專利名稱：副溶血性弧菌的切刻內切酶核酸恒溫擴增快速檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于致病微生物檢測技術領域，具體涉及一種利用切刻內切酶恒溫擴增 (NEMA)技術進行菌樣的快速檢測的方試劑盒及其應用。
背景技術：
副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)是一種嗜鹽性細菌主要存在于海產品中，如墨魚、海魚、海蝦、海蟹或海蜇；以及含鹽分較高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力強，在抹布和砧板上能生存1個月以上，海水中可存活47天。如果不小心進食了含有該菌的食物，常會引起食物中毒，臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀。副溶血性弧菌食物中毒病多在夏秋季發生于沿海地區，并經常是集體發病。近年來由于海鮮空運，內地城市病例也漸增多。因此，有效的檢測出副溶血性弧菌對于食品安全是非常重要的。副溶血性弧菌現有的檢測方法主要有常規分離鑒定法、普通PCR檢測法、熒光定量PCR檢測法、膠體金免疫層析試驗法等。上述的方法或是存在耗時長、或是存在應用儀器昂貴，難以推展的問題，因此，需要開發出另一種能夠有效的檢測副溶血性弧菌的方法及其相應的試劑盒。

發明內容
本發明的目的是提供一種副溶血性弧菌的恒溫擴增快速檢測試劑盒及其檢測方法，以克服現有技術的不足，從而為食品安全提供科學的依據和指導作用。本發明的主要原理如下(1)設計一對5'端帶切刻內切酶識別序列的引物和一對分別由生物素和FITC標記的探針；(2)把引物和目標菌的模板DNA加入到模板預處理反應液，在Taq PlatinumDNA聚合酶作用下，通過幾個預變性和擴增的循環過程，把切刻內切酶識別序列引入到待擴增序列中，作為NEMA恒溫擴增的模板；(3)切刻內切酶識別NEMA模板上的識別序列，在其中一條核酸鏈上切割形成切
口，暴露其3'端；(4)在具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶的作用下，以暴露的3'端為起點，以未被切斷的另一條核酸鏈為模板，合成新的雙鏈核酸，舊鏈被剝離下來成為下一輪核酸合成的模板，同時在新合成的雙鏈核酸上恢復切刻內切酶識別位點；(5)切割、延伸和剝離的步驟重復進行，擴增出大量靶核酸序列。(6)擴增產物利用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測核酸擴增完成后，在反應管中加入探針與擴增產物雜交。把檢測板水平放置在操作臺上，取雜交產物 ο μ L加入檢測板的樣品孔中，再加入100 μ L緩沖液進行層析，IOmin
左右判讀結果。通用型核酸擴增物快速檢測板的上C為質控區，T為檢測區。檢測板在質控區C和檢測區T均出現紅色條帶，為陽性結果，表明樣本中含有檢測的目標物；僅在質控區C出現紅色條帶，為陰性結果，表明樣本中沒有檢出目標物；質控區C和檢測區T內均無紅色條帶出現，表明快速檢測板失效。本發明的一個方面涉及用于恒溫擴增快速檢測副溶血性弧菌的引物及探針，其中正向引物序列為SEQ ID NO 1 5-GGCCATAATTCGAAGCTCTTCGCTACTTCACCATTGACGGCTAC-3 ；反向引物序列為SEQ ID NO 2 5-TTCGCCAAATCTAAGCTCTTCTCACAACGCTGACGGATAACG-3 ；其中正向引物和反向引物中下劃線部分為切刻內切酶識別位點；Pl探針的序列為SEQ ID NO 3 5-CACAACGCTGACGGATAACGTTTTGC-3，5 端標記生物素；P2探針的序列為SEQ ID NO 4 5-GCTCCACCAGTAGCCGTCAATGGTG-3, 3 端標記 FITC。本發明的另一個方面涉及一種副溶血性弧菌的恒溫擴增快速檢測試劑盒，包括如下的組分(1)模板預處理反應液其中包括IOXTaq Platinum buffer II 反應緩沖液、0. 1 1. Ommol/L dNTP, 0. 1 1. Oymol/L 正向引物，0. 1 1. Oymol/L 反向引物，Taq Platinum DNA Polymerase 2. 5U ；所述的IOXiTaq Platinum buffer II 反應緩沖液成分為200mM Tris-HCl ρΗ8· 8，IOOmM KCl，IOOmM(NH4)2SO4, 20mM MgCl2 ；(2) NEMA恒溫擴增反應液包括IOXNEBuffer 3 反應緩沖液，0. 1 1. Ommol/L dNTP, 5 % 30 % DMSO, 0. 1 1. Oymol/L正向引物，0. 1 1. Oymol/L反向引物和100 μ g/mL牛血清蛋白(BSA)；其中所述的10 X NEBuffer 3 反應緩沖液成分為IOOmmol/L NaCl，50mmol/ LTris-HCl, 10mmol/L MgCl2, lmmol/L dithiothreitol pH 7.9;(3) Nt. BspQI 切刻內切酶:4U/y L ；(4) Bst DNA 聚合酶2U/ μ L ；(5)5'端標記生物素探針Pl和3'端標記FITC的探針P2各lOymol/L(6)通用型核酸擴增物快速檢測板。其中正向引物序列為SEQ ID NO :1，反向引物序列為SEQ ID NO 2 ；探針Pl的序列為SEQ ID NO :3，P2的序列為SEQ ID NO 4Pl 5-CACAACGCTGACGGATAACGTTTTGC-3 5 端標記生物素；P2 5-GCTCCACCAGTAGCCGTCAATGGTG-3 3 端標記 FITC。上述試劑盒應用于檢測食品中的副溶血性弧菌，其使用方法，依次包括下列步驟 (1)-(4)(1)待檢樣品或細菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA OD260/OD280在1. 6 2. 0范圍內，濃度在 IOng/ μ L IOOng/ μ L 范圍內；
5
2)模板預處理將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA，于94°C水浴 7min后迅速放入60°C的水浴中50s ；然后94°C水浴20s和60°C水浴50s過程反復進行5個以上循環；產物用于NEMA模板；(3) NEMA恒溫擴增反應在裝有46 μ L NEMA擴增反應液的反應管中加入2 μ L預處理過的模板DNA，LOyL Nt. BspQI切刻內切酶和1. 0 μ L Bst DNA聚合酶后，迅速放入57°C的水浴中60min，反應結束后取出；(4)產物檢測反應結束后，反應管中加入探針Pl和P2各0. 5μ ，90τ水浴:3min自然冷卻至恒溫，用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測產物。檢測線T和質控線C均顯示紅色，說明待檢樣品為陽性。本發明的試劑盒根據待檢菌株的保守基因序列設計5'端帶切刻內切酶識別序列的引物，保證檢測方法的特異性。本發明采用改進的切刻內切酶核酸恒溫擴增(NEMA)技術，該技術特異性強，具有與PCR檢測方法相似靈敏度，并且不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋即可，且結果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測即可，簡單、快速、安全、無污染，特別適用于食品檢測機構。
具體實施例方式下面結合實例對本發明的方法做進一步說明，但實例僅限于說明，并不限于此，其中未注明具體條件的實驗方法，通?？砂闯Ｒ帡l件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的 《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。實施例1 對副溶血性弧菌標準菌株的檢測按下列配方制作副溶血性弧菌的切刻內切酶核酸恒溫擴增試劑盒1)模板預處理反應液每 23μ 含 W 2. 5μ L IOXTaq Platinum buffer II, 1. 0μ L 2. 5mmol/L dNTP, l.OyL 10 μ mol/L 正向引物，1. 0 μ L 10 μ mol/L 反向引物，1. 0 μ L 2. 5U/ μ L Taq Platinum DNAPloymerase 禾口 16. 5 μ L ddH20(滅菌雙蒸水)。其中所述的正向引物SEQ ID NO 1 5-GGCCATAATTCGAAGCTCTTCGCTACTTCACCATTGACGGCTAC-3 ；反向引物SEQID NO :2 5-TTCGCCAAATCTAAGCTCTTCTCACAACGCTGACGGATAACG-3 ；其中正向引物和反向引物中下劃線部分為切刻內切酶識別位點；2) NEMA恒溫擴增反應液每46yL 含 W 5 μ L IOXNEBuffer 3, 1. 0 μ L 2. 5mmol/L dNTP, l.OyL 10μ mol/L 正向引物，l.OyL 10 μ mol/L 反向引物，0. 5 μ L 10mg/ml BSA,4y L DMSO 禾口 33. 5 μ LddH2O (滅菌雙蒸水)。其中所述的正向引物SEQ ID NO 1 5-GGCCATAATTCGAAGCTCTTCGCTACTTCACCATTGACGGCTAC-3 ；
反向引物SEQID NO :2 5-TTCGCCAAATCTAAGCTCTTCTCACAACGCTGACGGATAACG-3 ；其中正向引物和反向引物中下劃線部分為切刻內切酶識別位點；3) Nt. BspQI 切刻內切酶:4U/y L ；4) Bst DNA 聚合酶2U/ μ L ；5)探針 Pl 禾口 Ρ2 :10ymol/L ；其中所述的探針Pl的序列為SEQ ID NO 3Pl 5-CACAACGCTGACGGATAACGTTTTGC-3 5 端標記生物素；探針P2的序列為SEQ ID NO 4 P2 5-GCTCCACCAGTAGCCGTCAATGGTG-3 3 端標記 FITC。6)核酸薄層層析檢測板。型號3號；按照以下⑴-(4)程序進行檢測(1)樣品(副溶血性弧菌)DNA的提取將副溶血性弧菌陽性菌株(ATCC 17802)增菌培養后，提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA OD260/OD280在1.6 2. 0范圍內，濃度在IOng/ μ L IOOng/ μ L范圍內。(2)模板預處理將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA，于94°C水浴 7min后迅速放入60°C的水浴中50s ；然后94°C水浴20s和60°C水浴50s過程反復進行5個以上循環；產物用于NEMA模板。(3)進行NEMA恒溫擴增反應將裝有46 μ L NEMA恒溫擴增反應液的反應管中加入2 μ L預處理過的模板DNA， l.OyL Nt. BspQI切刻內切酶和l.OyL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57°C的水浴中60min。 反應結束后取出；(4)產物檢測反應結束后，反應管中加入探針Pl和P2各0. 5μ ，90τ水浴:3min自然冷卻至恒溫，用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測產物，通用型核酸擴增物快速檢測板可選用杭州優思達生物技術有限公司的批號為20101(^6-2的產品。在質控區C和檢測區T均出現紅色條帶，說明待檢樣品為副溶血性弧菌，也表明本發明所涉及的引物和探針在對副溶血性弧菌進行檢測的時候不會產生假陰性的結果。 實施例2 對創傷弧菌標準菌株的檢測1)模板預處理反應液每 23μ 含 W 2. 5μ L IOXTaq Platinum buffer IIU. 0μ L 2. 5mmol/L dNTP, l.OyL 10 μ mol/L 正向引物，1. 0 μ L 10 μ mol/L 反向引物，1. 0 μ L 2. 5U/ μ L Taq Platinum DNAPloymerase 禾口 16. 5 μ L ddH20(滅菌雙蒸水)。其中所述的正向引物SEQ ID NO 1 5-GGCCATAATTCGAAGCTCTTCGCTACTTCACCATTGACGGCTAC-3 ；反向引物SEQID NO :2 5-TTCGCCAAATCTAAGCTCTTCTCACAACGCTGACGGATAACG-3 ；其中正向引物和反向引物中下劃線部分為切刻內切酶識別位點；
2) NEMA恒溫擴增反應液每46yL 含有 5yL IOXNEBuffer 3，l.OyL 2. 5mmol/L dNTP, l.OyL IOymol/ L正向引物，1. OyL 10ymol/L 反向引物，0. 5μ L 10mg/mL BSA,4y L DMSO 禾口 33. 5 μ L ddH20(滅菌雙蒸水)。其中所述的正向引物SEQ ID NO 1 5-GGCCATAATTCGAAGCTCTTCGCTACTTCACCATTGACGGCTAC-3 ；反向引物SEQID NO :2 5-TTCGCCAAATCTAAGCTCTTCTCACAACGCTGACGGATAACG-3 ；其中正向引物和反向引物中下劃線部分為切刻內切酶識別位點；3) Nt. BspQI 切刻內切酶:4U/y L ；4) Bst DNA 聚合酶2U/ μ L ；5)探針 Pl 禾口 Ρ2 :10ymol/L ；其中所述的探針Pl的序列為SEQ ID NO 3P1 5-CACAACGCTGACGGATAACGTTTTGC-3 5 端標記生物素；探針P2的序列為SEQ ID NO 4 P2 5-GCTCCACCAGTAGCCGTCAATGGTG-3 3 端標記 FITC。6)核酸薄層層析檢測板。型號3號；按照以下(1)- )程序進行檢測(1)樣品(創傷弧菌ATCC 27562) DNA的提取將創傷弧菌陽性菌株(ATCC 27562)增菌培養后，提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA OD260/OD280在1. 6-2. O范圍內，濃度在IO-IOOng/ μ L范圍內。(2)模板預處理將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA，于94°C水浴 7min后迅速放入60°C的水浴中50s ；然后94°C水浴20s和60°C水浴50s過程反復進行5個以上循環；產物用于NEMA模板。(3)進行NEMA恒溫擴增反應將裝有46 μ L NEMA恒溫擴增反應液的反應管中加入2 μ L預處理過的模板DNA， l.OyL Nt. BspQI切刻內切酶和l.OyL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57°C的水浴中60min。 反應結束后取出；(4)產物檢測:反應結束后，反應管中加入探針Pl和P2各0. 5μ ，90τ水浴:3min自然冷卻至恒溫，用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測產物。質控區C顯示紅色條帶，檢測區T無紅色條帶出現，說明待檢樣品不是副溶血性弧菌。這個結果也證實了本發明的引物和檢測試劑盒在應用的時候不會產生假陽性。實施例3 對疑似感染副溶血性弧菌食品樣品的檢測將食品樣品按照實施例1描述的方法進行DNA的提取和擴增檢測，用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測產物。結果質控區C顯示紅色條帶，檢測區T也有紅色條帶出現，說明待檢樣品受到了副溶血性弧菌的感染。本發明的引物、探針和試劑盒還可以對其它的樣品進行副溶血性弧菌的檢測。
權利要求
1.一種用于恒溫擴增快速檢測副溶血性弧菌的引物及探針，其中正向引物序列為SEQ ID NO 1 ；反向引物序列為SEQ ID NO 2 ；Pl探針的序列為SEQ ID NO 3 P2探針的序列為SEQ ID NO :4。
2.如權利要求1所述的用于恒溫擴增快速檢測副溶血性弧菌的引物及探針，其特征在于所述的Pl探針的5'端標記生物素，P2探針的3'端標記FITC。
3.權利要求1所述的引物和探針用于檢測食品中的副溶血性弧菌。
4.一種副溶血性弧菌的恒溫擴增快速檢測試劑盒，包括如下的組分(1)模板預處理反應液其中包括 IOXTaq Platinum buffer II 反應緩沖液，0. 1 1. Ommo 1/LdNTP，0. 1 1.(^11101/1正向引物，0.1 1.(^11101/1反向引物，丁89 PlatinumDNA Polymerase 2. 5U ；所述的 IOXTaq Platinum buffer II 反應緩沖液成分為200mM Tris_HClpH8. 8， IOOmM KCl, IOOmM(NH4) 2S04,20mM MgCl2 ；(2)NEMA恒溫擴增反應液包括 10XNE Buffer 3 反應緩沖液，0. 1 1. Ommol/L dNTP，5% 30% DMS0,0. 1 1.(^11101/1正向引物，0. 1 l.Oymol/L反向引物和100 μ g/mL牛血清蛋白；其中所述的10XNE Buffer 3反應緩沖液成分為100mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L MgCl2, lmmol/L dithiothreitol pH 7.9;(3)Nt. BspQI 切刻內切酶:4υ/μ L ；(4)Bst DNA 聚合酶2U/ μ L ；(5)5 ‘端生物素標記探針Pl和3 ‘端FITC標記探針Ρ2各10 μ mol/L ；(6)通用型核酸擴增物快速檢測板；其中正向引物、反向引物和探針P1、P2的序列如權利要求1所述。
5.權利要求4所述的試劑盒用于檢測食品中的副溶血性弧菌。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其使用方法包括如下的步驟(1)待檢樣品或細菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA ODa5tZOD28tl在1. 6 2. 0范圍內，濃度在10 IOOng/μ L范圍內；(2)模板預處理將裝有23 μ L模板預處理反應液的反應管加入2 μ L待檢模板DNA，于94°C水浴7min 后迅速放入60°C的水浴中50s ；然后94°C水浴20s和60°C水浴50s過程反復進行5個以上循環；產物用于NEMA模板；(3)NEMA恒溫擴增反應在裝有46 μ L NEMA擴增反應液的反應管中加入2μ L預處理過的模板DNA，LOyL Nt. BspQI切刻內切酶和1. 0 μ L Bst DNA聚合酶后，迅速放入57°C的水浴中60min，反應結束后取出；(4)產物檢測反應結束后，反應管中加入探針Pl和P2各0. 5 μ L，90°C水浴:3min自然冷卻至恒溫，用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測產物。
全文摘要
本發明涉及一種用于恒溫擴增快速檢測副溶血性弧菌的引物及探針，其中正向引物序列為SEQ ID NO1，反向引物序列為SEQ ID NO2；P1探針的序列為SEQ ID NO3；P2探針的序列為SEQ ID NO4。同時本發明還提供一種包含上述引物探針序列的，用于恒溫擴增快速檢測副溶血性弧菌的試劑盒，以及應用方法。本發明的試劑盒根據待檢菌株的保守基因序列設計引物和探針，從而保證檢測方法的特異性。且具有與PCR檢測方法相似靈敏度，并且不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋即可。結果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用通用型核酸擴增物快速檢測板檢測即可，簡單、快速、安全、無污染，特別適用于食品檢測機構。
文檔編號C12Q1/68GK102399882SQ20111036614
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月17日 優先權日2011年11月17日
發明者姜英輝, 尼秀媚, 張健, 房保海, 王妍婷, 王建廣, 祝素珍, 雷質文, 馬維興 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心