一種紅霉素鏈霉菌發酵生產紅霉素的培養基和培養方法
【專利摘要】本發明涉及一種紅霉素鏈霉菌發酵生產紅霉素的新型培養基和培養方法，其一級種子培養基、二級種子培養基和發酵培養基中均含有甘蔗糖蜜、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。本發明通過采用甘蔗糖蜜替代葡萄糖；啤酒酵母干渣和蚯蚓粉代替黃豆粉、蛋白胨、花生餅粉和玉米漿，優化其培養基配方，從而解決了原輔料的成本問題，并且最大限度的降低原輔料來源不受環境影響，保證其供應充足，實現紅霉素穩定、高效的生產。同時利用該培養基可提高發酵單位、縮短發酵周期、提高紅霉素A組分。
【專利說明】一種紅霉素鏈霉菌發酵生產紅霉素的培養基和培養方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于發酵【技術領域】，特別是涉及一種紅霉素鏈霉菌發酵生產紅霉素的培養基和培養方法。
【背景技術】
[0002]紅霉素是大環內酯類抗生素，抗菌譜與青霉素相似。
[0003]目前，國內生產廠家使用紅色鏈霉素，采用三級發酵的模式生產紅霉素。其種子培養基、發酵培養基主要采用淀粉和葡萄糖作為碳源；豆餅粉、花生餅粉、玉米漿或蛋白胨作為氮源，使用常規原輔料發酵生產紅霉素存在的主要問題:
[0004]I發酵成本高。采用該配方，其原輔料的消耗占到生產成本的65%左右。
[0005]2增加企業的采購成本。紅霉素種子培養基、發酵培養基氮源組成至少在3種以上，增加了企業的采購工作量和采購成本。
[0006]3 一級種子培養的接種量較大。國內部分廠家的紅霉素生產規模可以達到萬噸/年，其一級種子培養發酵罐的體積超過了 5m3，常規配方的一級種子培養接種量為1.5~2L/M3，增加了菌種研究人員的工作強度和工作量。
[0007]4種子培養的周期長。常規配方的紅霉素種子培養周期為35~40h。
[0008]5紅霉素發酵單 位較低。使用常規原輔料的培養基，紅霉素的發酵單位一般在8000 ~9000u/ml。
[0009]6常規培養基在滅菌過程中，部分葡萄糖在高溫狀態容易碳化，使種子液和發酵液的顏色變深，降低培養基質量，影響種子培養和發酵培養的效果。
[0010]7紅霉素A組分偏低。使用常規原輔料的培養基，紅霉素A的組分一般控制在
62 ~68%ο
[0011 ] 8)發酵過程中，還需補入氨基酸。隨著發酵時間的延長，發酵液中的氨基酸含量降低，需要補入氨基酸。

【發明內容】

[0012]本發明目的就在于克服上述現有技術的缺陷，提供一種減少接種量，有效提高發酵單位，縮短發酵周期，同時最大限度的降低原輔料用量，降低生產成本，且原輔料來源不受環境影響，保證其供應充足，實現紅霉素穩定、高效地生產的培養基。
[0013]本發明的另一目的是提供利用上述培養基生產紅霉素的培養方法。
[0014]為實現上述目的所采取的技術方案為:
[0015]一種紅霉素鏈霉菌發酵生產紅霉素的培養基，包括一級種子培養基、二級種子培養基和發酵培養基，其特征在于上述一級種子培養基、二級種子培養基和發酵培養基中均含有甘蔗糖蜜、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。
[0016]所述一級種子培養基的組成為:甘蔗糖蜜15~20g/L、油5~10ml/L、啤酒酵母干渣20~25g/L、蚯蚓粉8~12g/L、硫酸銨0.03~0.05g/L、氯化鈉0.9~lg/L、輕質碳酸鈣(λ 2~0.4g/L、硅油消泡劑0.01~0.03g/L。
[0017]所述二級種子培養基的組成為:甘蔗糖蜜25~30g/L、油12~16ml/L、啤酒酵母干渣25~30g/L、蚯蚓粉11~17g/L、硫酸銨0.06~0.08g/L、氯化鈉0.9~lg/L、輕質碳酸鈣0.4~0.6g/L、硅油消泡劑0.02~0.04g/L。
[0018]所述發酵培養基的組成為:甘蔗糖蜜25~35g/L、油10~15ml/L、啤酒酵母干渣30~35g/L、蚯蚓粉15~20g/L、硫酸銨0.07~0.09g/L、氯化鈉0.9~lg/L、輕質碳酸鈣0.4~0.6g/L、S-腺苷甲硫氨酸I~5g/L、氯化鈷0.006~0.008g/L硫酸鎂0.04~0.05g/L、硫酸鋅0.03~0.05g/L、硫酸銅0.06~0.08g/L、硅油消泡劑0.02~0.03g/L。
[0019]所述啤酒酵母干渣的質量要求為:
[0020]蛋白質含量≥45% ;磷含量≥60ug/ml ;水分≥5% ;灰分≥5% ;碳水化合物≥12% ；干渣顆粒通過60目篩的數量≥80%。
[0021]所述蚯蚓粉的質量要求:蛋白質含量≥60% ;水分≤10% ;粒度能通過80目篩。
[0022]所述甘蔗糖蜜在使用前進行預處理，預處理過程為:
[0023]I)甘蔗糖蜜中加入飲用水，使其粘度控制在IOOcp以下；
[0024]2 )加熱升溫至30~35 °C，
[0025]3)超濾，超濾膜材料為醋酸纖維素或聚氧乙烯，超濾過程中，物料的流量控制在4~5L/min，超濾壓力控制在0.2MPa
[0026]4)加入蔗糖轉化酶，蔗糖轉化酶用量(g)=蔗糖甜蜜重量(kg) X0.35。
[0027]—種紅霉素鏈霉菌利用上述一級種子培養基、二級種子培養基和發酵培養基發酵生產紅霉素的培養方法，其特征在于其工藝步驟為:首先將已經培養好的紅霉素鏈霉菌母瓶發酵液按照0.8~lL/m3接種量接入一級種子培養基中進行一級種子培養，至菌體濃度35~40%、pH值7~8、培養周期為20~25h時轉移到二級種子培養基中進行二級種子培養，至菌體濃度35~40%、pH值7~8、培養周期為22~27h時轉移至發酵培養基中培養，至發酵單位在11000u/ml以上且每6~8h檢測的發酵單位相差300u/ml以內、菌體濃度35~40%、發酵周期為150~160h、pH值6~8、氨基氮5~10mg/100ml、總糖O~5g/100ml時終止發酵。
[0028]所述一級種子培養基、二級種子培養基和發酵培養基在使用前首先進行滅菌，其中
[0029]滅菌后的一級種子培養基的質量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷>50ug/ml、總糖 30 ~40g/100ml、ρΗ6.5 ~7.5 ;
[0030]滅菌后的二級種子培養基的質量要求:氨基氮60~70mg/100ml、溶磷>50ug/ml、總糖 30 ~40g/100ml、pH:6.5 ~7.5 ;
[0031]滅菌后的發酵培養基的質量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷>60ug/ml、總糖40 ~50g/100ml、pH:6 ~7。
[0032]所述一級種子培養條件為:
[0033]1)罐壓:控制在 0.04 ~0.06MPa,
[0034]2)罐溫:發酵前5h，罐溫控制在31~32°C ；6h至一級種子培養結束，罐溫控制在33 ~34°C，
[0035]3)空氣流量:0~5h，100~150m3/h ；6h至一級種子培養結束:200~250m3/h，[0036]4) pH:控制在 7 ~8，
[0037]5)攪拌轉速:0~5h,采用氣流攪拌；6h至一級種子培養結束:采用機械攪拌，轉速控制在110r/min。
[0038]所述二級種子培養條件為:
[0039]1)罐壓:控制在 0.04 ~0.06MPa,
[0040]2)罐溫:發酵前5h，罐溫控制在31~32°C ；6h至二級種子培養結束，罐溫控制在33 ~34°C，
[0041]3)空氣流量:0~5h，300~350m3/h ；6h至二級種子培養結束:350~400m3/h，
[0042]4) pH:控制在 7 ~8，
[0043]5)攪拌轉速:0~5h,采用氣流攪拌；6h至一級種子培養結束:采用機械攪拌，轉速控制在100r/min。
[0044]所述發酵培養條件為:
[0045]I) pH控制:控制在6~8 ;
[0046]2)無菌檢查:發酵過程中進行菌檢，要求無其它雜菌；
[0047]3)空氣流量:0 ~15h: 1000mVh ；16h ~發酵結束:800m3/h ；
[0048]4)溶氧控制:
[0049]O~30h:溶氧濃度不得低于60% ；
[0050]31~120h:溶氧濃度控制在30~50% ；
[0051]12 Ih~放罐:溶氧濃度控制在40%以上；
[0052]5)攪拌轉速:
[0053]O ~30h:攬祥轉速 80 ~90r/min ；
[0054]31 ~120h:攪拌轉速 100 ~110r/min ；
[0055]12 Ih~放罐:攪拌轉速70~80r/min ；
[0056]6)培養溫度:
[0057]O ~30h:34 ~35.(TC ；
[0058]31 ~IOOh:32 ~33°C ；
[0059]IOlh ~放罐:30 ~31?。
[0060]7)罐壓:罐壓控制在0.04~0.06MPa。
[0061]在發酵過程中進行補料，包括補糖、補水、補入正丙醇和補油，其中
[0062]I)補糖控制:當pH > 7.3時，采用流加法，補入粘度在500~600cp的甘蔗糖蜜溶液，當pH達到6.9時，停止補料；
[0063]2)補水:
[0064]120h之前，當菌體濃度超過40%，采用流加法補入飲用水，控制其菌體濃度在35~40%,
[0065]120h至發酵結束:當菌體濃度超過35%，補入飲用水，控制其菌體濃度在30~35% ；
[0066]3)補入正丙醇:發酵周期在30h、50h、90h、110h、130h分別加入已滅菌的正丙醇，其加入量為發酵液體積的0.1~0.2%;
[0067]4)補油:采用流加法補油，發酵至15h開始補豆油，具體控制如下:[0068]10 ~80h:15 ~20L/h ；
[0069]81 ~120h:30 ~35L/h ；
[0070]121h~放罐:不補油。
[0071]上述油可以是豆油、玉米油或菜籽油。
[0072]本發明的技術優勢為:
[0073]I)發酵成本低。首先啤酒酵母干渣、蚯蚓粉由于產量較大，市場價格較低，便于采購，其次使用啤酒酵母干渣、蚯蚓粉代替了常規種子培養基、發酵培養基中的氮源，減少了氮源的用量，降低了采購和生產成本，減少因原料質量影響種子液和發酵液質量的不利因素。
[0074]2)蛋白質和氨基酸含量較高，本發明培養基中的的總生物素含量高于常規培養基。根據相關文獻報道，紅霉素發酵過程中，蛋白質和氨基酸對其產量和組分影響較大，本發明培養基中的蛋白質含量達到55%以上，氨基酸含量明顯高于常規種子培養基配方，有利于改善紅霉素鏈霉菌菌絲形態；提高種子培養的質量。
[0075]不同原輔料的氨基氮含量對比表
[0076]
【權利要求】
1.一種紅霉素鏈霉菌發酵生產紅霉素的培養基，包括一級種子培養基、二級種子培養基和發酵培養基，其特征在于上述一級種子培養基、二級種子培養基和發酵培養基中均含有甘蔗糖蜜、啤酒酵母干渣和蚯蚓粉。
2.按照權利要求1所述的紅霉素鏈霉菌發酵生產紅霉素的培養基，其特征在于所述一級種子培養基的組成為:甘鹿糖蜜15~20g/L、油5~10ml/L、啤酒酵母干洛20~25g/L、蚯蚓粉8~12g/L、硫酸銨0.03~0.05g/L、氯化鈉0.9~lg/L、輕質碳酸鈣0.2~0.4g/L、硅油消泡劑0.01~0.03g/L。
3.按照權利要求1所述的紅霉素鏈霉菌發酵生產紅霉素的培養基，其特征在于所述二級種子培養基的組成為:甘鹿糖蜜25~30g/L、油12~16ml/L、啤酒酵母干洛25~30g/L、蚯蚓粉11~17g/L、硫酸銨0.06~0.08g/L、氯化鈉0.9~lg/L、輕質碳酸鈣0.4~0.6g/L、硅油消泡劑0.02~0.04g/L。
4.按照權利要求1所述的紅霉素鏈霉菌發酵生產紅霉素的培養基，其特征在于所述發酵培養基的組成為:甘鹿糖蜜25~35g/L、油10~15ml/L、啤酒酵母干洛30~35g/L、蟲丘蚓粉15~20g/L、硫酸銨0.07~0.09g/L、氯化鈉0.9~lg/L、輕質碳酸鈣0.4~0.6g/L、S-腺苷甲硫氨酸I~5g/L、氯化鈷0.006~0.008g/L 硫酸鎂0.04~0.05g/L、硫酸鋅0.03 ~0.05g/L、硫酸銅 0.06 ~0.08g/L、硅油消泡劑 0.02 ~0.03g/L。
5.按照權利要求1、2、3或4所述的紅霉素鏈霉菌發酵生產紅霉素的培養基，其特征在于所述啤酒酵母干渣的質量要求為: 蛋白質含量≥45% ;磷含量≥60ug/ml ;水分≤ 5% ;灰分≤5% ;碳水化合物≥12% ;干渣顆粒通過60目篩的數量> 80%ο
6.按照權利要求1、2、3或4所述的紅霉素鏈霉菌發酵生產紅霉素的培養基，其特征在于所述蚯蚓粉的質量要求:蛋白質含量> 60% ;水分< 10% ;粒度能通過80目篩。
7.按照權利要求1、2、3或4所述的紅霉素鏈霉菌發酵生產紅霉素的培養基，其特征在于所述甘蔗糖蜜在使用前進行預處理，預處理過程為: O甘蔗糖蜜中加入飲用水，使其粘度控制在IOOcp以下； 2)加熱升溫至30~35°C， 3)超濾，超濾膜材料為醋酸纖維素或聚氧乙烯，超濾過程中，物料的流量控制在4~5L/min，超濾壓力控制在0.2MPa 4)加入蔗糖轉化酶，蔗糖轉化酶用量(g)=蔗糖甜蜜重量(kg)X0.35。
8.—種紅霉素鏈霉菌利用權利要求2-4任意一項培養基發酵生產紅霉素的培養方法，其特征在于其工藝步驟為:首先將已經培養好的紅霉素鏈霉菌母瓶發酵液按照0.8~IL/m3接種量接入一級種子培養基中進行一級種子培養，至菌體濃度35~40%、pH值7~8、培養周期為20~25h時轉移到二級種子培養基中進行二級種子培養，至菌體濃度35~40%、pH值7~8、培養周期為22~27h時轉移至發酵培養基中培養，至發酵單位在11000u/ml以上且每6~8h檢測的發酵單位相差300u/ml以內、菌體濃度35~40%、發酵周期為150~160h時終止發酵。
9.按照權利要求8所述的培養方法，其特征在于所述一級種子培養基、二級種子培養基和發酵培養基在使用前首先進行滅菌，其中 滅菌后的一級種子培養基的質量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷> 50ug/ml、總糖.30 ~40g/100ml、pH6.5 ~7.5 ; 滅菌后的二級種子培養基的質量要求:氨基氮60~70mg/100ml、溶磷> 50ug/ml、總糖.30 ~40g/100ml、pH:6.5 ~7.5 ; 滅菌后的發酵培養基的質量要求:氨基氮50~60mg/100ml、溶磷> 60ug/ml、總糖.40 ~50g/100ml、pH:6 ~7。
10.按照權利要求8所述的培養方法，其特征在于所述一級種子培養條件為: 1)罐壓:控制在0.04~0.06MPa, 2)罐溫:發酵前5h，罐溫控制在31~32°C；6h至一級種子培養結束，罐溫控制在33~.34℃， .3)空氣流量:0~5h，100~150m3/h；6h至一級種子培養結束:200~250m3/h， .4)pH:控制在7~8， 5)攪拌轉速:0~5h,采用氣流攪拌；6h至一級種子培養結束:采用機械攪拌，轉速控制在 110r/min。
11.按照權利要求8所述的培養方法，其特征在于所述二級種子培養條件為: . 1)罐壓:控制在0.04~0.06MPa, .2)罐溫:發酵前5h，罐溫控制在31~32°C；6h至二級種子培養結束，罐溫控制在33~34℃， .3)空氣流量:0~5h，300~350m3/h；6 h至二級種子培養結束:350~400m3/h， . 4)pH:控制在7~8，. 5)攪拌轉速:0~5h,采用氣流攪拌；6h至一級種子培養結束:采用機械攪拌，轉速控制在 100r/min。
12.按照權利要求8所述的培養方法，其特征在于所述發酵培養條件為: .1)pH控制:控制在6~8 ; . 2)無菌檢查:發酵過程中進行菌檢，要求無其它雜菌； .3)空氣流量:0~15h: 1000mVh ；16h~發酵結束:800m3/h ； .4)溶氧控制: . O~30h:溶氧濃度不得低于60% ； . 31~120h:溶氧濃度控制在30~50% ； . 12 Ih~放罐:溶氧濃度控制在40%以上； 攪拌轉速: O~30h:攪拌轉速80~90r/min ； 31 ~120h:攪拌轉速 100 ~110r/min ； 121h~放罐:攪拌轉速70~80r/min ； 6)培養溫度:
O ~30h:34 ~35.0°C ；
31 ~IOOh:32 ~33°C ； IOlh~放罐:30~31°C ； 7)罐壓:罐壓控制在0.04~0.06MPa。
13.按照權利要求8所述的培養方法，其特征在于在發酵過程中進行補料，包括補糖、補水、補入正丙醇和補油，其中 1)補糖控制:當pH> 7.3時，采用流加法，補入粘度在500~600cp的甘蔗糖蜜溶液，當pH達到6.9時，停止補料； 2)補水: 120h之前，當菌體濃度超過40%，采用流加法補入飲用水，控制其菌體濃度在35~40% ； ，120h至發酵結束:當菌體濃度超過35%，補入飲用水，控制其菌體濃度在30~35% ； 3)補入正丙醇:發酵周期在30h、50h、90h、110h、130h分別加入已滅菌的正丙醇，其加入量為發酵液體積的0.1~0.2%; 4)補油:采用流加法補油，發酵至15h開始補豆油，具體控制如下:
，15 ~80h:15 ~20L/h ；
，81 ~120h:30 ~35L/h ；
，121h~放罐:不補油。
【文檔編號】C12R1/465GK103484515SQ201310441432
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月25日 優先權日:2013年9月25日
【發明者】任勇, 奇乃, 王忠中 申請人:寧夏泰瑞制藥股份有限公司