專利名稱：一種紅霉素發酵方法
技術領域：
本發明涉及一種紅霉素發酵方法，屬于醫藥生物領域。
背景技術：
紅霉素(Erythromycin，Er)第一代大環內酯類抗生素，主要由鏈霉菌、小單孢菌和糖多孢菌產生。在臨床上主要應用于治療革蘭氏陽性細菌感染，對革蘭氏陰性菌如流感桿菌、百日咳桿菌、淋球菌、布氏桿菌、軍團菌及腦膜炎球菌等也有抗菌作用。紅霉素主要活性成分是紅霉素A(Er-A)，雜質組分主要有紅霉素B (Er-B)和紅霉素C(Er-C)、紅霉素D(Er-D)、以及紅霉素E(Er-E)、紅霉素F(Er-F)等，各組分結構式如圖1 所示。紅霉素生物合成(圖2)的原料是丙酸和甲基丙二酸，活性形式是丙酰-CoA和甲基丙二酰-CoA。丙酸和甲基丙二酸均由初級代謝產物分解而來，甲基丙二酸經PKS酶脫梭也能產生丙酸。六分子的甲基丙二酰-CoA和一分子的丙酰-CoA在聚酮合酶(polyketide synthases, PKS)的催化作用下，經縮合、酮還原、脫水和烯還原等多輪循環后形成紅霉素的大環內酯環，即6-脫氧紅霉內酯陽-deoxyerthronolide B，6_dEB)。6-dEB在C-6羥化酶的作用下形成紅霉內酯(erythronolide, EB) 0 EB在糖基轉移酶的作用下，先在C-3位接上第1個脫氧糖L-mycarose，后在C-5位接上第2個脫氧糖D-desosamine，從而形成了具有生物活性的紅霉素D (Er-D)。從紅霉素D形成紅霉素 A (Erythromycin A, Er-A)有兩種途徑，由于C-12羥基化酶(EryK)和甲基化酶(EryG)對底物的親和力存在差異，主要是通過紅霉素D在EryK的催化下形成Er_C，然后在甲基化酶 (EryG)的催化下在碳霉糖的C-3’位甲基化而最終形成紅霉素A。紅霉素B雜質的產生，與 EryK催化的羥基化反應進行不完全有關。紅霉素B雜質活性比紅霉素A稍弱，在以紅霉素A為原料合成二三代大環內酯類抗生素的過程中，紅霉素B也將變成相應的雜質進入產品，極難去除，因此有必要深入研究在發酵階段就降低紅霉素B的含量。

發明內容
本發明的目的在于公開一種紅霉素發酵方法。本發明使用的紅霉素鏈霉菌(Sti^ptomyces erythreus)為廣東省微生物菌種保藏中心商業上廣泛銷售的菌種，GIM編號GIM4. 14，其他編號AS4. 198。本發明目的是通過如下技術方案實現的將冷凍管中的紅霉素鏈霉菌種子，接入含有20 30體積份種子培養基的三角瓶中，在33士0. 5°C的搖床間培養42 50h，搖床轉速為220 MOr/min ；將培養好的種子培養液按照5 10%接種量接入含有20 30體積份發酵培養基的三角瓶中，培養溫度 33士0.5°C，搖床轉速220 MOr/min，培養150 210h ；即得紅霉素發酵物；在發酵培養過程中加入添加劑。
本發明還可以優選如下步驟將冷凍管中的紅霉素鏈霉菌種子，接入含有25體積份種子培養基的三角瓶中，在 33士0.5°C的搖床間培養46h，搖床轉速為230r/min，將培養好的種子培養液按照8%接種量接入含有25體積份發酵培養基的三角瓶中，培養溫度33士0. 5°C，搖床轉速230r/min，培養160 180h ；即得紅霉素發酵物；在發酵M 3 后中加入添加劑。所述的種子培養基組分為淀粉3. 5重量份，硫酸銨0. 75重量份，氯化鈉0. 5重量份，蛋白胨0. 5重量份，糊精2. 0重量份，葡萄糖3. 0重量份，酵母粉2. 0重量份，碳酸鈣0. 8 重量份，硫酸鎂0. 05重量份，磷酸氫二鉀0. 08重量份，豆油0. 4體積份，用自來水定容到 100體積份。所述的發酵培養基組分為淀粉3. 0重量份，硫酸銨0. 5重量份，糊精4. 5重量份， 葡萄糖2. 0重量份，玉米漿0. 1重量份，碳酸鈣0. 9重量份，豆油0. 6體積份，用自來水定容到100體積份。所述的添加劑為鐵鹽、苯巴比妥衍生物、表面活性劑配制而成的組合物；所述的鐵鹽為氯化鐵、硫酸鐵、硝酸鐵、氫氧化鐵中的一種或多種；所述的苯巴比妥衍生物為苯巴比妥鈉、甲乙炔巴比妥鈉、司可巴比妥、2-硫代巴比妥酸中的一種或多種；所述的表面活性劑為壬基酚聚氧乙烯醚G-N-NP2E0)、η-辛基- β -D-吡喃葡萄糖苷中的一種或多種。所述的發酵液中鐵鹽的濃度為0. 2 5mmol/L ；所述的發酵液中苯巴比妥衍生物的濃度為lmmol/L以下；所述的發酵液中表面活性劑的濃度為0. 1 0. 7mmol/L。上述本發明方法中的重量份與體積份的關系為g/ml的關系。本發明所述的紅霉素發酵方法，通過加入極少量復合添加劑，顯著降低了發酵液中紅霉素B雜質的含量，提高了效價。


圖1紅霉素主要組分及其結構紅霉素主要活性成分是紅霉素A(Er-A)，雜質組分主要有紅霉素B (Er-B)和紅霉素C(Er-C)、紅霉素D(Er-D)、以及紅霉素E(Er-E)、紅霉素F(Er-F)等，本圖所示各組分結構式。 圖2紅霉素生物合成過程本圖所示紅霉素的生物合成過程。下面實驗例和實施例用于進一步說明但不限于本發明。實驗例一對比試驗本發明實驗例和實施例中，所述的紅霉素產生菌為紅霉素鏈霉菌。本發明實驗例和實施例中，所述的測定方法如下先處理樣品取發酵液10mL，用濾紙過濾。然后取ImL濾液，用超速離心機以 10000r/min離心lOmin，用0. 22 μ m的膜過濾上清液，置于進樣瓶中分析。按照實施例一的方法，將培養好的種子培養液按照10%接種量分別接入5個含有 25mL發酵培養基的250mL中三角瓶中，培養溫度33 士0. 5°C，搖床轉速220r/min。5個三角瓶分別按如下五種方法操作，發酵結束后，測定效價與主要組分紅霉素A、紅霉素B、紅霉素 C的含量，結果見表一。
本發明實驗例和實施例中，所述的種子培養基組分為淀粉3. 5g，硫酸銨0. 75g， 氯化鈉0. 5g，蛋白胨0. 5g，糊精2. 0g，葡萄糖3. Og,酵母粉2. Og,碳酸鈣0. Sg,硫酸鎂 0. 05g，磷酸氫二鉀0. 08g，豆油0. 4mL，用自來水定容到IOOmL0所述的發酵培養基組分為淀粉3. 0g，硫酸銨0. 5g，糊精4. 5g，葡萄糖2. 0g，玉米漿0. lg，碳酸鈣0. 9g，豆油0. 6mL，用自來水定容到100mL。生物效價測定使用管碟法。主要組分紅霉素A、B、C百分含量使用HPLC法測定， 實驗條件為采用反相柱C18柱ΚΡ-α8θ50πιπιΧ4·6πιπι，5μπι)，以乙腈(色譜純)0.5% 磷酸二氫銨(A.R)緩沖液=35 65為流動相，流速為lmL/min，在215nm處檢測，柱溫為 35 "C。空白組發酵192h。方法1 在發酵120h后，添加ATP 2. 5mg、硫酸鎂90mg、檸檬酸80mg、L-蛋氨酸為 10mg，繼續發酵72h。方法2 在發酵96h后，添加Triton-XlOO 40uL (約42. ^ig)，繼續發酵％h。方法3 在發酵24h后，添加六水三氯化鐵27. lmg、苯巴比妥鈉5. ^ig、壬基酚聚氧乙烯醚 G-N-NP2E0)6. :3mg，繼續發酵 168h。方法4 在發酵24h后，添加氫氧化鐵10. 8mg、甲乙炔巴比妥鈉5. Omg, η-辛基-β -D-吡喃葡萄糖苷6. Img,繼續發酵16 。表一與現有技術相比的實驗數據表
權利要求
1.一種紅霉素發酵方法，其特征在于該方法包括如下步驟將冷凍管中的紅霉素鏈霉菌種子，接入含有20 30體積份種子培養基的三角瓶中，在33士0. 5°C的搖床間培養42 50h，搖床轉速為220 MOr/min ；將培養好的種子培養液按照5 10%接種量接入含有 20 30體積份發酵培養基的三角瓶中，培養溫度33 士0. 5°C，搖床轉速220 MOr/min，培養150 210h ；即得紅霉素發酵物；在發酵培養過程中加入添加劑。
2.如權利要求1所述的紅霉素發酵方法，其特征在于該方法包括如下步驟將冷凍管中的紅霉素鏈霉菌種子，接入含有25體積份種子培養基的三角瓶中，在33 士 0. 5°C的搖床間培養46h，搖床轉速為230r/min，將培養好的種子培養液按照8 %接種量接入含有25體積份發酵培養基的三角瓶中，培養溫度33士0. 5°C，搖床轉速230r/min，培養160 180h ；即得紅霉素發酵物；在發酵M 3 后中加入添加劑。
3.如權利要求1 2所述的紅霉素發酵方法，其特征在于所述的種子培養基組分為 淀粉3. 5重量份，硫酸銨0. 75重量份，氯化鈉0. 5重量份，蛋白胨0. 5重量份，糊精2. O重量份，葡萄糖3. O重量份，酵母粉2. O重量份，碳酸鈣0. 8重量份，硫酸鎂0. 05重量份，磷酸氫二鉀0. 08重量份，豆油0. 4體積份，用自來水定容到100體積份；所述的發酵培養基組分為淀粉3. O重量份，硫酸銨0. 5重量份，糊精4. 5重量份，葡萄糖2. O重量份，玉米漿0. 1 重量份，碳酸鈣0. 9重量份，豆油0. 6體積份，用自來水定容到100體積份。
4.如權利要求1 2所述的紅霉素發酵方法，其特征在于所述的添加劑為鐵鹽、苯巴比妥衍生物、表面活性劑配制而成的組合物。
5.如權利要求4所述的紅霉素發酵方法，其特征在于所述的鐵鹽為氯化鐵、硫酸鐵、硝酸鐵、氫氧化鐵中的一種或多種；所述的苯巴比妥衍生物為苯巴比妥鈉、甲乙炔巴比妥鈉、 司可巴比妥、2-硫代巴比妥酸中的一種或多種；所述的表面活性劑為壬基酚聚氧乙烯醚 (4-N-NP2E0), η-辛基- β -D-吡喃葡萄糖苷中的一種或多種。
6.如權利要求4所述的紅霉素發酵方法，其特征在于發酵液中鐵鹽的濃度為0.2 5mmol/L ；所述的發酵液中苯巴比妥衍生物的濃度為lmmol/L以下；所述的發酵液中表面活性劑的濃度為0. 1 0. 7mmol/L。
全文摘要
本發明涉及一種紅霉素發酵方法。通過在紅霉素鏈霉菌(Streptomyces Erythreus)發酵液中加入添加劑，調節發酵過程，顯著降低了紅霉素B雜質的含量，提高了效價。添加劑為鐵鹽、苯巴比妥衍生物、表面活性劑按一定比例配制而成的組合物。鐵鹽為氯化鐵、硫酸鐵、硝酸鐵、氫氧化鐵中的至少一種；苯巴比妥衍生物為苯巴比妥鈉、甲乙炔巴比妥鈉、司可巴比妥、2-硫代巴比妥酸中的至少一種；表面活性劑為壬基酚聚氧乙烯醚(4-N-NP2EO)、n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷中的至少一種。發酵液中鐵鹽的濃度為0.2～5mmol/L；發酵液中苯巴比妥衍生物的濃度為1mmol/L以下；發酵液中表面活性劑的濃度為0.1～0.7mmol/L。
文檔編號C12P19/62GK102286578SQ20111020523
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月21日 優先權日2011年7月21日
發明者張翔, 張韜, 文躍強, 陽海, 黃耀宗 申請人:四川科倫藥物研究有限公司