專利名稱：聚合酶鏈式反應鑒別熊膽粉真偽的方法
技術領域：
本發明為一種聚合酶鏈式反應鑒別熊膽粉真偽的方法。
背景技術：
熊膽因珍稀名貴，市場價格昂貴，市場常有以雞、牛、羊、豬膽汁干燥加工成粉混充熊膽粉出售現象，摻假現象極為嚴重。熊膽粉摻假除影響藥品本身質量外，更重要的是影響中藥的療效及配伍而給患者造成不良后果，所以熊膽粉及其制劑真偽的鑒別在實際中擁有重要的意義。由于中成藥的組成及成分復雜，干擾因素多，用傳統生藥學方法鑒定其真偽及純度有較大的難度。而DNA水平上鑒定打破了中藥常規鑒定的界限，可以從生物的種或種以下水平進行準確地鑒定，不受組織或藥材部位對鑒定的影響，因而對于準確、合理、安全用藥、保障患者的權益具有重要意義。
發明內容
本發明的目的在于解決上述現有所存在的問題，提供一種分辨力強、重現性好的一種聚合酶鏈式反應鑒別熊膽粉真偽的方法。本發明的具體方法如下
a、樣品(熊膽粉與偽品)的基因組提取方法
取熊膽粉2克，偽品雞、羊、牛、豬膽汁干燥品各2克，放入各自的試管中，采用酚-氯仿-異戊醇抽提方法對其基因組DNA進行提取。b、用于擴增的樣品的聚合酶鏈式反應引物上游引物5’ CGCCATGAACCCTCCCTCTA 3’
下游引物5’ CCTGGGCAGTGAATCCCTCTT 3’ c、用于擴增的聚合酶鏈式反應體系和擴增條件
在反應體系中取50ng/ μ 1樣品的DNA模板2 μ 1，10倍緩沖液2 μ 1，2. 5mM的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 2 μ 1，上游引物5’ CGCCATGAACCCTCCCTCTA 3’ 1 μ 1，下游引物5， CCTGGGCAGTGAATCCCTCTT 3’ 1 μ 1，聚合酶0. 2 μ 1放入試管中，用滅菌去離子水補充至25 μ 1。其擴增條件94. O0C 8分鐘；之后；35個循環包括94. 0°C 1分鐘，58. 6°C 1 分鐘，72.0°C 2分鐘，最后72.0°C 10分鐘35個循環；得到聚合酶鏈式反應擴增產物。d、聚合酶鏈式反應擴增產物的檢測方法
在水平電泳槽中制備其濃度1. 5%瓊脂糖凝膠；將上述聚合酶鏈式反應擴增產物5μ1 加入點樣孔，在對比孔中加入5 μ 分子量標準2000型作為對比；電壓120 V，電泳40min 后在圖譜成像系統中成像。e、通過電泳圖譜判斷熊膽樣品的真偽。本發明的有益效果是
該方法不僅可以對來源相近的正品與混淆品進行區別，而且可以對干燥加工成粉熊膽粉進行鑒別。熊膽粉是熊分泌物，很難由藥材推逆原動物的品種與質量，而來源相近的正品與混淆品則更不易區分。因此，很多傳統的中藥鑒定方法無法解決目前許多動物類中藥的鑒別問題。用本方法進行中藥材DNA分子標記鑒別，只需取極少量的樣品即可提得足夠用于多聚酶鏈反應(PCR)擴增的DNA模板，然后進行鑒別判定。該方法速度快、分辨力強、重現性好，可以澄清熊膽及其粉劑的真偽和優劣(涉及劑量、比例)，彌補傳統中藥鑒定中動物類中藥鑒別的弱項，為臨床合理用藥提供科學依據。該技術的運用是提高中藥材的質量，保障千百萬人民身體健康和生命的安危、保障中醫療效的基礎；可以有效的遏制偽造、摻假、濫用、誤用、混用等現象，提高中醫藥的信譽，保障人民用藥安全，其經濟效益不言而喻的。附表熊膽粉與偽品擴增后的結果
權利要求
1. 一種聚合酶鏈式反應鑒別熊膽粉真偽的方法，其特征在于，a、樣品的基因組提取方法取熊膽粉2克，偽品雞、羊、牛、豬膽汁干燥品各2克，放入各自的試管中，采用酚-氯仿-異戊醇抽提方法對其基因組DNA進行提取；b、用于擴增的樣品的聚合酶鏈式反應引物上游引物5’ CGCCATGAACCCTCCCTCTA 3’下游引物5’ CCTGGGCAGTGAATCCCTCTT 3’c、用于擴增的聚合酶鏈式反應體系和擴增條件在反應體系中取50ng/μ 1樣品的DNA模板2 μ 1，10倍緩沖液 2μ1，2. 5mM的脫氧核糖核苷三磷酸2 μ 1，上游引物5’ CGCCATGAACCCTCCCTCTA 3’ 1μ 1,下游引物5’ CCTGGGCAGTGAATCCCTCTT 3’ 1 μ 1，聚合酶0. 2 μ 1放入試管中，用滅菌去離子水補充至 25μ 1 ；其擴增條件94. O0C 8分鐘；之后35個循環包括94. 0°C 1分鐘，58. 6V 1分鐘， 72. O0C 2分鐘，最后72. O0C 10分鐘；得到聚合酶鏈式反應擴增產物；d、聚合酶鏈式反應擴增產物的檢測方法在水平電泳槽中制備其濃度1. 5%瓊脂糖凝膠；將上述聚合酶鏈式反應擴增產物5μ1 加入點樣孔，在對比孔中加入5 μ 分子量標準2000型作為對比；電壓120 V，電泳40min 后在圖譜成像系統中成像；e、通過電泳圖譜判斷熊膽樣品的真偽。
全文摘要
本發明為一種聚合酶鏈式反應鑒別熊膽粉真偽的方法，包括樣品的基因組提取，用于擴增的樣品的聚合酶鏈式反應引物，及擴增的聚合酶鏈式反應體系和擴增條件和擴增結果，聚合酶鏈式反應擴增產物的檢測系統來鑒別熊膽粉樣品的真偽；該鑒別方法簡單可靠，減少假冒偽劣的中藥材熊膽及其熊膽粉給患者造成的不良后果，對于提高中藥質量，保障群眾用藥安全以及更好地開拓中藥的國內外市場等方面都具有十分重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK102363817SQ20111038962
公開日2012年2月29日 申請日期2011年11月30日 優先權日2011年11月30日
發明者張敏, 田玉民, 蘇玉虹 申請人:遼寧醫學院