脂肪細胞， 收集濾液，每次過濾后注意再用適量的基礎培養基洗滌濾網，減少濾網上細胞的殘留；(9)將最后得到的濾液離心，吸棄漂浮的脂肪細胞，用基礎培養基反復洗滌3遍；二、細胞培養(10)最后一次離心后用完全培養基重懸，接種，置于培養箱中常規條件(37°C，5% CO2,100%濕度)培養；(11)每0. 4-0. 6ml的脂肪組織分離得到的細胞接種到六孔板的一孔中；(12)首次換液原代接種池后加入DPBS，反復洗滌5_6次，洗去大部分雜細胞和組織塊，加入新鮮的完全培養基繼續培養；(13)第二次換液首次換液24h后對其進行第二次洗滌，進一步洗去未貼壁細胞和組織塊，加入新鮮的完全培養基繼續培養；(14)第三次換液首次換液后7 后進行第三次洗滌，直至細胞面基本干凈，加入新鮮的完全培養基繼續培養；后期每3天半量換液一次，長至90%滿即傳代；三、純化(15)細胞長滿后，加入胰酶消化aiiin，迅速將已消化下來的細胞轉移并終止，離心重懸后接入新皿中繼續培養，前皿底殘留的細胞則棄去；利用此方法多次傳代，逐漸降低雜細胞的比例，從而達到純化的目的。作為優選，步驟(2)所述青霉素的濃度為400IU/ml ；所述鏈霉素的濃度為400 μ g/ ml ο作為優選，從步驟( 切取出脂肪組織至步驟(10)最后一次離心后用完全培養基重懸并接種，整個過程時間控制在4h以內。作為優選，步驟(8)中，先用孔徑為250 μ m的尼龍濾網過濾細胞懸液，再將所得濾液用孔徑為80 μ m的尼龍濾網過濾。作為優選，完全培養基的組成成分為胎牛血清20%，青霉素100IU/ml，鏈霉素 100yg/ml, L-谷氨酰胺2mmol/L，堿性成纖維細胞生長因子lOng/ml，維生素C 50yg/ml, DMEM/F12 補足到 100%。作為優選，基礎培養基的組成成分為胎牛血清20%，青霉素100IU/ml，鏈霉素 100 μ g/ml, L-谷氨酰胺 2mmol/L，DMEM/F12 補足到 100%。相比現有技術，本發明主要在以下三方面做出了改進一、在整個分離過程中不中斷營養的供給在現有的一些分離程序中有的在消化過程中或洗滌過程中即中斷了營養供給，由于整個分離程序所需時間漫長，這種做法可能不利于后期細胞活性的維持，為此，我們在整個分離程序中都給細胞提供營養，消化液中含細胞生長的基礎成分，細胞洗滌也用培養基洗滌而非有關文獻中報道的DPBS，最大程度的保持細胞的活性。二、洗滌換液程序原代培養的脂肪干細胞中存在著大量的血細胞和未消化的組織，尤其是后者漂浮在液體表面難以去除，血細胞若一直存在隨后裂解，產生的有害物質會影響細胞的生長活性；換液過早，細胞尚未完全貼壁，不僅影響脂肪干細胞的獲得率，同時也會對其造成嚴重的機械損傷；換液過遲，血細胞裂解后的不利影響將會體現出來，同時一些未消化的組織塊也會貼壁并爬出細胞，從而影響細胞的純度，因此首次換液洗滌換液時間的準確把握顯得至關重要。然而首次換液和第二次換液均考慮到機械損傷的問題，不能過度洗滌，所以兩次洗滌后還會殘留一部分雜細胞和組織，可待細胞充分貼壁后對其進行第三次洗滌，直至細胞面沒有明顯的雜質再加入新鮮的完全培養基繼續培養。通過在合適的時間對其進行上述的洗滌換液程序，逐步降低雜細胞的比例，同時減少了對脂肪干細胞的機械損傷，從而更好的維持小鼠脂肪干細胞生長活性；3次洗滌換液后雜細胞與組織已基本去除，以利于后期的長期培養直至細胞長滿傳代。三、細胞的純化脂肪組織中存在多種細胞，有上皮細胞、成熟脂肪細胞、脂肪母細胞、血細胞等各種細胞，尤其是內皮細胞，主要來源于血管壁，在分離程序中有剔除血管的操作可減少雜細胞的引入。但是無論如何操作都會或多或少有雜細胞進入培養體系，為此， 我們在了解了脂肪干細胞和雜細胞的生物學特性后，主要根據二者傳代時所需的胰酶消化時間的差異，摸索出了一個合適的消化時間，利用差速消化法將雜細胞和脂肪干細胞分開， 多次傳代最終得到高純度的脂肪干細胞。實踐證明，通過此方法分離培養出的細胞能夠很好的維持脂肪干細胞的相關特性，同時獲得的脂肪干細胞純度很高。本發明的有益效果是能夠從小鼠的脂肪組織中分離出高活性、高純度的脂肪干細胞，為后期對脂肪干細胞的進一步研究奠定了基礎。(一 )細胞的分離1.取材取4周齡的ICR雄鼠，頸椎脫臼處死，75%酒精全身浸泡消毒5min ；有報道顯示供體的年齡對脂肪干細胞后期的分化潛能有著重要的影響，為此我們選擇此周齡的小鼠。實踐證明此階段小鼠分離得到的脂肪干細胞能很好的用于后期的分化研究。2. 75%酒精消毒腹部，低位橫向切口打開腹腔，在無菌條件下迅速切取腹股溝處的脂肪組織，在取脂肪組織時要注意辨別并棄去淋巴結，以免影響后期細胞的純度。放入含雙抗(400IU/ml青霉素、400 μ g/ml鏈霉素)的DPBS中洗3遍。3.手術刀和鑷子配合使用，清除脂肪組織中的血管。具體操作步驟如下(1)將浸泡于DPBS中的脂肪組織先在皿底吸附片刻，去除表面的液體，以方便后期脂肪組織能夠牢固的貼在皿底，便于下一步的操作。(2)將充分去除DPBS的脂肪組織轉移到一個新的皿中，盡量鋪展開，暴露出血管的紋路，并將其理直。(3)將手術刀與血管平行放置，盡量靠近血管而不接觸血管，順著血管的紋路切下，用鑷子在手術刀的另一側將無血管的組織撕下。(4)再將手術刀平行于血管的另一側切下，用鑷子將含血管的少量組織撕下，便可很有效的去除組織中的血管，此法對于組織中的微血管的去除尤其有效。4.將去除血管后的脂肪組織再洗滌3遍，轉入一個新的皿中，吸去殘余的DPBS，用無菌剪刀將脂肪組織充分剪碎，加入少量的消化液，用連接有Iml吸嘴的移液器充分吹打， 直至組織能夠很通暢的出入吸嘴，再將脂肪組織轉入離心管中；5.再加入一定量的消化液洗滌吸嘴和皿，將殘留的脂肪組織盡量充分轉入離心管中，記錄加入消化液的量和最終懸液的體積，以計算脂肪組織的量，并使最終消化液的體積是脂肪組織的2-3倍。6. 37°C消化lh，期間每隔5min取出離心管，搖動，使組織塊與消化液充分混勻；7.消化完后，用吸管反復吹打消化后的懸液，分散組織塊，制成細胞懸液；
8. 1200rpm離心5min，用移液器將上層的脂肪組織反復吹打至少lmin，再次離心， 此步可有利于提高脂肪干細胞的得率。9.棄掉上層成熟脂肪細胞和中層的消化液，再用基礎培養基重懸底層的細胞。吸取中層消化液時注意從液體的表面吸取，這樣可有利于吸去漂浮在液體表面的脂肪細胞， 重懸時細胞要充分吹打成單個細胞，否則后期過濾時會影響細胞的得率。10.先用孔徑為250 μ m的尼龍濾網過濾細胞懸液，除去未分散的組織塊，收集濾液。將濾液再用孔徑為80 μ m的尼龍濾網過濾，除去大部分成熟脂肪細胞，收集濾液，每次過濾后注意再用適量新鮮的基礎培養基洗滌濾網，減少殘留在濾網上的細胞。11.將最后得到的濾液離心(1200rpm，5min)，吸棄漂浮的脂肪細胞，用基礎培養基反復洗滌3遍。吸棄上層懸液的方法同前所述，脂肪細胞的充分洗干凈很重要，有報道顯示殘留的脂肪細胞與脂肪干細胞共培養會導致脂肪干細胞的分化，因此洗去脂肪細胞對于脂肪干細胞的干性維持是十分重要的。( 二)細胞培養12.最后一次離心后用完全培養基重懸，接種，置于培養箱常規條件(37°C，5% C02，100%濕度)培養。13.由于分離得到的細胞中含有很多血細胞，而且每次操作時最終得到的血細胞數量差異較大，因此通過細胞計數的方法來確定接種密度是十分不準確的。同一品系、同一周齡的小鼠中一定量脂肪組織中含有的脂肪干細胞的量一般是相對穩定的，為此我們以脂肪組織的量來最終決定細胞的接種密度。經發現每0. 4-0. 6ml左右的脂肪組織分離得到的細胞接種到六孔板的一孔中是比較合適的，一般5-7天即可長滿。14.首次換液輕過皿面，不可劇烈來回震蕩，輕斜培養板，吸棄DPBS，反復5_6次， 此時僅洗去部分雜細胞，還有相當是量的雜細胞未去除，但是不可洗滌過度，防止對細胞造成損傷，并換液；15.第二次換液首次換液24h后對其進行第二次洗滌換液，再次充分洗滌，方法同前，進一步洗去未貼壁細胞，并換液，此時仍有較多的雜細胞殘留于皿中，但細胞仍未充分貼壁，因此也不可過多洗滌。16.第三次換液首次換液后7 后進行第三次洗滌換液，此時細胞已充分貼壁， 可充分洗滌直至細胞面干凈。后期每3天半量換液一次，長至90%滿即傳代。(三)純化為得到高純度的脂肪干細胞，細胞的純化操作主要涉及于分離過程中和后期傳代操作中，分離過程中的純化前面已有詳述，在此主要說明后期傳代過程中的純化操作。實踐發現，脂肪干細胞一般在加入胰酶后aiiin左右即可消化下來，而雜細胞在此時間段則難以消化下來，利用這個特性，我們在胰酶消化anin后，迅速將已消化下來的細胞轉移并終止，離心重懸后接入新皿中繼續培養，前皿底殘留的細胞則棄去，通過此法將脂肪干細胞與雜細胞分開。當然，此過程也無法避免會消化下來少量的雜細胞，但是一者脂肪干細胞的增殖迅速，其次利用此方法經過多次傳代，將會使雜細胞的比例逐漸降低，從而達到純化的目的，一般3代即可得到相當高純度的細胞。需要注意的是，從第2步中脂肪組織的取出到第12步中最后一次離心置于培養箱中培養最好控制在4h以內。
本實施例還進行了以下的相關實驗1、對于首次換液的時間對細胞貼壁率的影響，我們設計了如下實驗分別在原代培養后lh，2h，4h、24h將上層的懸液轉移到一個新的皿中繼續培養48h，結果發現Ih后換液的上層液體置于一個新皿中繼續培養，仍有將近20%的貼壁細胞，而后三者貼壁的細胞基本可忽略不計，由此說明脂肪干細胞在池內基本貼壁完全。2、用本實施例所用的消化液消化得到的細胞，原代接種后分別在au24h對其首次換液，結果24h首次換液組僅維持到17代便停止增殖，細胞嚴重老化，而池后首次換液組17代時狀態良好，仍有較高的增殖能力，且可維持至30代以仍可繼續傳代。3、利用本實施例所用的純化方法，將得到的第三代脂肪干細胞，用流式細胞儀檢測間充質來源細胞的表面抗原⑶44表達率為99. 75%、⑶105為68. 77%，多能性細胞表面抗原ka-Ι為99. 01%，與現有的報道基本相符，同時我們也檢測了雜細胞表面標記的表達率，其中造血干細胞表面抗原⑶45為0. 25%，內皮細胞表面抗原⑶31為0. 79%，成纖維細胞表面抗原HLA-DR為0.對％，雜細胞的比例非常低，細胞純度較高。4、以本實施例培養出的脂肪干細胞，成脂與成骨誘導的結果表明，其在體外能夠很好的分化為成熟的脂肪細胞和成骨細胞，而對照組未分化，說明此培養體系可以維持其體外未分化的狀態，同時也有良好的體外分化潛能。
權利要求
1.一種小鼠脂肪干細胞的分離、培養及純化方法，包括以下步驟一、細胞的分離(1)取材取4周齡的ICR雄鼠，處死，對其全身消毒；(2)無菌條件下切取腹股溝處的脂肪組織，放入含青霉素和鏈霉素的杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)中洗凈血污；(3)去除脂肪組織中的血管，再次洗滌，轉入一個新的培養皿中，充分剪碎，加入消化液，消化液的組成成分為10%胎牛血清(FBS)，0. 09%膠原酶I，余量為DMEM/F12 ；用連接有 Iml吸嘴的移液器充分吹打，直至組織能夠很通暢的出入吸嘴，將脂肪組織轉入離心管中； 記錄加入消化液的量和最終懸液的體積，以計算脂肪組織的量，并使最終消化液的體積是脂肪組織的2-3倍；(4)37°C消化lh，定時搖動，使組織塊與消化液充分接觸；(5)消化完后，反復吹打消化液，分散組織塊，制成細胞懸液；(6)1200rpm離心5min，將上層的脂肪組織反復吹打至少lmin，再次離心；(7)棄掉上層成熟脂肪細胞和中層的消化液，再用基礎培養基重懸底層的細胞；(8)將細胞懸液先用孔徑為250μ m的尼龍濾網過濾細胞懸液，再將所得濾液用孔徑為 80 μ m的尼龍濾網過濾，除去大部分成熟脂肪細胞，收集濾液，每次過濾后注意再用適量的基礎培養基洗滌濾網，減少濾網上細胞的殘留；(9)將最后得到的濾液離心，吸棄漂浮的脂肪細胞，用基礎培養基反復洗滌3遍；二、細胞培養(10)最后一次離心后用完全培養基重懸，接種，置于培養箱常規條件培養；(11)每0.4-0. 6ml左右的脂肪組織分離得到的細胞接種到六孔板的一孔中；(12)首次換液原代接種池后加入棄去培養基，用DPBS反復洗滌5-6次，洗去大部分雜細胞和組織塊，加入新鮮的完全培養基繼續培養；(13)第二次換液首次換液24h后對其進行第二次洗滌，進一步洗去未貼壁細胞和組織塊，加入新鮮的完全培養基繼續培養；(14)第三次換液首次換液后7 后進行第三次洗滌，直至細胞面基本干凈，加入新鮮的完全培養基繼續培養；后期每3天半量換液一次，長至90%滿即傳代；三、純化(15)細胞長滿后，加入胰酶消化2min，迅速將已消化下來的細胞轉移并終止，離心重懸后接入新皿中繼續培養，前皿底殘留的細胞則棄去；利用此方法多次傳代，逐漸降低雜細胞的比例，從而達到純化的目的。
2.根據權利要求1所述小鼠脂肪干細胞的分離、培養及純化方法，其特征在于，步驟 (2)所述青霉素的濃度為400IU/ml ；所述鏈霉素的濃度為400μ g/ml。
3.根據權利要求1所述小鼠脂肪干細胞的分離、培養及純化方法，其特征在于，從步驟 (2)切取出脂肪組織至步驟(10)最后一次離心后用完全培養基重懸并接種，整個過程時間控制在4h以內。
4.根據權利要求1所述小鼠脂肪干細胞的分離、培養及純化方法，其特征在于，所述步驟(8)中，先用孔徑為250μπι的尼龍濾網過濾細胞懸液，再將所得濾液用孔徑為80μπι的尼龍濾網過濾。根據權利要求1所述小鼠脂肪干細胞的分離、培養及純化方法，其特征在于，所述完全培養基的組成成分為胎牛血清20%，青霉素100IU/ml，鏈霉素100yg/ml， L-谷氨酰胺2mmol/L，堿性成纖維細胞生長因子10ng/ml，維生素C 50 μ g/ml，DMEM/F12補足至100%。
5.根據權利要求1所述小鼠脂肪干細胞的分離、培養及純化方法，其特征在于，所述基礎培養基的組成成分為胎牛血清20%，青霉素100IU/ml，鏈霉素100μ g/ml，L-谷氨酰胺 2mmol/L, DMEM/F12 補足至 100%。
全文摘要
本發明公開了一種小鼠脂肪干細胞的分離、培養及純化方法。其步驟包括細胞分離、培養和純化三個階段，特別是在分離過程不中斷營養的供給，改進了三次換液時間和洗滌方法，以及使用差速消化法提高細胞純度。本發明能夠從小鼠的脂肪組織中分離出高活性、高純度的脂肪干細胞，為后期對脂肪干細胞進一步的研究奠定了基礎。
文檔編號C12N5/0775GK102433299SQ201110366128
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月17日 優先權日2011年11月17日
發明者劉星, 張宇, 張運海, 李運生, 章孝榮, 陳建文, 魏超 申請人:安徽農業大學