專利名稱：一種高效制備天然脫落酸的方法
技術領域：
本發明屬于微生物發酵技術領域，涉及一種發酵生產制備天然脫落酸(Abscisic Acid, ABA)的新方法。
背景技術：
脫落酸(ABA)是目前世界上已發現的五大植物激素之一。天然型的脫落酸由于對農作物的生長發育具有很強的調節活性，能促進果實類、谷類、豆類的成熟發育，能大幅度提高其產量和質量，又能大大增強其耐寒、抗旱和抗鹽堿能力，因而具有廣闊的應用前景。 目前，脫落酸在基礎領域的研究已深入到植物細胞與基因工程水平。然而，由于存在于植物體內的天然脫落酸的光學構型僅為(s)-(+)-脫落酸，單純的(s)-(+)-脫落酸的生產成本極高，售價昂貴，而人工合成的脫落酸是外消旋體，活性遠小于天然型的脫落酸。因此，脫落酸應用于農業生產幾乎是空談。為了解決和滿足脫落酸應用于農業生產的需要，近二十年來，國內外(中國、日本等)一直在研究利用微生物發酵法來生產天然脫落酸。例如，已知可用真菌灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)來生產天然脫落酸，并公開了例如采用纖維素泡沫作載體的液體發酵，發酵產量有所提高，最高的產量達300毫克/升發酵量(參見，例如JP-A-6-247927、 JP-A-6-197775、 JP-A-6-133786、 JP-A-6-7180、 JP-A-2-10988、 JP-A-2-60590、 JP-A-63-296696, JP-A-58-51895)；另外，CN1182798A公開了一種通過真菌發酵生產天然脫落酸的方法，該方法采用三級發酵，在第三級發酵中采用連續流加補料出料以及菌種固定化，并添加關鍵底物，使產酸量穩定，脫落酸的最高產量達到1. 2克/升發酵液。專利 ZL00132024. 6公開了制備天然脫落酸的方法，該方法是通過采用真菌批次液體培養基流加補料工藝來制備天然脫落酸的方法。專利2007100(^609. 2公開了一種新的制備天然脫落酸方法，該方法通過在發酵過程中流加肌醇解除葡萄糖阻遏的工藝來提高脫落酸的產量。但現有技術菌種的底物轉化率低，合成脫落酸的前體物質供應速率低，脫落酸產量受到局限；且發酵工藝(固體發酵、液體批次發酵和連續流加補料出料工藝、批次液體培養基流加補料工藝等)由于油脂類副產物較多，造成發酵液溶氧不均，導致溶氧利用率較低，能耗較大，成本居高不下。

發明內容
針對現有技術中已知的用微生物發酵生產天然脫落酸工藝中所存在的菌種發酵產量較低，能耗較大，生產成本高等的不足，本發明者進行了深入的研究，尋找更為有效的提高脫落酸產量的方法，以及生產成本更低的改進工藝。研究發現，葡萄糖等碳源氧化后會生成乙酰輔酶A (Acetyl Coenzyme Α)進入三羧酸循環，同時，乙酰輔酶A也是真菌生物合成脫落酸的甲羥戊酸(Mevalonic acid, MVA)途徑的重要前體，因此，一定程度增加發酵體系中乙酰輔酶A的濃度，有利于脫落酸的合成。吐溫-20(聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯，Tween-20)，分子式與分子量
3C58H114(^6，1227. 5，非離子表面活性劑，對發酵液中某些成份尤其油脂成份，具有乳化、擴散、增溶、穩定等作用，能較好改善發酵液溶氧狀況，提高菌體對溶氧的利用率，從而提高脫落酸產量，降低能耗和成本。本發明人還利用微生物分子遺傳學技術，如基因組改組(重排)技術、基因定向誘變技術等，對天然脫落酸產生菌株灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea) TB_3_A3 (譚紅等，利用原生質體誘變技術篩選脫落酸高產菌株，應用與環境生物學報1998,4(3) =281-285)進行遺傳改良，經過大量的菌種選育工作，獲得一株能較好利用乙酰輔酶A、天然脫落酸產量提高幅度較大的菌株TBC-20。本發明人利用葡萄孢霉屬(Botrytis)菌株，(例如，灰葡萄孢霉Botrytis cinerea)，尤其是灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)遺傳改良菌株TBC-20，發酵生產脫落酸，在發酵工藝中將乙酰輔酶A和吐溫-20分別作為前體物質和表面活性劑加入發酵體系， 發現能有效提高脫落酸的產量，從而完成了本發明。本發明的目的是提供一種通過流加乙酰輔酶A(Acetyl Coenzyme A)作為菌株合成脫落酸的前體物質，同時，添加表面活性劑吐溫-20改善發酵液溶氧狀況，發酵生產脫落酸的方法。本發明的另一目的是提供一種用于產生天然脫落酸的新菌株。更具體地說，本發明提供一種發酵制備天然脫落酸的新方法，它包含如下步驟將能夠產生天然脫落酸的真菌在一級液體培養基(例如，下文所述的培養基A) 中培養，制得第一級種子液，所述的真菌選自葡萄孢霉屬(Botrytis)(例如，灰葡萄孢霉 Botrytis cinerea)及上述菌株的遺傳改良菌等；將在上述第一級液體培養基中培養好的第一級種子液接種到第二級液體培養基 (例如，下文所述的培養基B)中培養，制得第二級種子液；將在上述第二級液體培養基中培養得到的第二級種子液接種到第三級液體培養基(例如，下文中所述的培養基C)中培養12-72小時后，加入表面活性劑吐溫-20以改善發酵液溶氧狀況，并開始進行第三級液體培養基流加補料發酵培養，同時流加乙酰輔酶A作為菌株合成脫落酸的前體物質，提高脫落酸的產量。從上述發酵培養液中收集所得的脫落酸。本發明的具體實施方案是，采用產生天然脫落酸的葡萄孢霉屬菌株或其遺傳改良菌，在液體培養基中進行三級發酵培養，在每級發酵階段選用不同的培養基。在第三級發酵中，以適合于第三級發酵的液體培養基，例如下文中描述的培養基C，作為發酵培養基， 230C 溫度下培養12-72小時后，加入生物表面活性劑吐溫_20，開始液體培養基流加補料，并同時流加乙酰輔酶A。第三級液體培養基(例如培養基C)流加補料方式可以采用連續(勻速或非勻速) 流加和/或間歇式流加方式，間歇流加方式是優選的。乙酰輔酶A流加方式可以采用連續(勻速或非勻速)流加和/或間歇式流加方式， 連續(勻速或非勻速)流加方式是優選的。所述的連續(勻速或非勻速)流加方式，是以(XOl-IOmgA^h(勻速或非勻速) 將濃度100U/mg-500U/mg的乙酰輔酶A，連續流加入第三級發酵罐，直至停止發酵(下罐) 前例如大約50小時。
所述的間歇式流加方式，是以間隔一段時間加一次料的方式，間歇式將100U/ mg-500U/mg濃度的乙酰輔酶A，流加入第三級發酵罐。間歇時間優選為每隔2_30小時補料 1-5次，更優選為大約間隔5小時補料1次。本領域技術人員也可根據需要，采用其它的適合時間間隔補料流加。發酵條件溫度23°C -29°C，pH :4_7發酵時間8-11天。采用本發明工藝，通過流加一定濃度的乙酰輔酶A，作為菌株合成脫落酸的前體物質，同時，添加生物表面活性劑吐溫-20改善發酵液溶氧狀況，提高菌株對氧的利用效率和產酸率，降低能耗，從而降低生產成本。發酵培養液中的脫落酸用常規方式回收，例如采用有機溶劑萃取法、薄膜過濾法、離子交換樹脂法、大孔吸附樹脂法、硅膠柱層析法及活性碳吸附法等提取后，即得白色或淡黃色結晶脫落酸；按照下述文獻中提供的脫落酸立體化學結構鑒定方法，確定為天然脫落酸譚紅等，利用原生質體誘變技術篩選脫落酸高產菌株，應用與環境生物學報1998，4 (3) :281-285。在優選的具體實施方案中，本發明還采用例如新菌株等技術方案來進一步提高天然落脫酸的產量。本發明方法可以采用已知的產生天然脫落酸的菌株，例如，已知的、或由微生物遺傳工程方法獲得的產生天然脫落酸的葡萄孢霉屬菌株(例如，灰葡萄孢霉Botrytis cinerea)或其遺傳改良菌。在優選的本發明方法中，使用已知的產生脫落酸的高產菌種， 例如 Botrytiscinerea ΤΒ-3_Η8、ΤΒΙ_9 (CGMCC No. 0500,已在專利 ZL00132024. 6 中公開)、 TBC-10 (CGMCC No. 1889，已在專利 2007100(^609. 2 中公開)、Ferm Ρ-6156，B. C. FD338 等。 在最優選的本發明方法中使用新菌株脫落酸高產菌株灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea) TBC-20，其已在2011年3月9日保藏于北京市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微生物研究所(郵編610041)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為 CGMCC No. 4645，該菌株是將灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea) TB-3-A3采用微生物分子遺傳學技術，如基因組改組(重排)技術、基因定向誘變技術等，獲得的遺傳改良菌株。本發明工藝過程采用三級發酵技術，采用三級發酵來制備脫落酸是已知的(參見，例如，CN1182798A, ZL00132024. 6)。根據三級發酵的不同要求，分別選擇三種不同的培養基來進行發酵，這些培養基可以是本領域技術人員已知的適合于此目的的培養基或是發明專利ZL00132024. 6中公開的培養基。使用發明專利ZL00132024. 6中公開培養基是優選的。發明專利ZL001320M.6中公開了培養基A、B、C，其具體組成如下培養基A
權利要求
1.一種高效制備天然脫落酸的方法，其特征是采用灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea) TBC-20, CGMCC No. 4645 作為發酵菌種。
2.一種高效制備天然脫落酸的方法，其特征是發酵過程中添加乙酰輔酶A。
3.一種高效制備天然脫落酸的方法，其特征是發酵過程中添加吐溫-20。
4.一種高效制備天然脫落酸的方法，其特征是采用灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea) TBC-20, CGMCC No. 4645，在第一級液體培養基中培養，將在第一級液體培養基中培養好的第一級種子液接種到第二級液體培養基上進行培養；將在上述第二級液體培養基中培養得到的第二級種子液接種到第三級液體培養基中，在發酵培養12-72小時后，加入吐溫-20，開始進行第三級液體培養基流加補料，并同時流加乙酰輔酶A發酵培養；從上述發酵培養液中收集所得的脫落酸。
5.根據權利要求4所述的高效制備天然脫落酸的方法，其特征是所述的流加乙酰輔酶A流加補料為連續流加和/或間歇式流加方式；吐溫-20為一次性加入。
6.根據權利要求5所述的高效制備天然脫落酸的方法，其特征是所述的連續流加為勻速或非勻速流加。
7.根據權利要求5所述的高效制備天然脫落酸的方法，其特征是所述的連續流加方式是以0. 01-10mg/L · h的流加速率將濃度為100U/mg-500U/mg的乙酰輔酶A連續流加入第三級發酵罐，直至停止發酵前50小時。
8.根據權利要求5所述的高效制備天然脫落酸的方法，其特征是所述的間歇式流加乙酰輔酶A方式，是每間歇2-30小時補料1-5次濃度為100U/mg-500U/mg的乙酰輔酶A。
9.根據權利要求8所述的高效制備天然脫落酸的方法，其特征是所述的間歇式流加乙酰輔酶A方式是每間隔5小時補料1次濃度為100U/mg-500U/mg的乙酰輔酶A，每次補加量為0.01-10. Omg/L發酵液。
10.根據權利要求5所述的高效制備天然脫落酸的方法，其特征是所述的吐溫-20添加方式采用一次性加入，加入量為發酵液體積的0. 01% -5. 0%。
全文摘要
本發明屬于微生物發酵技術領域，涉及一種在發酵過程中流加乙酰輔酶A作為菌株合成脫落酸的前體物質，同時，添加生物表面活性劑吐溫-20改善發酵液溶氧狀況來制備天然脫落酸的方法。該方法包括下列步驟將能夠產生天然脫落酸的真菌在第一級液體培養基中培養；將培養好的第一級種子液接種于第二級液體培養基上培養；在第三級液體培養基中流加補料，并同時加入吐溫-20和流加乙酰輔酶A進行發酵培養；以及從發酵培養液中收集所得的脫落酸。本發明方法可提高菌株對氧的利用效率和產酸率，使菌株以較高的底物轉化率和產物合成速率生產脫落酸，提高了產量和生產效率，降低能耗，從而降低生產成本。
文檔編號C12P7/42GK102399827SQ20111036994
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月18日 優先權日2011年11月18日
發明者周金燕, 楊杰, 肖亮, 譚紅, 鐘娟 申請人:中國科學院成都生物研究所