專利名稱：一種檢測長鏈非編碼rna-hotairm1的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種人長鏈非編碼RNA-H0TAIRM1檢測方法。
背景技術：
長鏈非編碼RNA (IncRNA)是一類長度大于200核苷酸的RNA分子，不具備編碼蛋白質的功能的轉錄產物；最初被認為是基因組轉錄的“噪音”，RNA聚合酶II轉錄的副產物， 不具有任何生物學功能。然而哺乳動物整個基因組普遍轉錄成轉錄本，但這些轉錄本中僅有很小一部分為編碼蛋白質的mRNA，大部分為非編碼RNA。非編碼RNA包括結構RNA (如 tRNA、rRNA和snRNA)、近年來成為研究熱點的調節RNA (microRNA和siRNA)，以及最近科學界關注的IncRNA ；在這些非編碼RNA轉錄本中IncRNA占近80%，而且許多IncRNA具有 mRNA樣結構，經過剪切加工具有PolyA尾樣結構，分化過程中出現動態表達和不同的剪切形式，呈現出時間特異和空間特異的表達方式，這些現象表明IncRNA的表達與降解在生物體內有著精細的調控機制。因此，IncRNA作為轉錄“噪音”和副產物的假說應該重新思考， IncRNA表達不僅在胚胎干細胞分化過程中特征性表達，而且在腦細胞中存在特定的亞細胞定位，同時這些IncRNA表達存在組織器官特異性。盡管僅有一小部分長鏈非編碼RNA功能被闡釋，但可以推測IncRNA通過某種機制參與了各種生物學功能，通過表觀遺傳學修飾、 轉錄和翻譯調控以及剪切拼接控制細胞周期、分化和凋亡等發揮生物學作用。顯而易見， IncRNA必定與疾病的發生發展機制密切相關，目前已經有報道表明腫瘤中存在差異表達的IncRNA，例如乳腺癌中HOTA^表達升高，MALAT在肺癌和結直腸癌中過表達以及肝癌中 HULC水平上升等。H0TAIRM1是最近發現的位于HOXAl和H0XA2基因間的長鏈非編碼RNA， 可能與造血系統中髓系細胞的發育和分化有關，而且在胎腦中也檢測除其表達，并參與神經分化。

發明內容
本發明目的是提供一種檢測長鏈非編碼RNA-H0TAIRM1的方法，是根據長鏈非編碼RNA-H0TAIRM1的基因序列以及內參基因GAPDH的基因序列設計并合成外側引物、內側引物和熒光探針，并利用這兩套引物和探針特異性檢測H0TAIRM1在血漿中的相對表達。本發明采用實時熒光PCR方法檢測一種長鏈非編碼RNA-H0TAIRM1，主要包括特異性外側引物、內側引物和熒光探針、逆轉錄試劑和熒光PCR試劑，通過以下步驟實現
(1)采用RNA抽提試劑提取組織和血漿中總RNA，DNaseI去除基因組DNA后采用逆轉錄試劑進行逆轉錄合成cDNA ；
(2)分別以H0TAIRM1和GAPDH的外側引物按照以下PCR反應體系配制反應液1XPCR buffer,0. 1 μ M的外側上下游引物引物、IU的DNA聚合酶、0. 2mM的dNTPs，取2 μ L的cDNA 模板，反應體積為20yL ；按照95°C變性5分鐘，95°C 30秒、55°C 30秒，72°C 30秒進行15 個循環預擴增。(3)取2. 0 μ L預擴增產物加入如下PCR反應液中1 XTaqMan通用PCR緩沖液，0. 2 μ M的內側上下游引物引物和0. 1 μ M的熒光探針，反應體積為10 μ L ；按照95°C變性2 分鐘，95°C 15秒、60°C 1分鐘，擴增40個循環；
(4)根據熒光曲線讀取Ct值，按照下述公式計算H0TAIRM1的相對表達量H0TAIRM1相對表達量=2 ( Δ Ct=Ct hotaieu — Ct GAPDH)o所述特異性內外側引物和熒光探針的序列分別如下 H0TAIRM1外側引物
outer-hotiarml-F GCTGGAGCGAAGAAGAGCAA, outer-hotiarml-R CAAACACCCACATTTCAACCC ； H0TAIRM1內側引物
inner-hotiarml-F GAACTGGCGAGAGGTCTGTTTT, inner-hotiarml-R CCCCATAAATCCCTCCACATT ； H0TAIRM1熒光探針
hotiarml-probe FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA。GAPDH外側引物 outer-gapdh-F GGCGCTGAGTACGTCGTGGA, outer-gapdh-R GTGGTGCAGGAGGCATTGCTGAT ； GAPDH內側引物
inner-gapdh-F GCGTCTTCACCACCATGGA, inner-gapdh-R TGGTTCACACCCATGACGAA ； GAPDH熒光探針為
hotiarml-probe FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA。其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。為了證實本發明建立的檢測血漿H0TAIRM1相對表達方法的有效性和實用性， 本發明檢測了結直腸癌患者腫瘤組織和血漿中H0TAIRM1相對表達量。結果表明該方法能夠有效地檢測組織和血漿中H0TAIRM1的相對表達水平；而且在結直腸癌腫瘤組織中 H0TAIRM1水平明顯低于正常對照組織；結直腸癌患者血漿H0TAIRM1水平也明顯低于正常對照組，將血漿中H0TAIRM1水平的cutoff值定在0. 003，則其診斷結直腸癌的靈敏度為 61. 46%，特異性為80. 30%, ROC曲線分析后AUC值為0. 780。以上結果表明在組織中的低表達以及血漿中的低水平H0TAIRM1可能成為新的結直腸癌診斷標志物。本發明關鍵在于特異性內側引物和熒光探針序列的設計，該檢測方法中其他組成均為本領域常規試劑，采用該方法對血漿中H0TAIRM1進行相對定量檢測。本發明提供的方法，通過設計H0TAIRM1特異性內側引物和熒光探針序列，建立了檢測血漿H0TAIRM1相對表達方法，經過研究，結果表明H0TAIRM1在正常結直腸粘膜組織中呈陽性表達，而且在胃癌組織和胃癌患者血漿中卻表現為低表達，這些現象表明H0TAIRM1 可能做為結直腸癌診斷的新的腫瘤標志物，證實該方法具有實用性和有效性，對進一步研究H0TAIRM1在腫瘤中的表達和建立準確特異檢測方法具有重要的意義。


圖1為使用該方法檢測組織中GAPDH的熒光曲線。
圖2為使用該方法檢測組織中H0TAIRM1的熒光曲線。圖3為使用該方法檢測血漿中GAPDH的熒光曲線。圖4為使用該方法檢測血漿中H0TAIRM1的熒光曲線。圖5為在109例結直腸癌組織中H0TAIRM1的表達明顯低于配對正常組織， P=Q. (^67。圖6為55例結腸癌中有43例癌組織H0TAIRM1低表達，54例直腸癌中有41例癌組織H0TAIRM1低表達。圖7為結直腸癌患者血漿中H0TAIRM1水平，在150例結直腸癌患者血漿H0TAIRM1 水平也明顯低于和101例健康者的水平，/X0. 001。圖8為150例結直腸癌患者和101例健康者血漿H0TAIRM1水平的ROC曲線分析， AUC值為0. 780，臨界值設定為0. 003。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此。本發明中，以上所述和以下的實施例中，所使用的技術如PCR、RNA提取技術，除特殊說明外均為本領域研究技術人員已知的常規技術；所使用的儀器設備、試劑等除特殊說明外均為本領域的研究技術人員可以通過公共途徑獲得。實施例一
特異性引物和熒光探針的設計與合成
根據H0TAIRM1的核苷酸序列，采用I^rimer Express (V3. 0，美國ABI公司)軟件分析 TaqMan引物和探針位點，從中選擇最佳組合。檢測用PCR引物和探針序列如下 H0TAIRM1外側引物
outer-hotiarml-F GCTGGAGCGAAGAAGAGCAA, outer-hotiarml-R CAAACACCCACATTTCAACCC ； H0TAIRM1內側引物
inner-hotiarml-F GAACTGGCGAGAGGTCTGTTTT, inner-hotiarml-R CCCCATAAATCCCTCCACATT ； H0TAIRM1熒光探針
hotiarml-probe FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA。GAPDH外側引物 outer-gapdh-F GGCGCTGAGTACGTCGTGGA, outer-gapdh-R GTGGTGCAGGAGGCATTGCTGAT ； GAPDH內側引物
inner-gapdh-F GCGTCTTCACCACCATGGA, inner-gapdh-R TGGTTCACACCCATGACGAA ； GAPDH熒光探針為
hotiarml-probe FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA。其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。以上所有寡核苷酸均有 Invitrogen公司合成。
實施例二
組織和血漿中RNA提取及去除DNA
1.組織RNA提取組織RNA提取采用hvitrogen公司提供TRIzol試劑，完全按照試劑說明書進行操作。取200mg左右組織加入Iml TRIzol試劑，使用勻漿器研磨后氯仿萃取和異丙醇沉淀后備用。2.血漿RNA提取血漿RNA提取采用hvitrogen公司提供TRIzol-LS試劑，完全按照試劑說明書進行操作。取600 μ L血漿加入1. 8ml TRIzol-LS試劑，氯仿萃取和異丙醇沉淀后備用。3. DNA去除提取的總RNA采用QIAGEN公司提供的RNase-Free DNase Set去除基因組DNA，完全按照說明書進行操作。實施例三
長鏈非編碼RNA -H0TAIRM1的檢測
1.逆轉錄分別取IOOng總RNA采用TAKARA公司提供的PrimeScript RT Reagent Kit 進行逆轉錄反應，5 X RT buffer, 4. 0 μ L ；PrimeScript RT Enzyme Mix I,1.0yL ；Oligo dT (50uM)，1· 0 μ L ；Random 6 mers( 100 μ M)，1· 0 μ L，水補足至 20 μ L。37°C，15 分鐘；85°C， 5分鐘后取2. 0 μ L cDNA用于檢測H0TAIRM1。2.組織和血漿中H0TAIRM1水平的檢測采用TAKARA公司提供的PCR試劑按照下述配制PCR反應液=IXPCR buffer,0. 1 μ M的外側上下游引物引物(GAPDH或H0TAIRM1 )、 IU的DNA聚合酶、0. 2mM的dNTPs，取2. 0 μ L的cDNA模板，反應體積為20 μ L ；在ΑΒΙ2720 (ABI公司)PCR儀按照95°C變性5分鐘，95°C 30秒、55°C 30秒，72°C 30秒進行15個循環預擴增。取2. 0 μ L預擴增產物加入ABI公司提供的如下PCR反應液中1 X TaqMan Universal Master PCR Mix，0· 2 μ M的內側上下游引物引物(GAPDH或H0TAIRM1)禾口 0. 1 μ M的熒光探針(GAPDH或H0TAIRM1 )，反應體積為10 μ L ；在ΑΒΙ7900熒光PCR儀(ABI公司)上按照95°C 變性2分鐘，95°C 15秒、60°C 1分鐘，擴增40個循環。結果如圖1和圖2所示在組織中該方法能有效檢測組織中的H0TAITRM1和GAPDH的表達，圖1代表檢測組織中GAPDH的熒光擴增曲線，圖2代表檢測組織中H0TAITRM1的熒光擴增曲線；如圖3和圖4所示該方法同樣也能檢測血漿中H0TAITRM1和GAPDH水平，圖3代表檢測血漿中GAPDH的熒光擴增曲線，圖 4代表檢測血漿中H0TAITRM1的熒光擴增曲線。而且如圖5所示在109例結直腸癌腫瘤組織中H0TAIRM1水平明顯低于配對正常組織，/M). 0267 ；如圖6所示55例結腸癌中有43例在癌組織中低表達，討例直腸癌中有41例在癌組織中低表達。另外如圖7所示在150例結直腸癌患者血漿H0TAIRM1水平也明顯低于和101例健康者的水平，P<Q. 001 ；將血漿中 H0TAIRM1水平的臨界值如圖8所示設定為0. 003，則其診斷結直腸癌的靈敏度為61. 46%，特異性為80. 30%, ROC曲線分析后AUC值為0. 780。
權利要求
1.一種檢測長鏈非編碼RNA-H0TAIRM1的方法，通過以下步驟實現(1)采用RNA抽提試劑提取組織和血漿中總RNA，DNaseI去除基因組DNA后采用逆轉錄試劑進行逆轉錄合成cDNA ；(2)分別以H0TAIRM1和GAPDH的外側引物按照以下PCR反應體系配制反應液1XPCR buffer,0. 1 μ M的外側上下游引物引物、IU的DNA聚合酶、0. 2mM的dNTPs，取2 μ L的cDNA 模板，反應體積為20yL ；按照95°C變性5分鐘，95°C 30秒、55°C 30秒，72°C 30秒進行15 個循環預擴增；(3)取2.OyL預擴增產物加入如下PCR反應液中=IXTaqMan通用PCR緩沖液， 0. 2 μ M的內側上下游引物引物和0. 1 μ M的熒光探針，反應體積為10 μ L，按照95°C變性2 分鐘，95°C 15秒、60°C 1分鐘，擴增40個循環；(4)根據熒光曲線讀取Ct值，按照下述公式計算H0TAIRM1的相對表達量H0TAIRM1相對表達量=2 ( Δ Ct=Ct hotaieu — Ct GAPDH)；所述特異性內外側引物和熒光探針的序列分別如下 H0TAIRM1外側引物outer-hotiarml-F GCTGGAGCGAAGAAGAGCAA, outer-hotiarml-R CAAACACCCACATTTCAACCC ； H0TAIRM1內側引物inner-hotiarml-F GAACTGGCGAGAGGTCTGTTTT, inner-hotiarml-R CCCCATAAATCCCTCCACATT ； H0TAIRM1熒光探針hotiarml-probe FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA GAPDH外側引物outer-gapdh-F :GGCGCTGAGTACGTCGTGGA, outer-gapdh-R :GTGGTGCAGGAGGCATTGCTGAT ； GAPDH內側引物inner-gapdh-F :GCGTCTTCACCACCATGGA， inner-gapdh-R TGGTTCACACCCATGACGAA ； GAPDH熒光探針為hotiarml-probe: FAM-CCTGAACCCATCAACAGCTGGGAGA-TAMRA。
2.根據權利要求1所述的一種檢測長鏈非編碼RNA-H0TAIRM1的方法，其特征在于， FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。
全文摘要
本發明提供一種檢測長鏈非編碼RNA-HOTAIRM1的方法，根據長鏈非編碼RNA-HOTAIRM1的基因序列以及內參基因GAPDH的基因序列設計并合成外側引物、內側引物和熒光探針，并利用這兩套引物和探針特異性檢測HOTAIRM1在血漿中的相對表達。經過研究，結果表明HOTAIRM1在正常結直腸粘膜組織中呈陽性表達，而且在胃癌組織和胃癌患者血漿中卻表現為低表達，本發明對進一步研究HOTAIRM1在腫瘤中的表達和建立準確特異檢測方法具有指導意義。
文檔編號C12Q1/68GK102399889SQ20111039302
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月1日 優先權日2011年12月1日
發明者張紅河, 來茂德 申請人:浙江大學