專利名稱：一種大腸桿菌NrfA基因表達蛋白多克隆抗體及其制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及大腸桿菌亞硝酸鹽還原酶的編碼基因NrfA 的表達蛋白的多克隆抗體及其制備方法。
背景技術：
亞硝酸鹽還原酶(Nitrite reductase)是反硝化過程中的關鍵作用酶，它催化亞硝酸鹽還原，在氮循環過程中，它可以減少正常條件下生物體內亞硝態氮積累，降低因亞硝酸鹽累積對生物體的毒害作用。近年來，人們已認識到由于土壤中氮肥的流失和生活污水的含氮量過高已導致了水體富營養化，進而給人們生存的環境帶來的嚴重而深遠的影響。 通過微生物亞硝酸鹽還原酶的作用可有效減輕水體中的氮污染。大腸桿菌亞硝酸鹽還原酶的研究較深入，已經獲得了負責編碼大腸桿菌亞硝酸鹽還原酶的DNA片段——NrfA基因序列。但NrfA表達蛋白的多克隆抗體制備方法未見報道。NrfA表達蛋白的多克隆抗體對于研究NrfA基因表達的機理有重要的作用，為進一步深入研究微生物亞硝酸鹽還原酶的作用機理與活性調節提供基礎。該多克隆抗體可用于研究其他微生物中亞硝酸鹽還原酶與大腸桿菌亞硝酸鹽還原酶的之間的相關性與差別。

發明內容
本發明的目的在于提供一種大腸桿菌NrfA基因表達蛋白多克隆抗體及其制備方法和在檢測其他細菌相關蛋白中的應用。本發明的原理如下
首先以大腸桿菌基因組DNA為模板，PCR擴增得到NrfA基因編碼區，構建pET48a ( + )-NrfA表達載體，將其轉化大腸桿菌BL21 (DE3)細胞；在大腸桿菌中經IPTG誘導后， 進行NrfA蛋白表達；表達后的重組蛋白經過本專利中摸索到的最佳轉速即可獲得較好的純化效果；再將純化后目的蛋白免疫新西蘭雄兔，制備多克隆抗體；制得的多克隆抗體用 ELISA方法檢測抗體的效價。本發明的技術方案
一種大腸桿菌NrfA基因表達蛋白多克隆抗體，通過如下方法制備
(1)、大腸桿菌基因組DNA的提取
按Omega公司細菌基因組DNA提取試劑盒的使用方法提取大腸桿菌基因組DNA ； 所述的大腸桿菌為BL21 (DE3)；
(2)、目的基因NrfA的PCR擴增
參照GenBank CP001665. 1中報道的大腸桿菌NrfA基因全序列設計引物 上游引物為 CGGGATCCATGACAAGGATAAAAATAAACG 下游引物為 GGCCTCGAGTTATTGGCTTAACAGACC ；
以步驟(1)提取的大腸桿菌基因組為模板，PCR擴增目的基因片段，PCR反應條件為94°C預變性^iin ；94°C變性45s，60°C退火45s，72 °C延伸45s，共30個循環；72°C延伸 lOmin，得PCR擴增產物；
用1%瓊脂糖電泳檢測PCR擴增的產物；
(3)、重組質粒pETj8a( + ) -NrfA的構建
將(2)所得的PCR擴增產物經BamH I和Biol I分別在GGATCC、CTCGAG位點雙酶切， 回收目的片段NrfA，與經同樣酶切并回收后的pETj8a ( + )表達載體在10 XT4連接酶緩沖液中采用T4 DNA連接酶進行連接，連接產物再轉化大腸桿菌TGl細胞，上述獲得的重組質粒用PCR和雙酶切方法鑒定，鑒定成功的重組質粒經北京六和華大基因科技股份有限公司進行序列測定，最終測序結果表明該重組質粒構建成功，并命名為重組質粒PETISa (+ ) -NrfA ；
其中連接產物轉化大腸桿菌E. coli TGl細胞操作過程如下
①、取步驟(3)中所得的連接產物5yL，加到200yLΕ. coli TGl感受態細胞懸液中， 輕輕混勻，冰上放置30min ；
②、42°C水浴熱激90sec，迅速取出置冰上冷卻5min；
③、加入800μ L 37°C預熱的LB液體培養基，混勻后37°C水浴lh，使細菌恢復正常生長狀態；
④、4000r/m離心lOmin，棄800μ L上清，取剩余的200 μ L菌液均勻涂布于LB固體培養基平板上，37°C正面向上放置30min，待菌液完全被培養基吸收后倒置培養8_12h ；
(4)、NrfA蛋白的表達、純化
將步驟(3)所得的重組質粒pET48a ( + )_NrfA轉化大腸桿菌BL21 (DE3)進行表達，挑取單克隆培養后，所得的陽性克隆培養物以洲接種量接種于卡那霉素含量為50mg/ml的LB 培養基，37°C搖床培養至對數生長期，加入終濃度為lmmol/1的IPTG進行誘導，37°C、220r/ m搖床培養4h ；離心收集菌體，菌體經pH7. 4的PBS洗滌三次，超聲波裂解細胞，離心收集沉淀；
沉淀依次經洗滌液I、洗滌液II、溶解液III分別洗滌三次，每次轉速6000rpm，最后得到的沉淀部分即為粗NrfA目的蛋白；
所述的洗滌液 I 為 50mmol/L Tris-HCl, lmmol / L EDTA，1% TrionX-IOO，pH8. O ； 所述的洗滌液 II 為 20mmol/L Tris-HCl, lmmol / L EDTA，4mol/ L 尿素，pH8. O ； 所述的洗滌劑 III 為 50mmol/L Tris-HCl, lmmol / L EDTA,8mol/ L 尿素，5mmol / L3-巰基乙醇，pH8. O ；
將粗NrfA目的蛋白經超濾管離心超濾脫去脲素即得NrfA目的蛋白； 重組質粒ρΕΤ48ει ( + )_NrfA轉化大腸桿菌BL21 (DE3)細胞操作過程同步驟(3)中的連接產物轉化大腸桿菌E. coli TGl細胞的操作過程；
(5)、多克隆抗體的制備與鑒定多克隆抗體的制備
步驟(4)所得的NrfA目的蛋白經pH7. 4的PBS溶液調整，使其終濃度為0. 2mg/ml，再以1 :1比例與弗氏完全佐劑混合，常規方法免疫新西蘭雄兔1次，按同樣方法，1 :1比例與弗氏不完全佐劑(FIA)混合，再免疫雄兔2次，然后頸動脈取血，分離血清，即得到一種大腸桿菌NrfA基因表達蛋白多克隆抗體。
多克隆抗體的鑒定
上述一種大腸桿菌NrfA基因表達蛋白多克隆抗體用ELISA檢測其效價為其效價為1 204900。本發明的有益效果
本發明的一種大腸桿菌NrfA基因表達蛋白多克隆抗體，對于研究NrfA基因表達的機理有重要的作用，為進一步深入研究微生物亞硝酸鹽還原酶的作用機理與活性調節提供基礎。該多克隆抗體也可用于研究其他微生物中亞硝酸鹽還原酶與大腸桿菌亞硝酸鹽還原酶的之間的相關性與差別。


圖1、NrfA基因PCR擴增圖，圖中M為DNA分子量標準，1為陰性對照，2為NrfA 基因PCR擴增產物；
圖2、pET-28a ( + ) -NrfA重組載體雙酶切鑒定圖，圖中M為DNA分子量標準，1為重組質粒，2為雙酶切重組質粒；
圖3、pET-28a ( + ) -NrfA重組載體PCR鑒定圖，M為DNA分子量標準，1為陰性對照，2為質粒PCR擴增產物；
圖4、重組蛋白純化SDS-PAGE圖，圖中M為低分子量蛋白標準，1為純化的重組蛋白；
圖5、多克隆抗體效價測定結果圖6、多克隆抗體的Western blotting分析圖，圖中M為低分子量蛋白標準，1為純化的重組蛋白；
圖7、重組質粒pET-28a ( + ) -NrfA圖。
具體實施例方式下面通過實施例并結合附圖對本發明進一步闡述，但并不限制本發明。本發明所用的pETj8a ( + )、E.coli TGU Ε. coll BL21 (DE3)，由本實驗室保存; 本發明用的pETj8a ( + )作為表達載體；
本發明用的E. coli TGl作為克隆宿主菌；
本發明用的E. coli BL21 (DE3)作為目的基因NrfA表達菌和用作大腸桿菌基因組DNA 的提取。大腸桿菌NrfA基因表達蛋白多克隆抗體用ELISA檢測其效價。該方法參考文獻如下陳俊峰，賈敬亮，張紅艷.酶聯免疫法檢測生鮮乳中三聚氰胺的研究[J].《乳業科學與技術》，2011，1:30-32.張存政，楊春龍，劉賢進，陳敏等.酶聯免疫法檢測新型除草劑雙甲胺草磷[J]. 《分析化學(FENXI HUAXUE)研究報告》，2011, 39(2) 225-230.張金鳳，劉春娃.溶血標本對酶聯免疫法檢測HBsAg的影響[J].《醫學檢驗》，2011，18(7) :92.李玲，曾慶坤，唐艷.雙抗體夾心酶聯免疫法測定水牛初乳中的IgG[J],《食品工業科技》，2011，3:382-384.
發明測定方法中所用主要試劑蛋白胨、牛肉膏和酵母粉抽提物購自Oxoid公司(英國)；IPTG、Kanamycin購自上海生工生物公司；DNA回收試劑盒購自Biomiga公司；Taq DNA 聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶BamH K Xho I及其配套緩沖液購自i^ermentas公司；HRP標記的羊抗兔IgG購自北京鼎國生物技術公司；PVDF膜為美國Millipore公司產品；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；其他化學試劑均為國產分析純。本發明所用主要測定儀器高速離心機、96孔板、多功能酶標儀購自美國Thermo Fisher公司；SYQ-DSX-280型滅菌鍋(上海申安醫療器械廠)；PHSJ-4A型PH計(上海大中分析儀器廠)；SHP-150型C02恒溫培養箱(上海精宏設備有限公司)。實施例1
一種大腸桿菌NrfA基因表達蛋白多克隆抗體，通過如下方法制備
(1)、大腸桿菌BL21(DE3)基因組DNA的提取
按Omega公司細菌基因組DNA提取試劑盒的使用方法提取大腸桿菌基因組DNA ；
(2)、目的基因NrfA的PCR擴增
參照GenBank CP001665. 1中報道的大腸桿菌NrfA基因全序列設計引物； 上游引物為 CGGGATCCATGACAAGGATAAAAATAAACG ； (BamH I) 下游引物為 GGCCTCGAGTTATTGGCTTAACAGACC (Xhol I)。以步驟(1)提取的大腸桿菌BL21 (DE3)的基因組為模板，PCR擴增目的基因片段； PCR擴增反應條件為94 V預變性^iin ；94 V變性45s，60 V退火45s，72°C延伸45s，共
30個循環；72°C延伸IOmin ；
用1%瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產物，NrfA基因PCR擴增圖見圖1所示，從圖1中可以看出已成功擴增出與目的片段NrfA大小(1437bp)相符的DNA片段；
(3)、重組質粒pETj8a( + ) -NrfA的構建
將步驟(2)所得的PCR擴增產物用BamH I和)(hol I分別在GGATCC、CTCGAG位點雙酶切，回收目的片段NrfA，與經同樣酶和同樣位點酶切并回收后的pETj8a ( + )表達載體連接，
連接反應如下
回收_切pET-32a(+)載體 6μΙ·
回收的目的基因片段2μ
T4DNA SSiI1μΧ
10 ΧΤ4連誦緩沖液1μ
室溫反應30min，然后80°C保溫10 min,冷卻后4°C，再用連接產物轉化大腸桿菌 E. coli TGl細胞，獲得重組質粒PETj8a( + )-NrfA，其結果見圖7 ；獲得的重組質粒ρΕΤ48ει (+ ) -NrfA用PCR和雙酶切方法鑒定
pET-28a ( + )_NrfA重組載體PCR鑒定圖如圖3所示，從圖3中可以看出構建好的載體經NrfA基因序列的上、下游引物PCR擴增成功；
pET-28a ( + )_NrfA重組載體雙酶切鑒定圖見圖2所示，從圖2中可以看出構建好的載
6體經BamH I和Biol I分別在GGATCC、CTCGAG位點雙酶切成功；
用DNA測序儀常規方法測定重組質粒的序列。測序結果表明該重組質粒構建成功，并命名為重組質粒pETj8a ( + ) -NrfA ；
其中連接產物轉化大腸桿菌E. coli TGl細胞操作過程如下
①、取連接產物5yL，加到200μ Ε. coli TGl細胞懸液中，輕輕混勻，冰上放置 30min ；
②、42°C水浴熱激90sec，迅速取出置冰上冷卻5min；
③、加入800μ L 37°C預熱的LB液體培養基，混勻后37°C水浴lh，使細菌恢復正常生長狀態；
④、4000r/m離心lOmin，棄800μ L上清，取剩余的200 μ L菌液均勻涂布于LB固體培養基平板上，37°C正面向上放置30min，待菌液完全被培養基吸收后倒置培養8_12h ；
(4)、NrfA蛋白的表達、純化、
將步驟(3)構建成功的重組質粒ρΕΤ48ει ( + ) -NrfA轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)細胞，挑取單克隆培養后用與步驟(2)中相同的PCR條件進行擴增鑒定，陽性克隆培養物以洲接種量接種LB培養基(50mg/ml卡那霉素)，37°C搖床培養至對數生長期，加入終濃度為lmmol/1的IPTG進行誘導，37°C、220rpm搖床培養4h ；離心收集菌體，菌體經pH7. 4的 PBS重懸并重復洗滌三次，超聲波裂解細胞，離心收集沉淀，沉淀依次經洗滌液I (50mmol/ L Tris-HCl, lmmol / L EDTA ,1% TrionX-IOO，ρΗ8· 0)、洗滌液II (20mmol/L Tris-HCl, lmmol / L EDTA，4mol/ L 尿素，pH8. 0)、溶解液(50mmol/L Tris-HCl, lmmol / L EDTA, 8mol/ L尿素，5mmol / L β -巰基乙醇，pH8. 0)分別洗滌三次，每次轉速6000rpm，最后得到的沉淀部分即為粗NrfA目的蛋白；
粗NrfA目的蛋白SDS-PAGE圖見圖4所示，從圖4中可以看出經純化后的粗NrfA目的蛋白已經獲得較好的純化效果。將純化后的粗NrfA目的蛋白再經超濾管離心超濾脫去脲素，得NrfA目的蛋白，具體操作方法為
將NrfA目的蛋白溶液經pH7. 4的PBS溶液10倍稀釋后，與pH7. 4的PBS溶液1 1混合，經超濾管于3500g，4°C下離心lOmin，得到的蛋白溶液繼續以1:1比例與pH7. 4的PBS 溶液混合，經相同條件超濾，重復此操作，直至最后剩余的蛋白溶液體積為Iml左右，即得 NrfA目的蛋白；
其中重組質粒ρΕΤ48ει ( + )-NrfA轉化大腸桿菌BL21 (DE3)細胞操作過程同步驟(3) 中連接產物轉化大腸桿菌E. coli TGl細胞的操作過程。(5)、多克隆抗體的制備與鑒定
多克隆抗體的制備
步驟(4)所得的NrfA目的蛋白用pH7. 4的PBS溶液調整，使其終濃度為0. 2mg/ml，再以1 :1比例與弗氏完全佐劑(FCA)混合，常規方法免疫新西蘭雄兔1次，按同樣方法，1 :1 比例與弗氏不完全佐劑(FIA)混合，免疫雄兔2次。然后頸動脈取血，分離血清，得到一種大腸桿菌NrfA基因表達蛋白多克隆抗體；
多克隆抗體的鑒定
將制得的多克隆抗體，用ELISA檢測其效價，最終所得的多克隆抗體的效價為1 204900，其結果見圖5，從圖5中可以看出制得的多克隆抗體具有較高的效價；得到的多克隆抗體經Western blotting分析，其結果見圖6，從圖6中可以看出抗體的特異性較好。以上所述內容僅為本發明構思下的基本說明，而依據本發明的技術方案所做的任何等效變換，均應屬于本發明的保護范圍。以下是本發明中出現的核苷酸序列的總結 seq id no:廣2是本發明所用的引物序列 sequnce listing
(110)上海應用技術學院
〈120〉一種大腸桿菌NrfA基因表達蛋白多克隆抗體及其制備方法 〈160〉 2 < 210 > 1
<211 > 30
<212 >
<213 >
<400 > 1
cgggatccat gacaaggata aaaataaacg ；
<210 > 2
<211 > 27
<212 >
<213 >
<400 > 2
ggcctcgagt tattggctta ACAGACC0
權利要求
1. 一種大腸桿菌NrfA基因表達蛋白多克隆抗體，其特征在于通過如下方法制備(1)、大腸桿菌基因組DNA的提取按Omega公司細菌基因組DNA提取試劑盒的使用方法提取大腸桿菌基因組DNA ；所述的大腸桿菌為BL21 (DE3)；(2)、目的基因NrfA的PCR擴增上游引物為 CGGGATCCATGACAAGGATAAAAATAAACG ；下游引物為 GGCCTCGAGTTATTGGCTTAACAGACC ；以步驟(1)提取的大腸桿菌基因組為模板，通過PCR擴增目的基因片段，PCR反應條件為:94°C預變性^iin ；94°C變性45s，60°C退火45s，72°C延伸45s，共30個循環；72°C延伸 lOmin，得PCR擴增產物；(3)、重組質粒pETj8a( + ) -NrfA的構建將(2)所得的PCR擴增產物經BamH I和Biol I分別在GGATCC、CTCGAG位點雙酶切， 回收目的片段NrfA，與經同樣酶切并回收后的pETj8a ( + )表達載體在10 XT4連接酶緩沖液中采用T4 DNA連接酶進行連接，連接產物再轉化大腸桿菌E. coli TGl細胞，得到重組質粒 pET48a ( + ) -NrfA ；(4)、NrfA蛋白的表達、純化將步驟(3)所得的重組質粒pET48a ( + )_NrfA轉化大腸桿菌BL21 (DE3)進行表達，挑取單克隆培養后，所得的陽性克隆培養物以洲接種量接種于卡那霉素含量為50mg/ml的LB 培養基，37°C搖床培養至對數生長期，加入終濃度為lmmol/1的IPTG進行誘導，37°C、220r/ m搖床培養4h ；離心收集菌體，菌體經pH7. 4的PBS洗滌三次，超聲波裂解細胞，離心收集沉淀；沉淀依次經洗滌液I、洗滌液II、溶解液III分別洗滌三次，每次轉速6000rpm，最后得到的沉淀部分即為粗NrfA目的蛋白；所述的洗滌液 I 為 50mmol/L Tris-HCl, lmmol / L EDTA，1% TrionX-IOO，pH8. O ；所述的洗滌液 II 為 20mmol/L Tris-HCl, lmmol / L EDTA，4mol/ L 尿素，pH8. O ；所述的洗滌劑 III 為 50mmol/L Tris-HCl, lmmol / L EDTA,8mol/ L 尿素，5mmol / L3-巰基乙醇，pH8. O ；將粗NrfA目的蛋白經超濾管離心超濾脫去脲素即得NrfA目的蛋白；(5)、多克隆抗體的制備將步驟(4)所得的NrfA目的蛋白經pH7. 4的PBS溶液調整，使其終濃度為0. 2mg/ml, 再以1 :1比例與弗氏完全佐劑混合，常規方法免疫新西蘭雄兔1次，按同樣方法，1 :1比例與弗氏不完全佐劑混合，再免疫雄兔2次，然后頸動脈取血，分離血清，即得到一種大腸桿菌NrfA基因表達蛋白多克隆抗體。
全文摘要
一種大腸桿菌NrfA基因表達蛋白的多克隆抗體制備方法以大腸桿菌基因組DNA為模板，PCR擴增得到NrfA基因編碼區，構建pET-28a(+)-NrfA表達載體，轉入大腸桿菌BL21(DE3)后，經IPTG誘導表達并純化重組蛋白；再免疫新西蘭雄兔，制備多克隆抗體；免疫獲得的多克隆抗體用ELISA檢測，其效價為1204900，經Westernblotting分析，抗體的特異性較好。該多克隆抗體可用于研究其他微生物中亞硝酸鹽還原酶與大腸桿菌亞硝酸鹽還原酶之間的相關結構與功能。也為進一步深入研究大腸桿菌亞硝酸鹽還原酶的作用機理與活性調節提供基礎。
文檔編號C12N9/06GK102558353SQ201110407260
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月9日 優先權日2011年12月9日
發明者何婷婷, 高然, 龔鋼明 申請人:上海應用技術學院