專利名稱：一種紅霉素發酵液的發酵方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物發酵方法，特別涉及一種紅霉素的低糖低氮發酵方法，屬于醫藥生物技術領域。
背景技術：
紅霉素(Erythromycin)是 1952年從紅色鏈霉菌(Streptomyces erythreus)培養液中分離出來的一種堿性抗生素。紅霉素具有廣譜抗菌作用，對革蘭陽性菌、如葡萄球菌、 化膿性鏈球菌、綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌、糞鏈球菌、梭狀芽孢桿菌、白喉桿菌等有較強的抑制作用。對革蘭陰性菌、如淋球菌、螺旋桿菌、百日咳桿菌、布氏桿菌、軍團菌、以及流感嗜血桿菌、擬桿菌也有相當的抑制作用。我國從1957年試制成功并逐步投入大生產。目前，國內已有關于紅霉素發酵工藝的研究，如華東理工大學韓德全等人進行的紅霉素發酵工藝優化研究(2004年華東理工大學工程碩士學位論文)；中國專利說明書 CN101134972B中也描述了利用菌渣套用技術改進紅霉素的發酵工藝等，隨著高產菌株的投產及發酵方法的不斷改進，使發酵單位水平不斷提高，但仍然沒有解決原料消耗大，糖氮利用率低等問題。

發明內容
本發明的目的在于提供一種紅霉素發酵方法。本發明目的是通過如下技術方案實現的本發明所述的紅霉素發酵液的發酵方法包括如下步驟(1)紅霉素種子液培養①母斜面孢子制備將冷凍保存在砂土管中的紅霉素鏈霉菌(產生菌)孢子(本發明使用的紅霉素鏈霉菌為廣東省微生物菌種保藏中心商業上廣泛銷售的菌種，GIM編號GIM4. 14，其他編號AS4. 198)，接種于滅菌的斜面培養基上，在溫度32 34°C條件下，培養7 9天；②子斜面孢子制備將母斜面孢子，接種于滅菌的斜面培養基上，在溫度32 34°C條件下，培養7 9天；③種子培養將子斜面孢子，接種于滅菌的液體種子培養基中，經過三級種子擴大培養，得到紅霉素種子液；(2)紅霉素發酵將紅霉素種子液按10 20%體積比接種于滅菌的培養基中，通入無菌空氣并開啟攪拌，添加營養物質，在溫度32 34°C條件下，培養7 10天，得紅霉素發酵液。本發明所述的母斜面孢子培養基是由下述組分組成淀粉0. 1 1. 0重量份，玉米漿0. 05 0. 2重量份，瓊脂0. 1 1. 0重量份，葡萄糖0. 1 1. 0重量份，氯化鈉0. 5 2. 0重量份，氯化鈣0. 1 1. 0重量份，用自來水定容到100體積份。本發明所述的母斜面孢子培養基組分可以優化為淀粉0. 5重量份，玉米漿0. 1重量份，瓊脂0. 5重量份。葡萄糖0. 5重量份，氯化鈉1重量份，氯化鈣0. 5重量份，用自來水定容到100體積份。本發明所述的子斜面孢子培養基是由下述組分組成淀粉0. 1 1. 0重量份，玉米漿0. 05 0. 2重量份，瓊脂0. 1 1. 0重量份，葡萄糖0. 1 1. 0重量份，氯化鈉0. 5 2. 0重量份，氯化鈣0. 1 1. 0重量份，用自來水定容到100體積份。本發明所述的子斜面孢子培養基組分組成優化為淀粉0. 4重量份，玉米漿0. 2重量份，瓊脂0. 4重量份，葡萄糖0. 4重量份，氯化鈉1. 5重量份，氯化鈣1. 0重量份，用自來水定容到100體積份。本發明所述的一級種子擴大培養條件為⑴培養基組成黃豆粉2 4重量份， 淀粉1 2重量份，CaCO3O. 6 0. 8.重量份，糊精1 2重量份，硫銨0. 2 0. 4重量份，玉米漿1 4重量份，植物油0. 5 1重量份，用自來水定容到100體積份；(2)溫度為32 34 0C ； (3)培養時間48 96小時；本發明所述的一級種子擴大培養基組成優化為黃豆粉3重量份，淀粉1. 5重量份，CaCO3O. 7重量份，糊精1. 5重量份，硫銨0. 3重量份，玉米漿2重量份，植物油0. 7重量份，用自來水定容到100體積份。本發明所述的一級種子擴大培養基組成優化為黃豆粉2重量份，淀粉2重量份， CaCO3O. 75重量份，糊精1重量份，硫銨0. 4重量份，玉米漿3重量份，植物油0. 8重量份，用自來水定容到100體積份。本發明所述的二，三級種子擴大培養條件為(1)培養基組成黃豆粉2. 0 4. 5 重量份，淀粉2. 5 4. 0重量份，CaCO3O. 5 0. 7重量份，氯化鈉0. 4 0. 6重量份，糊精 2. 5 4. 0重量份，硫銨0. 1 0. 3重量份，玉米漿1 2重量份，植物油0. 8 1. 5重量份，消沫劑0 0. 02重量份，用自來水定容到100體積份；(2)溫度為32 34°C; (3)培養時間24 48小時。本發明所述的二，三級種子擴大培養基組成(1)培養基組成黃豆粉3. 5重量份， 淀粉3. 2重量份，CaCO3O. 6重量份，氯化鈉0. 5重量份，糊精3. 2重量份，硫銨0. 2重量份， 玉米漿1. 5重量份，植物油1. 1重量份，消沫劑0. 005重量份，用自來水定容到100體積份。本發明所述的二，三級種子擴大培養基組成(1)培養基組成黃豆粉4重量份，淀粉3重量份，CaCO3O. 5重量份，氯化鈉0. 4重量份，糊精4重量份，硫銨0. 3重量份，玉米漿 1重量份，植物油0. 8重量份，消沫劑0. 01重量份，用自來水定容到100體積份。本發明所述的發酵培養基組成黃豆粉3. 5 5. 5重量份，淀粉2. 0 4. 0重量份，硫銨0. 08 0. 15重量份，CaCO3O. 6 1. 0重量份，植物油0. 5 1. 0重量份，消沫劑 0. 005 0. 02重量份，用自來水定容到100體積份。本發明所述的發酵培養基組成黃豆粉4. 5重量份，淀粉3. 0重量份，硫銨0. 12重量份，CaCO3O. 8重量份，大豆油0. 7重量份，消沫劑0. 01重量份，用自來水定容到100體積份。本發明所述的發酵培養基組成黃豆粉5. 0重量份，淀粉2. 5重量份，硫銨0. 15重量份，CaCO3O. 7重量份，植物油0. 9重量份，消沫劑0. 005重量份，用自來水定容到100體積份。本發明所述的添加營養物質組成為液糖10 50重量份，植物油1 10重量份， 正丙醇溶液0.5 5重量份。本發明所述的添加營養物質組成為液糖20重量份，植物油4重量份，正丙醇2重量份。
本發明所述的的添加營養物質組成為液糖40重量份，植物油5重量份，正丙醇1
重量份。本發明所述的植物油為花生油、菜籽油、大豆油、棉籽油、香油、葵花籽油、橄欖油、莪術油、大蒜油、沙棘油、當歸油、生姜油、連翹油、紫蘇油、陳皮油、蓖麻油、薄荷油、肉豆蔻油中的任一種。本發明所述的植物油優選為大豆油，菜籽油中的任一種。本發明所述的液糖為20 70%葡萄糖溶液。本發明所述的正丙醇溶液為20 70%正丙醇溶液。本發明所述的消沫劑為聚醚類消沫劑。本發明所述的聚醚類消沫劑為聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油中的任一種或兩種的組合物。上述本發明方法中的重量份與體積份的關系為g/mL的關系。本發明紅霉素發酵液按常規方法提取即可得到紅霉素。本發明與現有的紅霉素發酵方法相比的進步性如下本方法通過對培養基的優化及發酵方法改進，使葡萄糖、黃豆粉、玉米漿等原料利用率得到提高。2，通過對培養基的優化使發酵所需原輔料種類減少，需量減小，對原輔料生物利
用度提高。3，由于發酵所需物料種類和使用量減少，加之糖氮利用率的提高，發酵液中殘留的葡萄糖、黃豆餅粉、商品玉米漿等營養物殘留量隨之減少，紅霉素生產廢水污染程度大大降低，利于經污水站處理后達標排放，符合清潔生產的要求。以下的實施例將有助于本領域的普通技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。實驗例1對比試驗本發明實驗例和實施例中，所述的紅霉素產生菌為紅霉素鏈霉菌。本發明實驗例和實施例中，所述的方法如下按照實施例一的方法，將紅霉素種子液按10%比例接種于經滅菌的發酵培養基中，通入無菌空氣并攪拌，在15小時添加60%葡萄糖溶液40g，菜籽油5g，30%正丙醇lg， 經過7天培養，得紅霉素發酵液。現有技術中紅霉素種子制備培養基組分為淀粉3. 5g，硫酸銨0. 75g，氯化鈉 0. 5g，蛋白胨0. 5g，糊精2. Og,葡萄糖3. Og,酵母粉2. Og,碳酸鈣0. Sg,硫酸鎂0. 05g,磷酸氫二鉀0. 08g，豆油0. 4mL，用自來水定容到100mL。培養條件為溫度為33°C ； (3)培養時間70小時。現有技術中紅霉素發酵培養基組分為淀粉3. Og,硫酸銨0. 5g，糊精4. 5g，葡萄糖 2. 0g，玉米漿0. lg，碳酸鈣0. 9g，豆油0. 6mL，用自來水定容到100mL。本實驗例所述的紅霉素一級種子培養基組分為黃豆粉3g，淀粉1. 5g，CaCO3O. 7g， 糊精1. 5g，硫銨0. 3g，玉米漿2g，大豆油0. 7g，用自來水定容到100ml。培養條件為溫度為330C ；培養時間70小時。本實驗例所述的紅霉素二、三級種子培養基組分為黃豆粉3. 5g，淀粉3. 2g，CaCO3O. 6g，氯化鈉0. 5g，糊精3. 2g，硫銨0. 2g，玉米漿1. 5g，大豆油1. Ig,聚氧丙烯甘油 0. 005g，用自來水定容到100ml。培養條件為溫度為32 34°C ；培養時間M 48小時。本實驗例所述的紅霉素發酵培養基組分為黃豆粉4.5g，淀粉3.0g，硫銨0. 12g， CaCO3O. 8g，大豆油0. 7g，聚氧丙烯甘油0. Olg，用自來水定容到100ml。表1紅霉素發酵技術的比較
權利要求
1.一種紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)紅霉素種子液培養①母斜面孢子制備將冷凍保存在砂土管中的紅霉素鏈霉菌 (產生菌)孢子，接種于經滅菌的斜面培養基上，在溫度32 34°C條件下，培養7 9天； ②子斜面孢子制備將母斜面孢子，接種于經滅菌的斜面培養基上，在溫度32 34°C條件下，培養7 9天；③種子培養將子斜面孢子，接種于經滅菌的種子培養基，經過三級種子擴大培養，得到紅霉素種子液；(2)發酵將紅霉素種子液按10 20%體積比接種于經滅菌的培養基中，通入無菌空氣并攪拌15 30小時，添加營養物質，經過7 10天培養，得紅霉素發酵液。
2.如權利要求1所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的母斜面孢子制備斜面培養基是由下述組分組成淀粉0. 1 1. 0重量份、玉米漿0. 05 0. 2重量份、瓊脂 0. 1 1. 0重量份、葡萄糖0. 1 1. 0重量份、氯化鈉0. 5 2. 0重量份、氯化鈣0. 1 1. 0 重量份、用自來水定容到100體積份。
3.如權利要求2所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的母斜面孢子制備斜面培養基組分由下述組分組成淀粉0. 5重量份、玉米漿0. 1重量份、瓊脂0. 5重量份。 葡萄糖0. 5重量份，氯化鈉1重量份，氯化鈣0. 5重量份、用自來水定容到100體積份。
4.如權利要求1所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的子斜面孢子制備斜面培養基是由下述組分組成淀粉0. 1 1. 0重量份、玉米漿0. 05 0. 2重量份、瓊脂 0. 1 1. 0重量份、葡萄糖0. 1 1. 0重量份、氯化鈉0. 5 2. 0重量份、氯化鈣0. 1 1. 0 重量份、用自來水定容到100體積份。
5.如權利要求4所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的子斜面孢子制備斜面培養基是由下述組分組成淀粉0. 4重量份、玉米漿0. 2重量份、瓊脂0. 4重量份、葡萄糖0. 4重量份，氯化鈉1. 5重量份，氯化鈣1. 0重量份、用自來水定容到100體積份。
6.如權利要求1所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的一級種子擴大培養培養基組成為黃豆粉2 4重量份、淀粉1 2重量份、CaCO3O. 6 0. 8.重量份、糊精 1 2重量份、硫銨0. 2 0. 4重量份、玉米漿1 4重量份、植物油0. 5 1重量份、用自來水定容到100體積份；
7.如權利要求1所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的一級種子擴大培養溫度為32 34°C ；培養時間為48 96小時。
8.如權利要求6所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的一級種子擴大培養基組成為黃豆粉3重量份、淀粉1. 5重量份、CaCO3O. 7重量份、糊精1. 5重量份、硫銨0. 3 重量份、玉米漿2重量份、植物油0. 7重量份、用自來水定容到100體積份。
9.如權利要求6所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的一級種子擴大培養基組成為黃豆粉2重量份、淀粉2重量份、CaCO3O. 75重量份、糊精1重量份、硫銨0. 4重量份、玉米漿3重量份、植物油0. 8重量份、用自來水定容到100體積份。
10.如權利要求1所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的二、三級種子擴大培養培養基組成黃豆粉2. 0 4. 5重量份、淀粉2. 5 4. 0重量份、CaC03 0. 5 0. 7 重量份、氯化鈉0. 4 0. 6重量份、糊精2. 5 4. 0重量份、硫銨0. 1 0. 3重量份、玉米漿 1 2重量份、植物油0. 8 1. 5重量份、消沫劑0 0. 02重量份、用自來水定容到100體積份；
11.如權利要求1所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的二、三級種子擴大培養溫度為32 34°C ；培養時間為M 48小時。
12.如權利要求10所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的二、三級種子擴大培養培養基組成為黃豆粉3. 5重量份、淀粉3. 2重量份、CaCO3O. 6重量份、氯化鈉0. 5 重量份、糊精3. 2重量份、硫銨0. 2重量份、玉米漿1. 5重量份、植物油1. 1重量份、消沫劑 0. 005重量份、用自來水定容到100體積份。
13.如權利要求10所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的二、三級種子擴大培養培養基組成為黃豆粉4重量份、淀粉3重量份、CaCO3O. 5重量份、氯化鈉0. 4重量份、糊精4重量份、硫銨0. 3重量份、玉米漿1重量份、植物油0. 8重量份、消沫劑0. 01重量份、用自來水定容到100體積份。
14.如權利要求1所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的發酵培養基組成為黃豆粉3. 5 5. 5重量份、淀粉2. 0 4. 0重量份、硫銨0. 08 0. 15重量份、 CaTO3O. 6 1. 0重量份、植物油0. 5 1. 0重量份、消沫劑0. 005 0. 02重量份、用自來水定容到100體積份。
15.如權利要求14所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的發酵培養基組成為黃豆粉4. 5重量份、淀粉3. 0重量份、硫銨0. 12重量份、CaCO3O. 8重量份、大豆油0. 7 重量份、消沫劑0. 01重量份、用自來水定容到100體積份。
16.如權利要求14所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的發酵培養基組成為黃豆粉5. 0重量份、淀粉2. 5重量份、硫銨0. 15重量份、CaCO3O. 7重量份、植物油0. 9 重量份、消沫劑0. 005重量份、用自來水定容到100體積份。
17.如權利要求1所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的添加營養物質組成為液糖10 50重量份、植物油1 10重量份、正丙醇溶液0. 5 5重量份。
18.如權利要求17所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的添加營養物質組成為液糖20重量份、植物油4重量份、正丙醇2重量份。
19.如權利要求17所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的添加營養物質組成為液糖40重量份、植物油5重量份、正丙醇1重量份。
20.如權利要求6或8 10或12 19任一所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的植物油為花生油、菜籽油、大豆油、棉籽油、香油、葵花籽油、橄欖油、莪術油、大蒜油、沙棘油、當歸油、生姜油、連翹油、紫蘇油、陳皮油、蓖麻油、薄荷油、肉豆蔻油中的任一種。
21.如權利要求20所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的植物油為大豆油或菜籽油。
22.如權利要求17所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的液糖為20 70%葡萄糖溶液。
23.如權利要求17所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的正丙醇溶液為 20 70%正丙醇溶液。
24.如權利要求10或12 16任一所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的消沫劑為聚醚類消沫劑。
25.如權利要求24所述的紅霉素發酵液的發酵方法，其特征在于所述的聚醚類消沫劑為聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油中的任一種或兩種的組合物。
全文摘要
本發明公開了一種紅霉素發酵液的發酵方法，本發明紅霉素的發酵方法包括如下步驟將紅霉素鏈霉菌(產生菌)孢子接種，斜面培養基培養，再經三級種子擴大培養后接種于經滅菌的培養基中，通入無菌空氣攪拌，添加營養物質，培養，即得。本發明通過對培養基的優化及發酵方法改進，使葡萄糖、黃豆粉、玉米漿等原料利用率得到提高，發酵所需原輔料種類減少，需量小，對原輔料生物利用度高。
文檔編號C12P19/62GK102409071SQ20111039620
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月2日 優先權日2011年12月2日
發明者劉思川, 梁隆, 王利春, 程志鵬, 鄧蕓, 鄒太平, 黃海玉 申請人:伊犁川寧生物技術有限公司