專利名稱：一種與臨床原因不明的非梗阻性無精子癥輔助診斷相關的snp標志物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程及生殖醫學領域，涉及一種臨床原因不明的非梗阻性無精子癥輔助診斷相關的SNP標志物及其應用。
背景技術：
生育是一個復雜的過程，不能由單獨的個體完成，而是取決于男女雙方，只有在雙方各種條件均適宜的情況下，才能順利完成。據WHO統計，大約每七對夫婦中就有一對存在著各種程度的生育障礙，其中有近一半與男方因素有關，由此被稱為男性不育。男性不育給個人、家庭造成了沉重的精神和經濟負擔，成為家庭和社會的不穩定因素之一。因此，男性不育已逐漸成為一個全球性的公共社會問題，是許多國家生殖健康服務的重要內容之一。在所有導致男性不育病因中，無精子癥是最為常見的病因之一，在成年男性中約占1%。無精子癥是指患者三次正常排精后，精液中沒有精子。它可分為梗阻性和非梗阻性無精子癥。梗阻性無精子癥obstructive azoospermia (OA)是由輸精管道梗阻而引起精液中沒有精子，非梗阻性無精子癥non-obstructive azoospermia(NOA)是由于男性睪丸生精障礙而導致，后者的精子數量和形態都比較差，所有的睪丸精子活動能力都低或沒有活動能力，其危害程度遠大于0A。引起NOA的原因很多，包括遺傳性疾病(如Klinefelter 綜合征)、先天性睪丸異常、睪丸本身病變(如睪丸外傷，炎癥，扭轉以及睪丸血管病變)、內分泌疾病(如垂體功能亢進或低下、垂體腫瘤、腎上腺功能亢進或低下和甲亢或甲低)、嚴重全身性疾病和營養不良，以及放射損傷及藥物等。值得注意的是，相當數量的NOA臨床原因不明，其早期診斷和治療就顯得更為困難。在我國，約有25%的男性不育是Ν0Α，因此， Ν0Α，尤其是臨床原因不明的Ν0Α，不僅是我國成年男性生殖健康面臨的最主要威脅之一，也是男性不育治療的一個嚴峻問題。目前，NOA的初步診斷方法主要為病史詢問、體格檢查、精液參數、精漿生化、血性激素檢測、B超以及染色體檢測等。世界衛生組織在男性不育的診斷檢查及處理手冊指明 無精子癥是指精子密度等于0，即使將精液離心后檢查亦不能發現精子。臨床上通常3次離心鏡檢精液仍未見到精子，同時，排除不射精和逆行射精后方可確診為無精子癥病人。常規的精子密度分析目前主要依靠精子密度判別(人工計數或利用計算機輔助系統分析，即 CASA)，尚無其他有效的手段，但其自身存在一定的缺陷，如個體精液質量波動較大，尤其易受到禁欲天數、溫度、采集精液方法等因素的影響，從而造成精子密度測量不準確；對相應疾病的早期診斷效果也遠不能滿足需要。而明確診斷常需進行睪丸穿刺活檢，這給尋求生育幫助的人群帶來極大的痛苦。盡管目前國內外研究者正努力探索新的NOA診斷生物標志物，并對現有評估手段進行有效的補充，但一直難以突破傳統生物標志物發展和男性生殖實際應用中的瓶頸，即有創穿刺活檢、精液質量分析結果波動、以及早期診斷困難等。此外， 由于病因不明，缺乏有效的治療手段，大多數NOA病人只能選擇ICSI或AID等輔助生育手段，不僅無法滿足心理上的要求，而且有可能出現后代的遺傳缺陷。
研究表明，遺傳因素是引起男性不育的主要因素，單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)在其中起重要作用。SNP是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。SNP的存在被認為賦予了個體不同的表型性狀，以及對于環境暴露、藥物治療等因素的不同反應性，因此SNP可能是導致個體對常見疾病發病和預后易感性差異的重要遺傳基礎。利用疾病易感的SNP譜預測疾病的發生，不僅靈敏、準確和快速，具有廣闊的應用前景，而且通過SNP預測譜的構建，還可以實現中國古語中“上醫治未病”的理想，對疾病作出前瞻性的“基因診斷”。 近年來，利用SNP預測疾病的發生發展已經成為臨床和科研工作者的研究熱點，在腫瘤和心腦血管疾病等常見重大疾病預測上的應用價值已初見端倪。然而，目前還沒有將SNP應用于臨床原因不明的NOA診斷的報道，若能篩選出臨床原因不明的NOA易感的SNP作為生物標志物，并研制相應的診斷試劑盒，對我國臨床原因不明的NOA的診斷現狀必將是一次有力的推動，也為其藥物篩選、藥效評價及靶向治療開辟了新的途徑。

發明內容
本發明的目的是針對上述技術問題，提出一種與臨床原因不明的NOA輔助診斷相關的SNP標志物及其應用本發明的第二個目的是提供上述SNP標志物的特異性引物。本發明的第三個目的是提供上述SNP標志物的特異性熒光探針對。本發明的第四個目的是提供上述SNP標志物及其特異性引物和特異性熒光探針在制備臨床原因不明的NOA輔助診斷試劑盒中的應用。本發明第五個目的是提供臨床原因不明的NOA輔助診斷試劑盒。發明人通過分離和研究臨床原因不明的NOA患者及與其年齡匹配的健康男性對照外周血DNA中的單核苷酸多態性，尋找一組與臨床原因不明的NOA高度相關的高特異性和敏感性的SNP，并研制出可便于臨床應用的原因不明的NOA輔助診斷試劑盒，為臨床原因不明的NOA的篩查和診斷提供數據支持，為發現具有潛在治療價值的新型小分子藥物提供數據支持。本發明的目的是通過下列技術方案實現的一種與臨床原因不明的NOA輔助診斷相關的SNP標志物，該標志物為rsl014331、 rsl0765875、rsl0889203、rsll066453、rslll67809、rsl2097821、rsl990264、rs3000811、 rs3130048、rs391129、rs4716515、rs658239、rs6589102、rs7042232、rs7099208、 rs7144703、rs7194、和 rs985421 的組合。所述的SNP標志物的特異性引物，這些引物為rsl014331 的引物序列為 SEQ ID No 1 和 SEQ ID No 2 ；rsl0765875 的引物序列為 SEQ ID No 5 和 SEQ ID No 6 ；rsl0889203 的引物序列為 SEQ ID No 9 和 SEQ ID No 10 ；rsl 1066453 的引物序列為 SEQ ID No 13 和 SEQ ID No 14 ；rsl 1167809 的引物序列為 SEQ ID No 17 和 SEQ ID No 18 ；rsl2097821 的引物序列為 SEQ ID No 21 和 SEQ ID No 22 ；rsl990264 的引物序列為 SEQ ID No 25 和 SEQ ID No 26 ；rs3000811 的引物序列為 SEQ ID No : 和 SEQ ID No :30 ;rs3130048 的引物序列為 SEQ ID No 33 和 SEQ ID No:34 ;rs391129 的引物序列為 SEQ ID No 37 禾Π SEQ ID No :38 ;rs4716515 的引物序列為 SEQ ID No :41 禾口 SEQ ID No 42 ；rs658239 的引物序列為 SEQ ID No 45 禾口 SEQ ID No 46 ； rs6589102 的引物序列為 SEQ ID No 49 和 SEQ ID No 50 ；rs7042232 的引物序列為 SEQ ID No 53 和 SEQ ID No 54 ；rs7099208 的引物序列為 SEQ ID No 57 和 SEQ ID No 58 ； rs7144703 的引物序列為 SEQ ID No :61 和 SEQ ID No :62 ;rs7194 的引物序列為 SEQ ID No 65 和 SEQ ID No 66 ；rs985421 的引物序列為 SEQ ID No 69 和 SEQ ID No :70。所述的SNP標志物的特異性熒光探針對，這些熒光探針為rsl014331 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 3 和 SEQ ID No 4 ；rsl0765875 的熒光探針對序列為SEQ ID No 7和SEQ ID No 8 ；rsl0889203的熒光探針對序列為SEQ ID No 11 禾口 SEQ ID No 12 ；rsl 1066453 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 15 和 SEQ ID No 16 ;rslll67809 的熒光探針對序列為 SEQ ID No:19 和 SEQ ID No :20 ;rsl2097821 的熒光探針對序列為SEQ ID No 23和SEQ ID No 24 ；rsl990264的熒光探針對序列為SEQ ID No :27 禾口 SEQ ID No 28 ；rs3000811 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :31 禾口 SEQ ID No 32 ； rs3130048的熒光探針對序列為SEQ ID No 35和SEQ ID No 36 ；rs391129的熒光探針對序列為SEQ ID No 39和SEQ ID No 40 ；rs4716515的熒光探針對序列為SEQ ID No 43和 SEQ ID No 44 ；rs658239 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :47 和 SEQ ID No 48 ；rs6589102 的熒光探針對序列為SEQ ID No:51和SEQ ID No 52 ；rs7042232的熒光探針對序列為SEQ ID No 55 和 SEQ ID No 56 ；rs7099208 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 59 和 SEQ ID No 60 ；rs7144703的熒光探針對序列為SEQ ID No :63和SEQ ID No 64 ；rs7194的熒光探針對序列為SEQ ID No 67和SEQ ID No 68 ；rs985421的熒光探針對序列為SEQ ID No 71和 SEQ ID No :72ο所述的SNP標志物在制備臨床原因不明的NOA輔助診斷試劑盒中的應用。所述的SNP標志物的特異性引物在制備臨床原因不明的NOA輔助診斷試劑盒中的應用。所述的SNP標志物的特異性熒光探針對在制備臨床原因不明的NOA輔助診斷試劑盒中的應用。一種臨床原因不明的NOA輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測外周血DNA中 rsl014331、rsl0765875、rsl0889203、rsll066453、rslll67809、rsl2097821、rsl990264、 rs3000811、rs3130048、rs391129、rs4716515、rs658239、rs6589102、rs7042232、 rs7099208、rs7144703、rs7194、和 rs985421。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有上述SNP標志物的特異性引物和/或特異性熒光探針。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有的SNP標志物的特異性引物為rsl014331 的引物序列為 SEQ ID No 1 和 SEQ ID No 2 ；rsl0765875 的引物序列為 SEQ ID No 5 和 SEQ ID No 6 ；rsl0889203 的引物序列為 SEQ ID No 9 和 SEQ ID No 10 ；rsl 1066453 的引物序列為 SEQ ID No 13 和 SEQ ID No 14 ；rsl 1167809 的引物序列為 SEQ ID No 17 和 SEQ ID No 18 ；rsl2097821 的引物序列為 SEQ ID No 21 和 SEQ ID No 22 ；rsl990264 的引物序列為 SEQ ID No 25 和 SEQ ID No 26 ；rs3000811 的引物序列為 SEQ ID No : 和 SEQ ID No :30 ;rs3130048 的引物序列為 SEQ ID No 33 和 SEQ ID No:34 ;rs391129 的引物序列為 SEQ ID No 37 禾Π SEQ ID No :38 ;rs4716515 的引物序列為 SEQ ID No :41 禾口 SEQ ID No 42 ；rs658239 的引物序列為 SEQ ID No 45 禾口 SEQ ID No 46 ； rs6589102 的引物序列為 SEQ ID No 49 和 SEQ ID No 50 ；rs7042232 的引物序列為 SEQ ID No 53 和 SEQ ID No 54 ；rs7099208 的引物序列為 SEQ ID No 57 和 SEQ ID No 58 ； rs7144703 的引物序列為 SEQ ID No :61 和 SEQ ID No :62 ;rs7194 的引物序列為 SEQ ID No 65 和 SEQ ID No 66 ；rs985421 的引物序列為 SEQ ID No 69 和 SEQ ID No :70。所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有的SNP標志物的特異性熒光探針對為rsl014331 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 3 和 SEQ ID No 4 ；rsl0765875 的熒光探針對序列為SEQ ID No 7和SEQ ID No 8 ；rsl0889203的熒光探針對序列為SEQ ID No 11 禾口 SEQ ID No 12 ；rsl 1066453 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 15 和 SEQ ID No 16 ;rslll67809 的熒光探針對序列為 SEQ ID No:19 和 SEQ ID No :20 ;rsl2097821 的熒光探針對序列為SEQ ID No 23和SEQ ID No 24 ；rsl990264的熒光探針對序列為SEQ ID No :27 禾口 SEQ ID No 28 ；rs3000811 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :31 禾口 SEQ ID No 32 ； rs3130048的熒光探針對序列為SEQ ID No 35和SEQ ID No 36 ；rs391129的熒光探針對序列為SEQ ID No 39和SEQ ID No 40 ；rs4716515的熒光探針對序列為SEQ ID No 43和 SEQ ID No 44 ；rs658239 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :47 和 SEQ ID No 48 ；rs6589102 的熒光探針對序列為SEQ ID No:51和SEQ ID No 52 ；rs7042232的熒光探針對序列為SEQ ID No 55 和 SEQ ID No 56 ；rs7099208 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 59 和 SEQ ID No 60 ；rs7144703的熒光探針對序列為SEQ ID No :63和SEQ ID No 64 ；rs7194的熒光探針對序列為SEQ ID No 67和SEQ ID No 68 ；rs985421的熒光探針對序列為SEQ ID No 71和 SEQ ID No :72ο所述診斷試劑盒，該試劑盒還可以包括PCR反應常用的酶和試劑，如Taq酶、dNTP 混合液、Mgcl2溶液、去離子水等；還可以含有標準品和/或對照品。具體地說，本發明解決問題的技術方案包括(1)建立統一標準的標本庫和數據庫以標準操作程序(SOP)采集符合標準的血液樣本，系統收集完整的人口學資料和臨床資料。(2)基因型檢測選擇臨床原因不明的NOA病例、與臨床原因不明的NOA病例年齡匹配的健康男性對照，利用高密度SNP芯片，在全基因組范圍內找出與臨床原因不明的NOA相關的SNP。( 對篩選出的陽性關聯SNP，進一步在另外的樣本中進行檢測，以判斷其關聯的穩定性。(4)臨床原因不明的NOA輔助診斷試劑盒的研制根據臨床原因不明的NOA病例和健康男性對照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP開發SNP輔助診斷試劑盒。本發明人以標準操作程序(SOP)采集符合標準的血液樣本，系統收集完整的人口學資料、臨床資料等，并采用了 Affymetrixe. 0芯片進行全基因組掃描，TaqMan基因分型進行單個位點的檢測等。具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分1.研究樣本的選擇(1)重復精液質量檢測/睪丸穿刺活檢，確診為無精子癥；(2) 一次射精精液經離心無精子，排除梗阻性病因；(3)性功能正常；排除具有隱睪癥病史、血管外傷史、睪丸炎、輸精管梗阻、輸精管切除術、多染色體異常及Y染色體無精子癥因子微缺失等具有已知病因的患者
(4)與病例年齡匹配的健康男性對照本研究共采用4700例符合標準的樣本進行研究。2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，按常規方法操作。通常能得到20-50ng/ μ 1DNA,純度(紫外 2600D 與 2800D 比值)在 1. 6-2. 0。3. Affymetrix 6. 0 芯片檢測(1)取受試者全基因組DNA樣本；(2)在Affymetrix 6. 0芯片(購于美國昂飛公司，下同)上進行全基因組掃描；(3)檢測并比較各基因型在臨床原因不明的NOA病例與健康男性對照中的分別差已升。4.單個SNP的TaqMan基因分型(1)取受試者DNA樣本；(2)設計單個SNP的特異性引物和特異性熒光探針對；(3)進行 PCR 反應；(4)檢測并比較臨床原因不明的NOA病例與健康男性對照中不同基因型的分布差已升。5.診斷試劑盒制備方法Affymetrix6. 0芯片進行全基因組掃描和單個SNP檢測后確定臨床原因不明的 NOA病例與健康男性對照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP，作為臨床原因不明的NOA 診斷的指標。最后篩選出的與臨床原因不明的NOA發病有關的SNP組成輔助診斷試劑盒 (rsl014331、rsl0765875、rsl0889203、rsll066453、rslll67809、rsl2097821、rsl990264、 rs3000811、rs3130048、rs391129、rs4716515、rs658239、rs6589102、rs7042232、 rs7099208、rs7144703、rs7194、和rs985421)。診斷試劑可以包括這些SNP的特異性引物和特異性熒光探針對，以及Taq酶、dNTP等試劑。6.統計分析方法運用χ 2檢驗(用于分類變量)或者student t檢驗(用于連續性變量)比較人口學特征等在研究對象組間分布的差異。用logistic回歸分析中的additive模型進行關聯分析。為了進一步研究這18個SNP構成的綜合指征用于早期診斷的效果，我們構建了一個數學公式，綜合考慮每個SNP與臨床原因不明的NOA發病的正、負關聯情況和聯系強度。具體來說，我們對每個SNP的三種基因型進行評分，野生純合型=“0”，雜合型=“1”， 變異純合型=“2”，以單個SNP分析時的additive模型下的回歸系數為權重，綜合考慮每個SNP的情況給每個研究研究對照確定一個危險分值。危險分值的計算方法如下危險分值=(0. 3Xrs 1014331 的評分)+ (0. 26Xrsl0765875 的評分)+ (0. 29Xrsl0889203 的評分)+ (0. 5Xrsl 1066453 的評分)+ (0. 25Xrsl 1167809 的評分)+ (0. 34Xrsl2097821 的評分) + (0. 27Xrsl990264 的評分) + (0. 32Xrs3000811 的評分) + (0. 26Xrs3130048 的評分) + (0. 52Xrs391129 的評分)+ (0. 23Xrs4716515 的評分)+ (0. 22Xrs658239 的評分) + (0. 21Xrs6589102 的評分) + (0. 27Xrs7042232 的評分) + (0. 46Xrs7099208 的評分)+ (0. 62Xrs7144703 的評分)+ (0. 31Xrs7194 的評分)+ (0. 33Xrs985421 的評分)，獲得的危險分值系數以及界限值被直接應用于全基因組關聯研究的2700例樣本中。
統計學分析均通過專門的統計學分析軟件完成(PLINK1. 07)。統計學顯著性水平 P值設為0. 05，所有統計學檢驗均為雙側檢驗。以下是本發明進一步的說明在上述1000例符合條件的臨床原因不明的NOA病例及1700例健康男性對照中， 兩組年齡均衡可比。我們將這兩組人群經Affymetrixe. 0芯片進行全基因組掃描獲得相關結果。根據AffymetriX6. 0芯片檢測，本發明人檢測到在“臨床原因不明的NOA病例” 組和“健康男性對照”組中基因型分布頻率存在差異的SNP包括rsl014331、rsl0765875、 rsl0889203、 rsll066453、 rslll67809、 rsl2097821、 rsl990264、 rs3000811、 rs3130048、 rs391129、rs4716515、rs658239、rs6589102、rs7042232、rs7099208、rs7144703、rs7194、 和 rs9854210根據上述檢測結果，我們將這18個與臨床原因不明的NOA發病相關的SNP在另外1000例臨床原因不明的NOA病例和與其年齡匹配的1000例健康男性對照中進行了單個 SNP的檢測，結果與芯片檢測一致。單因素和多因素Logistic回歸分析結果均表明，這18個SNP與臨床原因不明的 NOA的發病存在著顯著關聯，18個SNP均是危險因素，變異等位基因可增加臨床原因不明的 NOA的發病風險。進一步分析這18個SNP的組合用于臨床原因不明的NOA診斷的效果，發現其組合能夠很好的區分病例與對照。根據上述實驗結果，本發明人制備了一種能用于臨床原因不明的NOA輔助診斷的試劑盒，包含測定受試者血標本DNA中上述SNP的特異性引物、特異性熒光探針對和其他檢測試劑。具體而言，這18個SNP的組合，或者這18個SNP的特異性引物及特異性熒光探針對的組合構成的相關診斷試劑盒有助于臨床原因不明的NOA的輔助診斷，為臨床醫生快速準確掌握患者的疾病狀態和病情嚴重程度，及時采取更具個性化的防治方案提供支持。本發明有益效果本發明提供的SNP標志物作為臨床原因不明的NOA輔助判斷的標志物的優越性在于(I)SNP是一種新型基因生物標志物，區別于傳統生物標志物，穩定、微創、易于檢測，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類生物標志物的成功開發將為臨床原因不明的NOA的診斷和治療開創全新局面，為其他疾病生物標志物的研制提供借鑒。0)SNP試劑盒是一種系統、全面的診斷試劑盒，可用于臨床原因不明的NOA的輔助診斷，有助于反映患者的疾病狀態，為臨床醫生快速準確掌握患者病情、及時采取更具個性化的防治方案提供支持。(3)采用嚴密的驗證和評價體系，本發明人初期采用全基因組芯片掃描以獲取疾病相關的SNP譜，并應用TaqMan基因分型方法在大樣本中進行了驗證；以上方法和策略的應用加速和保證了 SNP生物標志物和診斷試劑盒在臨床上的應用，也為其他疾病生物標志物的研制提供方法和策略上的借鑒。本發明通過控制年齡等對疾病發展的影響因素，研究SNP在臨床原因不明的NOA輔助診斷的應用前景，闡述SNP對于臨床原因不明的NOA進展的影響，揭示其診斷價值。因此，本發明獲得了臨床原因不明的NOA發病相關SNP譜和特異性標志物；通過SNP生物標志物和診斷試劑盒的研制和應用，可使得臨床原因不明的NOA的診斷更加方便易行，為臨床醫生快速準確掌握患者病情，為臨床治療效果評價奠定基礎，并為發現具有潛在治療價值的新型小分子藥物靶標提供幫助。


圖1 顯示全基因組關聯研究病例組和對照組的ROC曲線。顯示臨床原因不明的NOA病例組對健康男性對照組為參照的ROC曲線。
具體實施例方式實施例1樣品的收集和樣品資料的整理發明人于2005月4月開始至2011年1月從南京醫科大學生殖醫學中心收集了大量的NOA患者血標本，通過對樣品資料的整理，發明人從中選擇了 4700例符合下列標準的樣本全基因組芯片掃描和單個SNP TaqMan基因分型的實驗樣品1、重復精液質量檢測/睪丸穿刺活檢，確診為無精子癥；2、一次射精精液經離心無精子，排除梗阻性病因；3、性功能正常；排除具有隱睪癥病史、血管外傷史、睪丸炎、輸精管梗阻、輸精管切除術、多染色體異常及Y染色體無精子癥因子微缺失等具有已知病因的患者4、與病例年齡匹配的健康男性對照并系統采集了這些樣本的人口學資料和臨床資料等情況。實施例2外周血DNA中SNP的全基因組掃描在上述符合條件的1000例臨床原因不明的NOA患者和1700例健康男性對照中， 兩組年齡匹配。將這兩組人群經Affymetrixe. 0芯片檢測獲得相關結果。具體步驟為1、向儲存于2ml凍存管中的白細胞加入溶血試劑，顛倒混勻后完全轉入。2、去除紅細胞用溶血試劑將5ml離心管補至細1，顛倒混勻，4000rpm離心10分鐘，棄上清。向沉淀中加入細1溶血試劑，再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘，棄上清。3、抽提DNA:向沉淀中加Iml抽提液(每300ml中含有122. 5ml 0.2M氯化鈉， 14.4ml 0. 5M乙二胺四乙酸，15ml 10%十二烷基硫酸鈉，148. Iml雙蒸水，下同)和8 μ 1蛋白酶K，震蕩器上充分震蕩混勻，37°C水浴過夜。4、去除蛋白質加Iml飽和酚充分混勻(手輕搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘， 取上清轉入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液(氯仿異戊醇=M 1，v/v，下同)，充分混勻后(手搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘，取上清(分入兩個1. 5ml的離心管)。5、DNA沉淀在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ 1，再加入與上清液等體積的冰無水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心IOmin。6、DNA洗滌在沉淀中加入冰無水乙醇1ml，12000rpm離心lOmin，棄上清后真空抽
干或置于清潔干燥環境中蒸干。
7、測量濃度通常能得到20-50ng/ μ 1 DNA,純度(紫外2600D與2800D比值)在 1. 6-2. O08、進行全基因組掃描；9、數據分析與處理在“臨床原因不明的NOA病例”組和“健康男性對照”組中發現的基因型分布頻率有顯著差異的SNP在上文中已經羅列出，結果見表1。表1病例組與對照組全基因組關聯分析結果
位點OR回歸系數Prsl0143311.350.32.90E-05rsl07658751.290.265.30E-04rsl08892031.340.294.90E-05rsl10664531.650.58.80E-07rsl11678091.280.252.40E-04rsl20978211.410.347.90E-06rsl9902641.310.278.00E-05rs30008111.380.327.80E-05rs31300481.290.266.30E-04rs3911291.690.522.70E-07rs47165151.260.232.60E-03rs6582391.250.223.20E-03rs65891021.230.216.20E-03rs70422321.30.272.30E-04rs70992081.580.463.80E-05rs71447031.860.622.60E-06rs71941.370.316.80E-05rs9854211.390.331.20E-04 實施例3單個SNP的TaqMan基因分型將上述全基因組掃描發現與臨床原因不明的NOA發病有關的SNP在另外1000臨床原因不明的NOA病例和1000健康男性對照中進行檢測，具體步驟為1、向儲存于2ml凍存管中的白細胞加入溶血試劑，顛倒混勻后完全轉入。2、去除紅細胞用溶血試劑將5ml離心管補至細1，顛倒混勻，4000rpm離心10分鐘，棄上清。向沉淀中加入細1溶血試劑，再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘，棄上清。3、抽提DNA 向沉淀中加Iml抽提液和8 μ 1蛋白酶K，震蕩器上充分震蕩混勻， 37 °C水浴過夜。4、去除蛋白質加Iml飽和酚充分混勻(手輕搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘， 取上清轉入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液(氯仿異戊醇=M 1)，充分混勻后(手搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘，取上清(分入兩個1. 5ml 的離心管)。5、DNA沉淀在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ 1，再加入與上清液等體積的冰無水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心lOmin。6、DNA洗滌在沉淀中加入冰無水乙醇1ml，12000rpm離心lOmin，棄上清后真空抽干或置于清潔干燥環境中蒸干。7、測量濃度通常能得到20-50ng/ μ 1 DNA,純度(紫外2600D與2800D比值)在 1. 6-2. O08、進行TaqMan基因分型。對全基因組掃描發現的18個陽性關聯的SNP設計特異性引物和特異性熒光探針對(表2)。反應體系包括2. 5 μ 1 2Χ TaqMan基因分型Master Mix、每對正向和反向引物的混合物0.25μ Κ20ρπιο1/μ 1)、0. 125 μ 1 iTaqMan熒光探針 (lOpmol/μ 1,同時含有相應的兩種等位基因的熒光探針)和1. 25 μ 1雙蒸水。加入0. 5 μ 1 DNA。儀器使用的是ABI Prism 7900熒光定量PCR儀，PCR反應條件為95°C、5分鐘進行1 個循環一950C、15秒，60°C、1分鐘進行40個循環。9、基因型判讀采用ABI Prism 7900熒光定量PCR儀進行。10、數據處理和分析利用logistic回歸模型中的addtive模型比較每個SNP的三種基因型在病例組合對照組中分布頻率的差異，結果與全基因組掃描類似不再列出。實施例4利用危險度評分方法進一步分析SNP與臨床原因不明的NOA發病根據上述結果，本發明人通過對2組樣品(“臨床原因不明的NOA病例組”和“健康男性對照組”)基因型分布頻率的比較，選擇陽性關聯的SNP，以全基因組掃描樣本中單個SNP回歸系數為權重，進一步求得危險分值，繪制ROC來評估預測的靈敏性和特異性，進而評估這些SNP對臨床原因不明的NOA發病的判斷能力。對18個SNP標志物的聯合分析發現，這18個SNP以71. 8%的AUC將健康男性對照組和臨床原因不明的NOA病例組分開， 最佳臨界點的靈敏度為67.對％，特異度67. 81% (圖1)。因此，本發明人證明了采用 rsl014331、rsl0765875、rsl0889203、rsll066453、 rslll67809、rsl2097821、rsl990264、rs3000811、rs3130048、rs391129、rs4716515、 rs658239、rs6589102、rs7042232、rs7099208、rs7144703、rs7194、和 rs985421 的組合能夠很好地將健康男性對照和臨床原因不明的NOA患者區分。實施例5用于臨床原因不明的NOA輔助診斷SNP試劑盒的制作SNP試劑盒的制作和操作流程是基于AffymetriX6. 0芯片檢測和I1aqMan基因分型技術。試劑盒含有一批SNP特異性引物(包括下列引物rsl014331的引物序列為SEQ ID No :1 和 SEQ ID No 2 ；rsl0765875 的引物序列為 SEQ ID No :5和 SEQ ID No 6 ；rsl0889203 的引物序列為SEQ ID No :9禾口 SEQ ID No 10 ；rsll066453的引物序列為SEQ ID No:13禾口 SEQ ID No 14 ；rsl 1167809 的引物序列為 SEQ ID No 17 禾口 SEQ ID No 18 ；rsl2097821 的引物序列為 SEQ ID No :21 禾口 SEQ ID No 22 ；rs 1990264 的引物序列為 SEQ ID No 25 和 SEQ ID No 26 ；rs3000811 的引物序列為 SEQ ID No : 禾口 SEQ ID No 30 ；rs3130048 的引物序列為 SEQ ID No:33和 SEQ ID No 34 ；rs391U9 的引物序列為 SEQ ID No:37和 SEQ ID No 38 ；rs4716515 的引物序列為 SEQ ID No 41 和 SEQ ID No 42 ；rs658239 的引物序列為 SEQ ID No :45和 SEQ ID No 46 ；rs6589102 的引物序列為 SEQ ID No :49和 SEQ ID No 50 ； rs7042232 的引物序列為 SEQ ID No:53 禾口 SEQ ID No :54 ;rs7099208 的引物序列為 SEQ ID No :57 和 SEQ ID No 58 ；rs7144703 的引物序列為 SEQ ID No :61 禾口 SEQ ID No 62 ；rs7194 的引物序列為SEQ ID No 65和SEQ ID No 66 ；rs985421的引物序列為SEQ ID No 69和 SEQ ID No:70)、特異性熒光探針對(包括下列熒光探針rsl014331的熒光探針對序列為 SEQ ID No :3 和 SEQ ID No :4 ;rsl0765875 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :7 和 SEQ ID
1No 8 ；rsl0889203 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 11 禾口 SEQ ID No 12 ；rsl 1066453 的熒光探針對序列為SEQ ID No:15和SEQ ID No 16 ；rslll67809的熒光探針對序列為SEQ ID No 19和 SEQ ID No 20 ；rsl2097821 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :23和 SEQ ID No 24 ； rsl990264的熒光探針對序列為SEQ ID No:27和SEQ ID No 28 ；rs3000811的熒光探針對序列為SEQ ID No 31和SEQ ID No 32 ；rs3130048的熒光探針對序列為SEQ ID No 35和 SEQ ID No 36 ；rs391U9 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :39 和 SEQ ID No 40 ；rs4716515 的熒光探針對序列為SEQ ID No 43和SEQ ID No 44 ；rs658239的熒光探針對序列為SEQ ID No :47 禾口 SEQ ID No 48 ；rs6589102 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 51 和 SEQ ID No 52 ；rs7042232的熒光探針對序列為SEQ ID No 55和SEQ ID No 56 ；rs7099208的熒光探針對序列為SEQ ID No 59和SEQ ID No 60 ；rs7144703的熒光探針對序列為SEQ ID No 63 和 SEQ ID No 64 ；rs7194 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 67 和 SEQ ID No 68 ；rs985421 的熒光探針對序列為SEQ ID No:71和SEQ ID No :72)，還可以有相應PCR技術所需的常用試劑，如dNTPs，MgCl2,雙蒸水，熒光探針，Taq酶等，這些常用試劑都是本領域技術人員熟知的，另外還可以有標準品和對照(如確定基因型的標準品和空白對照等)。此試劑盒的價值在于只需要外周血而不需要其它組織樣品，通過最精簡和特異的引物及熒光探針對檢測 SNP，再通過SNP譜輔助判斷臨床原因不明的Ν0Α，不僅穩定，檢測方便，且精確，大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實踐，可以幫助指導診斷和更有效的個體化治療。表2.相關SNP引物和探針信息
權利要求
1.一種與臨床原因不明的非梗阻性無精子癥輔助診斷相關的SNP標志物，其特征在于該標志物為 rsl014331、rsl0765875、rsl0889203、rsll066453、rslll67809、rsl2097821、 rsl990264、rs3000811、rs3130048、rs391129、rs4716515、rs658239、rs6589102、 rs7042232、rs7099208、rs7144703、rs7194、和 rs985421 的組合。
2.權利要求1所述的SNP標志物的特異性引物，其特征在于該引物為rsl014331的引物序列為SEQ ID No :1和SEQ ID No :2 ;rsl0765875的引物序列為SEQ ID No 5 和 SEQ ID No 6 ；rsl0889203 的引物序列為 SEQ ID No 9 和 SEQ ID No 10 ； rsl 1066453 的引物序列為 SEQ ID No: 13 禾口 SEQ ID No 14 ;rsl 1167809 的引物序列為 SEQ ID No 17 和 SEQ ID No 18 ；rsl2097821 的引物序列為 SEQ ID No 21 和 SEQ ID No 22 ；rsl990264 的引物序列為 SEQ ID No 25 和 SEQ ID No 26 ；rs3000811 的引物序列為 SEQ ID No : 和 SEQ ID No :30 ;rs3130048 的引物序列為 SEQ ID No 33 和 SEQ ID No: 34 ;rs391129 的引物序列為 SEQ ID No 37 禾Π SEQ ID No :38 ;rs4716515 的引物序列為 SEQ ID No :41 禾口 SEQ ID No 42 ；rs658239 的引物序列為 SEQ ID No 45 禾口 SEQ ID No 46 ； rs6589102 的引物序列為 SEQ ID No 49 和 SEQ ID No 50 ；rs7042232 的引物序列為 SEQ ID No 53 和 SEQ ID No 54 ；rs7099208 的引物序列為 SEQ ID No 57 和 SEQ ID No 58 ； rs7144703 的引物序列為 SEQ ID No :61 和 SEQ ID No :62 ;rs7194 的引物序列為 SEQ ID No 65 和 SEQ ID No 66 ；rs985421 的引物序列為 SEQ ID No 69 和 SEQ ID No :70。
3.權利要求1所述的SNP標志物的特異性熒光探針對，其特征在于該熒光探針為rsl014331的熒光探針對序列為SEQ ID No 3和SEQ ID No 4 ；rsl0765875的熒光探針對序列為SEQ ID No 7和SEQ ID No 8 ；rs 10889203的熒光探針對序列為SEQ ID No 11 和 SEQ ID No 12 ；rsl 1066453 的熒光探針對序列為 SEQ ID No 15 和 SEQ ID No 16 ； rslll67809的熒光探針對序列為SEQ ID No:19和SEQ ID No :20 ;rsl2097821的熒光探針對序列為SEQ ID No 23和SEQ ID No 24 ；rs 1990264的熒光探針對序列為SEQ ID No 27 和 SEQ ID No :28 ;rs3000811 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :31 和 SEQ ID No 32 ； rs3130048的熒光探針對序列為SEQ ID No 35和SEQ ID No 36 ；rs391129的熒光探針對序列為SEQ ID No 39和SEQ ID No 40 ；rs4716515的熒光探針對序列為SEQ ID No 43和 SEQ ID No 44 ；rs658239 的熒光探針對序列為 SEQ IDNo 47 和 SEQ ID No 48 ；rs6589102 的熒光探針對序列為SEQ ID No:51和SEQ ID No 52 ；rs7042232的熒光探針對序列為SEQ ID No :55 禾口 SEQ ID No 56 ；rs7099208 的熒光探針對序列為 SEQ ID No :59 禾口 SEQ ID No 60 ；rs7144703的熒光探針對序列為SEQ ID No :63和SEQ ID No :64 ;rs7194的熒光探針對序列為SEQ ID No 67和SEQ ID No 68 ；rs985421的熒光探針對序列為SEQ ID No 71和 SEQ ID No :72ο
4.權利要求1所述的SNP標志物在制備臨床原因不明的非梗阻性無精子癥輔助診斷試劑盒中的應用。
5.權利要求2所述的SNP標志物的特異性引物在制備臨床原因不明的非梗阻性無精子癥輔助診斷試劑盒中的應用。
6.權利要求3所述的SNP標志物的特異性熒光探針對在制備臨床原因不明的非梗阻性無精子癥輔助診斷試劑盒中的應用。
7.一種臨床原因不明的非梗阻性無精子癥輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測外周血 DNA 中 rsl01433U rsl0765875、rsl0889203、rsll066453、rslll67809、 rsl2097821、rsl990264、rs3000811、rs3130048、rs391129、rs4716515、rs658239、 rs6589102、rs7042232、rs7099208、rs7144703、rs7194、和 rs985421。
8.根據權利要求7所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權利要求2所述SNP 標志物的特異性引物和/或權利要求3所述SNP標志物的特異性熒光探針對。
9.根據權利要求7或8所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還可以包括PCR技術常用的試劑。
全文摘要
本發明屬于基因工程及生殖醫學領域，公開了一種與臨床原因不明的非梗阻性無精子癥輔助診斷相關的SNP標志物及其應用。該標志物為rs1014331、rs10765875、rs10889203、rs11066453、rs11167809、rs12097821、rs1990264、rs3000811、rs3130048、rs391129、rs4716515、rs658239、rs6589102、rs7042232、rs7099208、rs7144703、rs7194、和rs985421的組合。該標志物可用于制備臨床原因不明的非梗阻性無精子癥輔助診斷試劑盒。
文檔編號C12N15/11GK102399898SQ20111040738
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月9日 優先權日2011年12月9日
發明者周作民, 沈洪兵, 沙家豪, 胡志斌, 董靜 申請人:南京醫科大學