專利名稱：Mapkkk家族ila1基因在控制水稻葉夾角中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻基因工程領(lǐng)域。具體涉及分離、克隆和通過功能驗證得到一種能夠控制水稻葉夾角基因ILA1。本發(fā)明采用篩選T-DNA插入水稻突變體庫的方法，克隆到控制水稻葉夾角基因ILA1，通過共分離分析、細胞學(xué)觀察、基因表達部位分析表明ILAl是控制水稻葉夾角表型的關(guān)鍵基因。
背景技術(shù)：
水稻是亞洲最重要的糧食作物同時也是一種模式植物。而在未來的40年，水稻的產(chǎn)量必須增長50%才能滿足人口增長的需要。在眾多影響產(chǎn)量的因素中，葉片的光合作用被認為對增加產(chǎn)量起到很重要的作用。對于水稻而言，葉片夾角、葉片溫度和葉片衰老是影 響葉片光合作用的三個主要因素。葉片夾角是指葉片偏離垂直面的角度。擁有小的葉夾角、直立的葉片是新水稻品種的一個重要指標，被命名為NPT (new plant type)。總之，合適的葉夾角能減少植株陰影、增加群體透光性、充分發(fā)揮中下層葉的光合潛力、在密植的情況下減少占地面積。近年來的研究表明葉夾角與植物激素和環(huán)境有密切的關(guān)系。油菜素內(nèi)酯(BR)是一種多羥基化的固醇類激素，廣泛參與植物生長發(fā)育等多種生理過程。水稻對BR的一個最顯著的反應(yīng)就是葉夾角變大(Wada 等· Brassinolide and Homobrassinolide Promotionof Lamina Inclination of Rice Seedlings. Plant Cell Physiol, 1981, 22 :323-325.)。BR會引起近軸面細胞的快速分裂和生長，從而導(dǎo)致水稻葉夾角的增大(Cao H, ChenS.Brassinosteroid-induced rice lamina joint inclination and its relation toindole-3-acetic acid and ethylene. Plant Growth Regul, 1995,16 :189-196.),也會促進胚芽鞘的生長和根變短(Yamamuro 等.Loss of function of a rice brassinosteroidinsensitivel homolog prevents internode elongation and bending of the laminajoint. Plant Cell，2000，12 :1591-1606.)。生長素是植物中第一個發(fā)現(xiàn)的激素，研究發(fā)現(xiàn)生長素與BR有相互促進的作用。生長素引起的葉夾角的變化與與BR類似。Song等報道過在水稻中超表達OsIAAl使葉夾角變大、植株株高變矮，呈現(xiàn)典型的BR相關(guān)的表型。TLDl編碼IAA氨基合成酶，TLDl功能獲得突變體的表型為分蘗增多、葉夾角變大和矮化。水稻的葉是由葉片和葉鞘組成，中間由葉枕連接，維管束在這三個組織中平行排布，厚壁細胞分布在維管束周圍，被認為是支撐葉的最主要的細胞。葉片或葉鞘中厚壁細胞的減少或者變薄會直接導(dǎo)致植株變脆或柔韌。葉夾角的改變也與光照強度和光性質(zhì)有關(guān)，光依賴的葉夾角變化是通過光敏色素和ABA合成介導(dǎo)的。葉夾角與緯度的關(guān)系也被研究過，例如，擬南芥不同生態(tài)型的葉片在低緯度上表現(xiàn)得更加直立。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的涉及一個MAPKKK家族基因ILAl基因在控制水稻葉夾角改良中的應(yīng)用。
從水稻T-DNA突變體庫中分離得到一個葉夾角變小的水稻T-DNA突變體，其插入基因是一個MAPKKK基因，基于這個突變體的表型，申請人將該基因命名為ILAl (increasedleaf anglel)。本發(fā)明分離和應(yīng)用一種包含ILAl基因的DNA片段。其中，所述的ILAl基因是下列核苷酸序列之一I)序列表SEQ NO 1中第50-1744位所示的DNA序列；或2)編碼與I)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列；或3) I)和2)所包含的亞片斷。下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明。


序列表SEQ ID NO 1顯示的是本發(fā)明分離克隆的包含有ILAl基因編碼區(qū)的核苷酸序列。圖I.根據(jù)插入位點設(shè)計引物驗證共分離示意圖。A表示在插入位點上游設(shè)計的引物，B表示在插入位點下游設(shè)計的引物，C表示根據(jù)T-DNA內(nèi)部序列設(shè)計的引物。在TI代植株中，純合突變體只有A和C配對可以擴增的出，因為有T-DNA插入A與B配對的產(chǎn)物太大無法得到擴增片段，野生型的植株由于沒有T-DNA的插入，只有A和B配對可以得到產(chǎn)物，雜合植株則A和C配對以及A和B配對時都可以擴增得到產(chǎn)物。圖2.根據(jù)插入位點設(shè)計引物驗證共分離的PCR結(jié)果。上一行引物A+B，下一行引物:〇+8，其中泳道3，4，8，10，14，16，18，20，21為1'-0嫩純合;1，9，19 為 T-DNA 雜合；2，5，6，7，11，12，13，15，17，為 T-DNA 陰性。圖3. ilal突變體表型。A圖為野生型水稻植株中花11 (ZHll)與突變體(ilal)在抽穗時的表型圖為野生型植株與突變體的葉片夾角的比較圖4.水稻中花Il(ZHll)與ilal葉枕的橫切面的比較。箭頭顯示厚壁細胞。圖5. ilal葉枕細胞壁組分測定。X-軸是測定組分，分別為鼠李糖(Rhamnose)，巖藻糖(Fucose),阿拉伯糖(Arabinose),木糖(Xylose),甘露糖(Mannose),半乳入糖(Galactose),葡萄糖(Glucose)、纖維(Cellulose).圖6. pDX2181-ILAlP 載體圖譜。圖7. ILAl基因的啟動子表達模式。圖中顯示葉枕部位⑶S特異表達。
具體實施例方式以下實施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在分離ILA1T-DNA突變體，鑒定表型的方法。根據(jù)以下的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用不同的用途和條件。實施例I :分離ILAl T-DNA突變體基于已報道的植物MAPK/MAPKK/MAPKKK蛋白質(zhì)序列建立隱馬爾可夫模型(HMMs Hidden Markov model profiles, 一種軟件，參見http://onlinelibrary. wiley. com/doi/10. 1002/0471219282. eotll4/full)然后用HMMER掃描水稻全基因組，得到水稻基因組里所有可能的MAPKKK基因。然后從水稻突變體庫(http://rmd.ncpgr.cn/)中挑取相應(yīng)的T-DNA突變體。本發(fā)明所涉及的序列來源于NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/),TIGR (http: //www. tigr. org)，KOME (http: //cdnaOl. dna. affrc. go. jp/cDNA/)，定位的基因的位置信息以“TIGR Rice Annotation Release 4” 為準。其中ILAl T-DNA突變體的側(cè)翼序列為AACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCCTGCACCTATTTTTGGCTCTACCACAGCCCTTAAGGCTCTTGTTCGTCAAGCAAGCAGCAAGAACCTCCTGGATGACAACCAAGACATAGATGCTATTCTCAGGTTTGCATATTTATAGTTACTAGGTCCTGAAATTTTCTCATTTACCTATGCACTTTTTTCTCTTTGCACTTTCGGATTTTTCTGTTTTAGACATTCATTTTTAATTCAAATATCACTAATTAGCTCATTTTGCTGTTACTTGATGTTGTGTTTATTCCTTTTTTTCAGTCAGAGTGTGGTTATTTCTTTAAAACACTAATCAGTGAGACTATGATATTTAGAACCATTTCTTCTGTTTCATCTCAGTCGTCAAATCTGGCATGCGGGTTTGTGAAATACAGTTTTTATTGATAGAAGGATTTTTACACATACAAATAAATCGTAAAGGGGTGCGTGTGTGCCCCACACACGCGGCGAAACCCTATAGGAAACCCCAATTCCCCCTATCTGGGGACTACACCACACCTTTTTTATGGGAGAAAACCCGCGCACACAGACAA
根據(jù)側(cè)翼序列與水稻基因組的匹配情況，可以確定插入位點，在插入位點的兩邊設(shè)計一對引物A和B，及T-DNA上設(shè)計一條引物C，如圖1，A表示在插入位點上游設(shè)計的引物，B表示在插入位點下游設(shè)計的引物，C表示根據(jù)T-DNA內(nèi)部序列設(shè)計的引物。在TI代植株中，T-DNA純合植株只有A和C配對可以擴增的出，因為有T-DNA插入A與B配對的產(chǎn)物太大無法得到擴增片段，野生型的植株由于沒有T-DNA的插入，只有A和B配對可以得到產(chǎn)物，雜合植株則A和C配對以及A和B配對時都可以擴增得到產(chǎn)物。根據(jù)插入位點設(shè)計的引物序列為 A (引物)5' ACACCAGCGTATGTCCTT 3' B (引物)5' ATGCTCCTCCCCAGCTTTTT3 ' C (引物)5 ' AATCCAGATCCCCCGAATTA3 '。PCR 反應(yīng)體系的總體積為 20 μ I，DNA 模板 Iul (約 50ng)、lXTaq 酶反應(yīng)緩沖液、25mM MgCL21. 2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM 引物
0.2ul、0. 3 單位 Taq 酶，加水至 20 μ I。反應(yīng)程序為94°C變性 5min，94°C 45s,55°C 45s、72°C lmin30cycles, 72°C延伸 5min。PCR結(jié)果，如圖 23，4，8，10，14，16，18，20，21 為 T-DNA 純合;1，9，19 為 T-DNA 雜合;2，5，6，7，11，12，13，15，17，為 T-DNA 陰性。結(jié)果表明這個 T-DNA插在第4個ΕΧ0Ν，位于ATG下游963bp處。實施例2 :鑒定突變體表型將已鑒定好基因型的純合和野生型家系(水稻品種中花11)催芽后直播到南方水稻土中(按照常規(guī)方法)。在正常生長情況下，轉(zhuǎn)ilal基因的水稻與野生型(即未轉(zhuǎn)基因)水稻在苗期沒有明顯差別，但是在分蘗期和抽穗期轉(zhuǎn)ilal基因的水稻植株葉片夾角明顯比野生型(即未轉(zhuǎn)基因)水稻植株要大，在分蘗期表現(xiàn)為葉片披散(見圖3A，3B)。實施例3 :轉(zhuǎn)ilal基因水稻的細胞學(xué)觀察I、葉枕的橫切面觀察取轉(zhuǎn)ilal基因的水稻突變體和野生型水稻葉夾角差異最大的葉枕進行觀察。經(jīng)過徒手切片結(jié)果表明，葉枕處的厚壁細胞在轉(zhuǎn)ilal基因水稻和野生型水稻中存在很大差異。轉(zhuǎn)ilal基因的水稻中包圍在維管束附近的厚壁細胞明顯比野生型少(見圖4)。而對同一時期的葉片和葉鞘切片觀察，兩者沒有明顯差異。2、葉枕細胞壁組分測定取轉(zhuǎn)ilal基因的水稻突變體和野生型水稻葉枕進行細胞壁糖成分分析。結(jié)果表明，突變體中細胞壁單糖木糖、阿拉伯糖和葡萄糖含量顯著下降，纖維素含量也顯著下降(見圖5)，下降程度均大于30%。具體測定方法如下將干燥的水稻葉片打磨成粉末，過100目篩，經(jīng)70%乙醇和氯仿/甲醇(體積比為I : lv/v)抽提后，干燥。經(jīng)α淀粉酶(購自西格瑪奧德里奇公司)酶解樣品中的淀粉后，用蒸餾水洗三次，干燥。稱取2mg樣品，加入2Μ三氟乙酸在121°C水解90min,經(jīng)硼氫化鈉還(10mg/ml)原后,加入卩比唳和乙酸酐,加熱到120°C,生成單糖乙酰化衍生物。樣品經(jīng)SP2380色譜柱恒流模式(lml/min)分離后通過質(zhì)譜檢測(安捷倫氣相色譜9700A/質(zhì)譜5975C)，以肌醇為內(nèi)標，計算各單糖的成分。為確定纖維素含量，稱取2mg樣品，加入Updegraff試劑(乙酸硝酸水,體積比為8:1:2, v/v/v)消解非纖維素多糖，水洗三次并干燥后，加入72%濃硫酸 并稀釋以降解纖維素。取10μ I降解產(chǎn)物，加入新配制的蒽酮試制(2mg/ml),于80°C溫浴30min,冷卻后,測定吸光值(625nm),并依據(jù)標準曲線計算纖維素含量。實施例4 : ILAl的啟動子表達模式。為了研究ILAl在水稻各個組織的的表達模式，將ILAl啟動子連接⑶S報告基因轉(zhuǎn)化水稻中花11。啟動子⑶S載體構(gòu)建方法如下首先通過查找NCBI數(shù)據(jù)庫http://www. ncbi.nlm. nih. gov/，找到其所對應(yīng)的基因組序列(BAC克隆號AP007231)，用引物ILAlPF(5’_CCAGTCGACCACTACGACGATCAATCACG-3’)和 ILAlPR(5，-CCAGGATCCACAGCAAAGGCGCAACTCTT-3’)，擴增片斷，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min ；94°C 30sec,50°C 30sec，72°C 2min,30個循環(huán)；72°C延伸5min。用BamHI和Sail雙酶切，回收次PCR片段；同時，用同樣的方法酶切遺傳轉(zhuǎn)化載體PDX2181 (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科技學(xué)院林擁軍教授惠贈)，用BamHI和SalI雙酶切，酶切完畢，用氯仿異戊醇(體積比為24 I)抽提，純化酶切產(chǎn)物。用包含ILAl基因組的酶切片段和酶切后的載體做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOii (大腸桿菌DHlOii菌株購自Invitrogen公司)。通過酶切篩選陽性克隆，獲得轉(zhuǎn)化表達載體PDX2181_ILA1P (見圖6)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法(如下述具體步驟)將以上遺傳轉(zhuǎn)化表達載體PDX2181-ILA1P導(dǎo)入到水稻品種中花11 (中國水稻研究所提供的一個公開使用的水稻品種，)中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗、移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(中花11)遺傳轉(zhuǎn)化方法(體系)在Hiei等人報道的方法(Hiei Efficient transformation of rice,Oryza sativa L , mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA, Plant J，6 271-282,1994)基礎(chǔ)上改良進行(如下述具體步驟)。具體遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下(I)愈傷組織誘導(dǎo)將成熟的水稻種子中花11去殼，然后依次用70%濃度的的乙醇處理I分鐘，0. 15%氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；用滅菌水洗種子4-5次；將該消過毒的種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(成分見后)；將接種后的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，培養(yǎng)溫度25 ± I °C。(2)愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1°C。(3)預(yù)培養(yǎng)挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗下培養(yǎng)2周，培養(yǎng)溫度25± 1°C。
(4)農(nóng)桿菌培養(yǎng)在帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上(成分見后)預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105 (來源于CAMBIA，商用菌株)兩天，培養(yǎng)溫度28°C ;將所述的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基(成分見后)里，于28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時。(5)農(nóng)桿菌侵染將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至0D_ O. 8-1. O ;將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基(成分見后)上培養(yǎng)3天，培養(yǎng)溫度19-20°C。(6)愈傷洗漆和選擇培養(yǎng)用滅菌水洗漆愈傷至看不見農(nóng)桿菌；浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；再轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基(成分見后)上選擇2-3次，每次2周(第一次篩選羧芐青霉素濃度為400ppm，第二次及以后為250ppm,潮霉素濃度250ppm)。(7)分化將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗處培養(yǎng)5-7周 ’轉(zhuǎn) 移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上(成分見后)，光照下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度26°C。(8)生根剪掉分化時產(chǎn)生的根；然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26°C。(9)移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，在最初的幾天保持水分濕潤。培養(yǎng)基組分及其配方(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表不如下6_BA (6-Benzy IaminoPur ine, 6-節(jié)基腺嘌呤)；CN (Carbenici 11 in,羧節(jié)青霉素)；KT(Kinetin,激動素)；NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid, Π引哚乙酸)；2,4_D(2,4_Dichlorophenoxyacetic acid,
2,4-二氯苯氧乙酸)；AS (Acetosringone,乙酸丁香酮)；CH (Casein EnzymaticHydrolysate,水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B,潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亞砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix (N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmix (MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液[10倍濃縮液(10X)]的配制
硝酸鉀(KNO3)28.3 g
磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.0 g
硫酸銨((NH4)2SO4)4.63 g
硫酸鎂(MgSO4 ·7Η20)1.85 g
氯化鈣(CaCl2.2H20)1.66g逐一溶解,然后室溫下用蒸懼水定容至1000ml。2) N6培養(yǎng)基微量元素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制碘化鉀(ΚΙ)0.08 g
硼酸(H3BO3)0.16 g
硫酸錳(MnSO4MH2O)0.44 g
硫酸鋅(ZnSO4IH2O)0.15 g室溫下溶解并定容至1000ml。3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)的配制準備800ml雙蒸水并加熱至70°C，加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA · 2H20) 3. 73克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小時，定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?4)維生素貯存液(100X)配制
煙酸(Nicotinicacid)0.1 g
維生素 BI (Thiamine HCl)0.1 g
維生素B6 (Pyridoxine HCl)0.1 g
甘氣酸(Glycine)0.2 g
肌醇(Inositol)IOg加水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)MS培養(yǎng)基大量元素母液(IOX)的配制
硝酸銨(NH4NO3)16.5 g
硝酸鉀19.0 g
磷酸二氫鉀1.7 g
硫酸鎂3.7 g
氯化鈣4.4 g室溫下溶解并定容至1000ml。6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(100X)的配制
碘化鉀0.083 g
硼酸0.62 g
硫酸錳0.86 g
鉬酸鈉(Na2MoO4CH2O)0.025 g
硫酸銅(CuSO4JH2O)0.0025 g室溫下溶解并定容至1000ml。7) 2，4-D貯存液，6-BA貯存液，萘乙酸(NAA)貯存液，吲哚乙酸(IAA)貯存液I均為 mg/ml ο8)葡萄糖貯存液0· 5g/ml。
9) AS 貯存液的配制秤取 AS O. 392g，DMSO 10ml。(3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方I)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)IOOml
N6mix 母液(100X)IOml Fe2+EDTA 貯存液(100X)IOml
維生素貯存液(100X)IOml
2,4-D 貯存液.2.5 ml
脯氨酸(Proline)0.3 g
CH0.6 g
庶糖(Sucrose)30 g
Phytagel3 g加蒸餾水至900ml，用IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX) ·IOOml
N6mix 母液(100X)IOml Fe2+EDTA 貯存液(100X) IOml
維生素貯存液(100X)IOml
2,4-D 貯存液2.0 ml
脯氨酸0.5 g CH 0.6 g
蔗糖30 g
Phytagel3 g加蒸餾水至900ml，用IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基 N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1.25 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
2.4-DIt存液0.75 ml CH0.15 g 蔗糖5g
瓊脂粉(Agarose)1.75 g加蒸餾水至250ml，用IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱溶解 培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 μ I AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)12.5 ml
N6mix 母液(100X)1.25ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
2.4-DC存液0.75 ml CH0.2 g 蔗糖5g
瓊脂粉1.75 g加蒸餾水至250ml，用IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 μ I AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。5)懸浮培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)5 ml
N6mix 母液(100X)0.5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)0.5 ml
維生素C存液(100X)Iml
2.4-D貯存液0.2 ml
CH0.08 g
蔗糖2g加蒸餾水至100ml，用IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至5. 4，分裝到兩個IOOml的三角瓶
中，封口滅菌。
使用前加入Iml葡萄糖貯存液和100 μI AS貯存液。6)選擇培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
2,4-D 貯存液0.625 ml
CH0.15 g
蔗糖7.5 g
瓊脂粉1.75 g加蒸懼水至250ml,用IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6. O,封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 μ I HN和400ppm CN,分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/ M )。7)預(yù)分化培養(yǎng)基
N6max 母液(IOX)25 ml
N6mix 母液(100X)2.5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5 ml
維生素貯存液(100X)2.5 ml
6-BA JC存液0.5 ml
KT貯存液0.5 ml
NAA貯存液50 μ
IAA 存液50 μ
CH0.15 g
蔗糖7.5 g
瓊脂粉1.75 g加蒸餾水至250ml，用IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 μ I HN和200ppm CN,分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/ M )。8)分化培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)100 ml
N6mix 母液(100X)IOml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)IOml
維生素It存液(100X)IOml
6-BA IC存液2 ml
KT貯存液2 ml
NAA Jt存液0.2 ml
IAA貯存液0.2 ml
CHIg
蔗糖30 g
Phytagel3 g加蒸懼水至900ml,用IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)節(jié)pH值到6· O。煮沸并定容至1000ml,分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養(yǎng)基
MSmax 母液(IOX)50 ml
MSmix 母液(100X)5 ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)5 ml
維生素K存液(100X)5 ml
蔗糖30 g
Phytagel3 g加蒸餾水至900ml，用IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。本發(fā)明通過遺傳轉(zhuǎn)化共產(chǎn)生了 15株水稻植株，其中得到12株為陽性植株，對轉(zhuǎn)基因陽性植株的不同組織進行⑶S染色，結(jié)果表明在葉枕處有很強的表達，而在其它組織或器官中檢測不到明顯⑶S表達或者很微弱(見圖7)，說明ILAl基因主要在水稻葉枕這個部位特異表達。由于葉片夾角主要是受葉枕控制，ILAl基因在葉枕特異表達這一結(jié)果進一步支持了 ILAl基因控制葉夾角這一結(jié)論。
權(quán)利要求
1.一種控制水稻葉夾角的基因ILAl在水稻遺傳改良中的應(yīng)用，其特征在于，該基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO 1中第50-1744位所示。
2.權(quán)利要求I所述的基因的應(yīng)用，其中包括在控制水稻葉夾角改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于水稻基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及分離、克隆和通過功能驗證得到一種能夠控制水稻葉夾角基因ILA1。本發(fā)明采用篩選T-DNA插入水稻突變體庫的方法，克隆到控制水稻葉夾角基因ILA1，通過共分離分析、細胞學(xué)觀察、基因表達部位分析表明ILA1是控制水稻葉夾角表型的關(guān)鍵基因。所述的ILA1基因具有如序列表SEQ NO1中第50-1744位所示的核苷酸序列。
文檔編號C12N15/29GK102952809SQ20111041591
公開日2013年3月6日 申請日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者熊立仲, 寧婧, 周奕華, 張保才 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)