專利名稱：一種單管定性并定量檢測多個目標核酸序列的方法
技術領域：
本發明涉及一種將實時熒光定量PCR技術與探針熔解曲線技術結合使用的中通量實時熒光定量PCR檢測方法，其主要特征為在能夠在識別多個目標對象的基礎上同時進行定量檢測。本發明屬于生物技術領域。
背景技術：
由于核酸是生物的基本遺傳物質，因此核酸序列的識別與定量是分子生物學研究中一項非常重要的技術。目前核酸序列的識別或定量技術主要有以下幾類(1)核酸測序技術；(2)固相雜交技術；(3)普通PCR產物分析技術；(4)實時熒光PCR技術。核酸測序技術被認為是目前核酸序列識別的金標準技術。由于在單一檢測對象的情況下具有高度的準確性和序列信息的完整性，因此在基礎研究中被用于探索未知核酸序列和鑒定其他檢測方法可靠性的主要技術。不過核酸測序技術的檢測成本較高，對此1998 年Mostafa Ronaghi等在《Science》上報導了一種新型的焦磷酸測序技術降低了測序成本不過對于核酸序列的檢測長度也隨之下降。測序技術同時也存在以下幾個缺點要求待檢標本必須具備一定的純度和濃度；無法進行定量檢測；核酸樣品中同時存在兩個或多個近似序列時會出現套峰從而影響結果準確性。固相雜交技術是目前核酸序列識別一種常用的技術，該類技術通過互補核酸序列特異性結合能力將特定核酸序列捕獲在固相載體上，從而實現核酸序列的特異識別。該技術具有成本適中、操作流程成熟并且耐臨床標本中的雜質等優點，所以為目前許多公司所采用，例如Roche公司的Linear array系列試劑盒，Innogenetics公司的LIPA系列試劑盒以及Qiagen公司的HC-II試劑盒。通過改進固相載體的類型可以大幅度提高固相雜交技術的檢測通量例如基因芯片技術以及Luminex公司的流式液相芯片技術，不過這些新型的固相載體所耗費的成本都比較高。固相雜交技術雖然技術成熟并且檢測通量高，但是操作步驟較為繁瑣并且無法進行定量檢測。由于單純的固相雜交技術的檢測靈敏度并不高， 因此在實際應用中常常需要和PCR擴增技術進行聯用。普通PCR產物分析技術是目前科學研究中廣泛應用的核酸序列識別技術。PCR技術能夠快速復制出大量相同序列DNA片段因此具備有很高的檢測靈敏度。通過合理設計特異引物可以只對樣品特定的核酸序列進行擴增，通過電泳技術對PCR產物的長度進行判斷，即可判斷樣品中是帶有何種核酸序列。質譜技術擁有比電泳高的多的分辨率，因此還可分析相同長度的PCR產物中的堿基突變情況(MS Bray文章)。不過普通PCR技術需要進行 PCR后處理才能獲得PCR產物的信息，因此容易造成PCR產物的污染現象。而實時熒光PCR 技術的出現彌補了這一缺陷。實時熒光PCR技術是目前核酸序列檢測的一個重要方法，該技術不僅可以識別特定核酸序列而且可以確定特定核酸序列的濃度。由于該技術具有靈敏度高、特異性好、耗時短、無需PCR后處理以及操作簡便等優點，在科研工作中被廣泛使用。不過由于實時熒光 PCR儀的檢測通道數量的限制，傳統的實時熒光PCR技術的檢測通量并不高。目前市面上主流的實時熒光PCR的檢測通道一般只有2-6個，導致該技術無法單管同步檢測較多的目標核酸序列。因此采用各種方法提高實時熒光PCR技術檢測通量成為科研工作者的研究熱
點ο綜上所述，雖然目前國內外已有多種核酸序列識別與定量的檢測技術，但都具有一定的局限性，所以有必要開發一種既能定量又能定性、高通量、操作簡單而且低成本的核酸序列檢測技術。

發明內容
本發明的主要目的是設計一種新型的實時熒光PCR探針熔解曲線DNA分型技術。本發明的技術方案如下一種單管定性并定量檢測多個目標核酸序列的方法，包括如下步驟(1)在目標對象基因序列中選取相對保守的區域設計通用擴增引物；(2)在擴增片段中選取差異度較大的區域設計能夠識別各種目標核酸序列的特異探針，在探針設計過程中通過調整探針的長度和/或探針堿基的組成對每條探針的熔點 (Tm)值進行人為控制，使得同一檢測通道內針對不同目標序列的檢測探針Tm值都間隔合適的差值；同時設計多個檢測通道；(3)通過熔點曲線分析分辨靶序列。更佳地，在檢測目標核酸序列時，還增加一個檢測通道用于檢測體系內標的熔解曲線信號以保證體系的有效性。在本發明中，所述的檢測通道即儀器對不同的熒光基團的分辨能力。可使用的檢測熒光探針類型的數量由實時熒光PCR儀器的熒光信號采集通道數量所決定。現有的實時熒光PCR儀器通常可以同時檢測2-6個不同熒光染料，因此，根據靶序列的數量，檢測通道可以設計為2-6個。在本發明中，所述的熒光基團類型包括但不限于ALEX-350、FAM、VIC、ΤΕΤ、CAL Fluor Gold 540、JOE、HEX、CAL Flour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Flour Red 635、Quasar 670、CY3, CY5、CY5. 5 或 Quasar 705 ；用于以上熒光基團的淬滅基團包括但不限于DABCYL、BHQ、ECLIPSE或TAMRA。在本發明中，同一檢測通道相鄰探針的Tm值的間隔差值可以是相同的或是不同的，不同檢測通道探針的Tm值間隔差值可以是相同的或是不同的。在本發明中，Tm值的間隔范圍由實時熒光PCR儀器的熔解曲線分辨能力所決定。 一般地，同一檢測通道探針的Tm值的間隔差值可以為1°C -15°C。更佳地，同一檢測通道探針的Tm值的間隔差值為3°C _8°C。在本發明中，較佳地，所述探針長度為18bp到50bp。在本發明中，較佳地，探針G+C堿基的含量30% -60%。本發明的技術原理如下如圖1所示，本發明首先在目標對象基因序列中選取相對保守的區域設計通用擴增引物。然后在引物擴增產物中選取差異度較大的區域設計能夠識別各種目標核酸序列的特異探針，在探針設計過程中本發明通過調整探針的長度(18bp 至Ij50bp)和探針G+C堿基的含量(30%到60%)對每條探針的熔點溫度(Tm值)進行人為控制，使得同一檢測通道內針對不同目標序列的檢測探針Tm值都間隔合適的差值，Tm值的間隔范圍由實時熒光PCR儀器的熔解曲線分辨能力所決定。本發明在檢測目標核酸序列時，特別增加一個檢測通道用于檢測體系內標的熔解曲線信號以保證體系的有效性。最后通過調整PCR擴增體系和PCR擴增程序中的各項條件，使得熔解曲線信號達到最佳本發明的另一目的是提供使用不同長度(或堿基組成)探針造成熔解曲線的Tm值差異達到單個熒光通道多重檢測的理念。本發明通過探針長度的變化調節探針熔解曲線的Tm值，使得每一個Tm值對應一個目標DNA序列，實現對目標序列的定性檢測；通過定制每種目標序列的實時熒光PCR擴增 Ct值工作曲線，實現對每個目標序列的定性檢測；同時通過比較不同目標序列和探針產生的熔解曲線峰值高低，實現對多重目標序列間的比例判斷。本發明通過實時熒光定量PCR 技術與探針熔解曲線技術聯用使得定性檢測與定量檢測有機結合。本發明根據探針熔解曲線峰值相對比較確定多重目標DNA序列間的比例關系。本發明技術具有以下優點⑴由于利用同一熒光染料標記的檢測探針間Tm值的差異使得檢測通量相對于傳統實時熒光PCR技術提高了數倍，同時還保證了相同的檢測靈敏度；( 由于單管中分別用Tm值和Ct值進行定性和定量的檢測，該技術具有很高的檢測準確率；(3)由于能夠單管同時平行檢測多種型的靶序列，大大減少了檢測技術的操作量和檢測成本。(4)該技術可以通過單管一次反應同時得到定性檢測、定量檢測和混合感染檢測三重結果，而所需的檢測時間與傳統實時熒光PCR技術基本相同。(5)該技術比起傳統的熒光PCR技術具有良好的型間多態性位點耐受能力。


圖1為本發明的技術原理圖；圖2為本發明實施例一的檢測結果；圖3為本發明實施例二的檢測結果；圖4為本發明實施例三的檢測結果；圖5為本發明實施例四的檢測結果。
具體實施例方式為了對本發明進行進一步的說明，我們以下實施例的方式進行闡述。以下實施例均使用ABI7500實時熒光PCR儀完成擴增曲線和熔解曲線的檢測。檢測體系1*PCRbuffer、2. 5mM 鎂離子、IU Taq DNA 聚合酶、200μΜ dNTP, Ipmol 上游引物，20pmol下游引物，5pmol檢測探針。檢測程序95°C預變性3分鐘；95°C變性10秒，48°C退火15秒，72°C退火20秒，并于48°C退火時檢測熒光，重復45個循環；40°C _85°C熔解曲線分析，每隔1°C檢測一次熒光信號。實施例一單管三色體系定性檢測10種HPV型別的陽性質粒標準品和內標基因。實驗流程如下(1)陽性質粒構建根據 NCBI gene bank(http//www. ncbi. nlm. nih. gov)上的 HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-58, HPV-59, HPV-68, HPV-73, HPV-82 這 10 種HPV 基因型在 GP5+/GP6+ 引物(序列如下，GP5+ :5，-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3，，GP6+ 5，-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3’ )擴增區內的DNA序列以及內標人源β-globin基因部分DNA序列進行DNA序列合成，并插入pUC57質粒載體的SmaI克隆位點中。10種HPV型別的檢測探針及相對于的Tm值溫度如表一所示。O)PCR擴增與熔解曲線分析檢測PCR擴增及熔解曲線分析的體系如前面所述， 每個反應體系中加入的標本量為1*106拷貝/微升的不同型別的HPV標準品質粒及內標標準品質粒5微升，檢測程序如前面所述。(3)結果判讀如圖1所示，根據每種HPV型別在特定的檢測通道特征Tm值即可判讀樣品中所攜帶的HPV型別；如果只有內標檢測信號而沒有HPV型別特征峰則說明樣品中不攜帶這10種HPV型別；如果既沒有內標檢測信號也沒有HPV型別檢測信號則說明PCR 擴增失敗。如圖2所示，該檢測體系對10種HPV型別的都可檢測出特異的熔解曲線檢測信號，而且各個HPV型別間不存在交叉檢出的現象，陰性對照中則只有內標β-globin基因的熔解曲線檢測信號。表一 10種HPV型別的檢測探針及相對應的Tm值溫度
權利要求
1.一種單管定性并定量檢測多個目標核酸序列的方法，包括如下步驟(1)在目標對象基因序列中選取相對保守的區域設計通用擴增引物；(2)在引物擴增產物中選取差異度較大的區域設計能夠識別各種目標核酸序列的特異探針，同時設計多個檢測通道，將探針設計為多組，每組的探針配備相同的熒光基團作為一個檢測通道，在探針設計過程中通過調整探針的長度和/或探針的堿基組成對每條探針的熔點值進行人為控制，使得同一檢測通道內針對不同目標序列的檢測探針Tm值都間隔合適的差值；(3)通過熔點曲線分析分辨靶序列。
2.如權利要求1所述的一種單管定性并定量檢測多個目標核酸序列的方法，其特征在于在檢測目標核酸序列時，還增加一個檢測通道，用于檢測體系內標的熔解曲線信號以保證體系的有效性。
3.如權利要求1所述的一種單管定性并定量檢測多個目標核酸序列的方法，其特征在于所述的探針為熒光標記探針。
4.如權利要求1或2所述的一種單管定性并定量檢測多個目標核酸序列的方法，其特征在于所述的檢測通道為2-6個。
5.如權利要求1所述的一種單管定性并定量檢測多個目標核酸序列的方法，其特征在于同一檢測通道相鄰探針的Tm值的間隔差值可以是相同的或是不同的，不同檢測通道探針的Tm值間隔差值可以是相同的或是不同的。
6.如權利要求1所述的一種單管定性并定量檢測多個目標核酸序列的方法，其特征在于同一檢測通道探針的Tm值的間隔差值為1°C -15°C。
7.如權利要求1所述的一種單管定性并定量檢測多個目標核酸序列的方法，其特征在于所述的Tm值的間隔差值為2V _8°C。
8.如權利要求1所述的一種單管定性并定量檢測多個目標核酸序列的方法，其特征在于所述探針長度為18bp到50bp。
9.如權利要求1所述的一種單管定性并定量檢測多個目標核酸序列的方法，其特征在于探針G+C堿基的含量30% -60%。
全文摘要
本發明公開了一種單管定性并定量檢測多個目標核酸序列的方法，其包括如下步驟(1)在目標對象基因序列中選取相對保守的區域設計通用擴增引物；(2)在引物擴增產物中選取差異度較大的區域設計能夠識別各種目標核酸序列的特異探針，同時設計多個檢測通道，將探針設計為多組，每組的探針配備相同的熒光基團作為一個檢測通道，在探針設計過程中通過調整探針的長度和/或探針的堿基組成對每條探針的熔點(Tm)值進行人為控制，使得同一檢測通道內針對不同目標序列的檢測探針Tm值都間隔合適的差值；(3)通過熔點曲線分析分辨靶序列。本發明單個反應管內的每個熒光通道均可定性檢測多個目標核酸序列；同時能夠確定各個目標核酸序列的拷貝數；在多個目標序列共存的情況下能夠判斷目標序列間的比例。
文檔編號C12Q1/68GK102559868SQ201110386430
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月28日 優先權日2011年11月28日
發明者廖逸群, 李慶閣 申請人:廈門大學