本發明涉及一種黃葉調控基因，特別涉及一種水稻黃葉調控基因YL1(Yellow Leaf 1)及利用該基因調控植物葉綠體發育，提高光合作用效率的應用。

(二)

背景技術：

水稻是世界三大糧食作物之一，有超過一半的人口以稻米作為主食。在我國，水稻是第一大糧食作物，其種植面積約占糧食作物總種植面積的28％，產量約占糧食總產量的35％(National data,2012,http://www.stats.gov.cn/tjsj/)。因此，水稻的高產穩產對保障我國糧食安全具有極其重要的意義。葉片是植物進行光合作用的主要場所，對干物質積累有重要影響，水稻葉色發生變化大多情況下會影響水稻的產量。研究表明，導致葉色變化的主要原因是植物體內葉綠素合成、降解或葉綠體發育相關基因的發生突變，影響了葉綠素的生物合成和降解過程，導致葉片中葉綠素的含量發生變化，最終導致了葉色的變化。水稻葉色突變體表型明顯，易于觀察，已廣泛應用于生產實踐和科學研究中。除作為性狀標記應用于新品種培育外，葉色突變體對于研究植物葉綠體發育、光形態建成等方面具有重要的作用。

基于Gramene網站和國家水稻數據中心的研究結果整理，迄今為止已有大約40個水稻黃葉突變體基因被定位和克隆，大部分主要通過參與葉綠素的生物合成以及影響葉綠體的發育兩個途徑來調控葉色變異。OsCHL1和OsCHL9編碼葉綠素生物合成過程中鎂離子螯合酶亞基，該基因功能失活會導致水稻整個生育期內葉片呈現淺黃綠色；FLG(OsPORB)編碼原葉綠酸酯氧化還原酶B，該酶能保證植物在強光照射下正常合成葉綠素，突變后會導致水稻葉片退綠黃化；OsDVR基因編碼聯乙烯葉綠素酸酯還原酶，聯乙烯葉綠素酸酯a在該酶的催化作用下生成單乙烯葉綠素酸酯a，乙烯葉綠素酸酯a能在葉綠素酸酯a氧化酶OsCAO1/OsCAO2作用下經一系列反應生成葉綠素b，也能在葉綠素合成酶YGL的催化作用下生成葉綠素a，因此該過程中的任一基因功能受阻或失活都會直接影響葉綠素a和葉綠素b的合成，導致水稻葉片變黃。此外，利用水稻葉色突變體，部分葉綠體發育和分化相關的基因也相繼被克隆，包括V1(Kusumi et al.,1997)、V2(Sugimoto et al.,2004)、OsPPR1(Kodiveri et al.,2005)、V3、STRIPE1(Yoo et al.,2009)、YSA(Su et al.,2012)、VYL(Dong et al.,2013)、AM1(Sheng et al.,2014)、OsDG2(Jiang et al.,2014)、GRY79(Wan et al.,2015)、ASL2(Lin et al.,2015)等。其中V1編碼葉綠體蛋白NUS1，該蛋白控制葉綠體發育前體中與葉綠體分化相關基因的轉錄與翻譯，V1基因突變導致水稻苗期低溫黃化。V2編碼一個定位在質體和線粒體上新型的鳥苷酸激酶(pt/mtGK)，該基因的突變導致葉綠體分化受到抑制，尤其在葉片發育早期破壞葉綠體的蛋白翻譯機制。V3和STRIPE1分別編碼RNR(核糖核酸還原酶)大亞基RNRL1和小亞基RNRS1，參與調節DNA合成和修復過程中脫氧核糖核苷酸的形成速率，這兩個基因的突變會影響葉綠體的正常發育，當突變體表型對溫度敏感。盡管已有眾多基因被克隆，但植物葉綠體的生物合成和發育是一個及其復雜的過程，受到核基因和自身質體基因組的共同調控，因此發掘新的水稻葉色突變體，克隆其調控基因對揭示葉綠素生物合成和葉綠體發育的分子機理以及水稻高產育種實踐具有重要的意義。

本發明通過EMS誘變分離得到了一個黃葉突變體，該突變體整個生育期均呈現黃葉表型。運用圖位克隆技術，我們首先克隆了YL1(Yellow Leaf 1)基因，該基因編碼一個含165個氨基酸的蛋白，其中包含1個跨膜區域但未發現其它已知功能的結構域。我們已通過基因功能互補實驗鑒定了該基因的功能，并從生理、分子水平探究該基因可能的生物學功能。

(三)

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供一種調控水稻葉色變異的基因及其編碼的蛋白質，以及利用所述基因調控植物葉綠體發育和對水稻葉片顏色進行改造的方法。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種水稻葉色調控基因YL1，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明還包括與SEQ ID NO.1至少有70％同源性的基因序列，也包括在取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而產生的突變體、等位基因或衍生物，還含具有相同功能并能達到本發明目的的基因序列。

本發明還提供一種所述水稻葉色調控基因YL1編碼蛋白，所述編碼蛋白氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示。本發明還包括與SEQ ID NO.2所示序列至少具有60％的同源性，包括在SEQ ID NO.2序列中進行氨基酸的替換、插入或缺失氨基酸所獲得的功能類似物。

本發明還涉及一種所述水稻葉色調控基因YL1構建的重組載體。該載體可以表達由上述核酸序列編碼的多肽或同源類似物。

本發明還涉及一種所述重組載體轉化制備的轉化子，包括大腸桿菌、農桿菌和植物細胞。

此外，本發明還提供一種所述水稻葉色調控基因YL1在調控水稻葉色中的應用。所述調控是通過RNAi、基因敲除或基因失活的方法降低水稻葉色調控基因YL1編碼蛋白的表達或活性，從而使水稻葉色變淡或變黃。所述調控還可以是通過導入水稻葉色調控基因YL1互補序列抑制水稻葉色調控基因YL1編碼蛋白的表達或活性，從而使變淡或變黃的水稻葉色恢復正常。

本發明的具體步驟如下：

1.水稻黃葉突變體yl1-1的分離：本發明涉及的水稻黃葉突變體yl1-1是由秈稻品種蜀恢527(購自中國農科院作物品種資源庫)經EMS誘變產生，該突變體整合生育期均表現為黃葉表型，如圖1所示。通過yl1-1與野生型水稻的正交實驗，證明該突變體受隱性單基因控制。

2.圖位克隆控制水稻葉色調控基因YL1:①YL1基因的初定位。為分離YL1基因，本發明首先通過yl1-1與粳稻品種日本晴雜交構建了F2定位群體，通過圖位克隆的方法，利用SSR、STS等分子標記對YL1位點進行初定位，將目標基因初定位于水稻第2染色體頂端，介于RM7562和RM3703兩個分子標記之間(圖2)。②YL1的精細定位及候選基因預測。通過對RM7562和RM3703標記之間的BAC序列分析發展新的STS標記，并進一步將YL1目標區間縮小至約199Kb的區間內，位于BAC AP007224和AP005869上YP2344和YP2392兩個分子標記之間，通過對該區間內開放閱讀框的預測和測序分析，推測YL1候選基因。

3.YL1基因的鑒定和功能分析：通過轉基因功能互補實驗，結果表明本發明獲得了使yl1-1突變體獲得正常表型的轉基因水稻(圖2)，證明本發明正確克隆了YL1基因。氨基酸序列分析表明YL1存在一個跨膜區域，但不含有任何已知功能的結構域。

本發明有益效果主要體現在：本發明通過圖位克隆技術獲得新的水稻葉色性狀調控基因YL1，并通過轉基因功能互補實驗驗證了所述基因的功能。本發明實驗證明，YL1是水稻葉綠體正常發育所需的。YL1與葉綠體ATPase蛋白復合體亞基AtpB存在互作，YL1基因的突變導致葉綠體ATPase活性下降，引起光合相關蛋白表達量降低、葉綠體發育受損、葉綠素含量下降，產生黃葉表型。本發明對YL1基因的功能解析進一步闡明了水稻葉綠體發育的分子機制，同時，所述蛋白和編碼基因可以應用于作物遺傳改良，對創制高光效育種具有重要意義。

(四)附圖說明

圖1 野生型(WT)和突變體(yl1-1)的表型；A發芽后7天的幼苗；B發芽后40天的植株；C孕穗期的植株；D對C放大后的葉片。

圖2 YL1基因的圖位克隆。

圖3 YL1和相關蛋白的進化樹分析。

圖4 pCAMBIA1300-YL1載體圖譜。

圖5 轉基因功能互補驗證。A互補轉基因苗的分子鑒定(1.DNA marker；2.野生型；3.突變體；4.互補轉基因株系)；B野生型(左)、突變體(中)和互補轉基因苗(右)的表型；C野生型、突變體和互補轉基因苗的葉綠素含量變化。

圖6 葉綠體機構觀察分析；40d水稻苗上部第1真葉(Leaf 1)與第4真葉(Leaf 4)用于透射電鏡觀察葉綠體，A、E為野生型，B、F為yl1-1突變型，C、D和G、H分別為A、B和E、F中單個葉綠體放大圖。

圖7 YL1的亞細胞定位分析。

圖8 YL1在不同組織部位的定量分析；A為qRTPCR檢測YL1在不同組織中的表達；B為YL1在轉基因水稻不同組織中的GUS表達。

圖9 Western blot檢測突變體和野生型中光合相關蛋白復合體亞基的表達情況。

圖10 酵母雙雜交和BiFC方法分析YL1的互作蛋白；A酵母雙雜交分析YL1和類囊體膜復合物亞基編碼基因之間的相互作用；B水稻原生質體中利用BiFC檢測YL1基因與AtpB基因的相互作用。

圖11 野生型和突變體葉綠體ATPase活性差異。

(五)具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此：

實施例1：

1、水稻材料

水稻(Oryza sativa L.)yl1-1突變體植株是由秈稻蜀恢527品種(購自中國農科院作物品種資源庫)經過EMS誘變處理得到的。

yl1-1突變體植株從幼苗第一片完全展開葉(DAG6，真葉展開)開始就表現出明顯的淡黃色表型，并持續整個生育期。與野生型(秈稻蜀恢527)相比，yl1-1突變體植株還表現為分蘗時期延后及分蘗數減少。此外，野生型和突變體在株高上也存在差異，在幼苗期(DAG6)兩者差異不明顯，在成熟期yl1-1突變體植株株高均顯著低于野生型植株，如圖1所示。

2、分析和定位群體

F₂定位群體是通過純合的yl1-1突變體和粳稻品種“日本晴”(Oryza sativa subsp.japonicacv.Nipponbare)雜交產生F₁代，F₁代自交得到F₂群體。從F2群體中篩選出1386株表型明顯的黃葉yl1-1突變個體用于圖位克隆。

3、通過SSR，STS標記定位YL1基因

基因組DNA的提取：采用改良的CTAB法提取水稻葉片(即步驟2篩選的1386株表型明顯的黃葉yl1-1突變個體)基因組DNA。具體方法為：取約0.2g新鮮的水稻葉片于2.0ml離心管中，經液氮冷凍，利用組織研磨儀(QIAGEN)將葉片磨成粉末狀，加入CTAB提取液提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于200μL超純水中。

YL1基因的初定位：隨機選取20個F2定位群體中分離的隱性突變單株，將其DNA混合組成混池，選取近似均勻分布于水稻12條染色體上的SSR(簡單重復序列)標記和STS(序列標簽位點)標記，進行PCR擴增，經5％的瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測PCR產物的多態性，將YL1基因初步定位到水稻2號染色體頂端，位于RM7562和RM3703兩個分子標記之間(圖2)。PCR反應體系(20μL)：DNA模板2μL，2×Specific^TM Taq Master Mix 10μL，上、下游引物各1μL，超純水補足至20μL。PCR反應條件為94℃預變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，32循環；72℃延伸5min。

YL1基因的精細定位：利用已知的水稻基因組BAC序列，通過秈、粳稻之間的序列差異比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，在初定位區間內設計新的STS標記，利用STS標記對F2群體中分離的隱性突變單株進行標記連鎖分析，最終將YL1基因精細定位與2號染色體上的兩個新的STS標記YP2344(位于BAC序列AP007224上)和YP2392(位于BAC序列AP005896上)之間的約199kb的區域內(圖2)。圖位克隆過程所用的引物序列見表1。

表1.YL1圖位克隆所用的引物

4、基因預測和序列分析

通過Rice Genome Annotation Database分析預測，上述199kb區間內共有27個候選基因，我們設計基因的測序引物通過用PCR方法(反應體系和條件同上)從野生型和突變型植株擴增出候選基因并進行測序分析。結果顯示(圖2)，yl1-1突變體在基因LOC_Os02g05890的第4外顯子處發生1個單堿基突變，由C變成T，導致編碼氨基酸由脯氨酸(Pro)變成絲氨酸(Ser)。該基因全長2720bp，核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示，該基因編碼蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網站的BLAST序列分析，將YL1基因在水稻、擬南芥和其他物種中的同源基因序列整理歸類并制成進化樹(MAGE software version 5.05)。結果顯示，在整個植物界中YL1基因家族共有兩個大的分支，單子葉植物分支和雙子葉植物分支。在單子葉植物分支中，又有兩個分支，YL1位于其中一個分支上，它在水稻中的同源基因OsYL2和OsYL3位于另一個分支。在雙子葉植物中也有兩個分支，YL1在擬南芥的同源基因At1g56200和At1g30475分別位于不同的分支中(圖3)。YL1候選基因測序引物見表2。

表2.候選基因測序引物

實施例2

植物轉化：

根據目的基因(LOC_Os02g05890)設計引物pCYL1-F(5’-tctagaAGTCCCATGTAAATAGGGTC-3’)和pCYL1-R(5’-gtcgacGCTTCTCGGATAACGACTCT-3’)，片段全長5.38kb，包含該基因5’-端上游2099bp，目的基因全長以及3’-端下游1382bp。以粳稻品種日本晴基因組DNA為模板，以pCYL1-F和pCYL1-R為引物，利用NEB公司Q5高保真酶體系進行PCR擴增，反應體系為(20μL)：DNA模板2μL，2×Master Mix 10μL，上、下游引物各1μL，超純水補足至20μL。PCR反應條件為98℃預變性30s；98℃變性10s，65℃退火30s，72℃延伸2min30s，30循環；72℃延伸10min。PCR產物經電泳后，回收目標片段并接入T5-zero載體(購自北京全式金生物技術有限公司)，經測序驗證后，克隆到雙元載體pCAMBIA1300(中國科學院遺傳所)中，獲得了用于轉化的質粒pCAMBIA1300-YL1(圖4)。質粒通過電擊的方法轉入農桿菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105(中國科學院遺傳所)中，并轉化水稻(方法可參照Toki等,Plant J,2006,47(6):969-976)，具體如下：將實施例1獲得的yl1-1突變體種子脫殼，用30％的NaClO表面滅菌15min，無菌水沖洗后接種到誘導愈傷組織的培養基中，32℃持續光照培養5-7天，挑選生長旺盛，顏色淺黃，比較松散的胚性愈傷組織，用作轉化的受體。用含有雙元質粒pCAMBIA1300-YL1的EHA105菌株侵染水稻愈傷組織，在黑暗處25℃培養3天后，在含有50mg/L潮霉素和400mg/L羧芐的選擇培養基上篩選抗性愈傷組織，并接種于50mg/L潮霉素和250mg/L羧芐的分化培養基上，32℃持續光照培養2周，分化出的幼苗經移至生根培養基誘導生根，然后移栽到水田，結實后收種進行表型鑒定。結果顯示，與同時期的突變體植株比較，yl1-1::pCAMBIA1300-YL1互補轉基因植株葉色恢復正常，葉綠素含量也恢復到野生型水平(葉綠素檢測方法可參照Lichtenthaler,Methods in Enzymology,1987,148:350-382)，說明本發明獲得了使突變體黃葉表型恢復正常的轉基因水稻(圖5)。

實施例3

1、葉綠體超微結構觀察

為了研究YL1基因突變對水稻葉綠體發育的影響，我們通過透射電鏡觀察分析了40天苗齡的野生型和突變心葉和第四葉的葉綠體超微結構。結果圖6所示。野生型植株的心葉和第四葉均展現出較完整的葉綠體結構，基粒片層堆積有規則。然而，yl1-1突變體中葉綠體形態表現出不規則表型，類囊體膜堆積松散，而且基粒片層堆積明顯少于野生型。說明YL1功能缺失使葉綠體發育受損。

2、YL1蛋白的亞細胞定位

我們構建了YL1全長的亞細胞定位載體，探究YL1在水稻中的亞細胞定位情況。質粒構建方法同實施例2中所述：引物為pCYL1-F(5’-根據目的基因(LOC_Os02g05890)設計引物YL1-GFP-F(5’-gagctcATGCCTCCACTTGCCACAAT-3’)和YL1-GFP-R(5’-gtcgacTTGGGGAGCGAGCCCATTGT-3’)，片段包含所述基因CDS序列全長，以粳稻品種日本晴cDNA為模板，利用NEB公司Q5高保真酶體系進行PCR擴增，反應體系和條件同實施例2。PCR產物經電泳后，回收目標片段并接入T5-zero載體(購自北京全式金生物技術有限公司)，經測序驗證后，克隆到雙元載體CaMV 35S::GFP(中國科學院遺傳所)中，獲得了用于轉化的質粒pCaMV 35S::YL1-GFP。我們用PEG轉化法將亞細胞定位載體轉到新鮮制備的水稻原生質體(粳稻品種日本晴)中，在激光共聚焦顯微鏡下觀察水稻原生質體，可以明顯的觀察到融合蛋白GFP信號出現在葉綠體上，綠色熒光信號隨著葉綠體的移動而移動并且始終重疊在一起，如圖7所示。以上結果表明，YL1定位在水稻的葉綠體中。

3、YL1基因表達分析

利用TRIzol(購自Invitrogen公司)法，分別提取野生型秈稻品種蜀恢527的根、莖、葉、葉鞘、幼穗和孕穗的總RNA，采用TOYOBO反轉錄試劑盒(ReverTra qPCR RT Master Mix with gDNA Remover)反轉錄成cDNA，然后利用CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad)進行熒光定量PCR檢測，qPCR反應使用SYBR Green Supermix(Bio-Rad)試劑盒，所有試劑盒涉及的方法均根據相關說明書操作。結果如圖8中A所示，YL1基因在葉和葉鞘中表達量最高，其次是莖，在根，幼穗和孕穗中幾乎沒有表達。

為了進一步研究YL1基因的表達模式，我們構建了YL1promoter驅動的GUS基因質粒(YL1 promoter::GUS，質粒構建方法同實施例2中所述，引物為pGUS-F：5’-ggtaccAGTCCCATGTAAATAGGGTC-3’和pGUS-R：5’-ccatggGATATGCAGCAGCTGTGTAG-3’，以日本晴gDNA為模板，擴增YL1基因啟動子區2099bp片段，最終將PCR產物克隆到含GUS報告基因的pCAMBIA1301(購自中國科學院遺傳所)中，并將該質粒通過農桿菌介導方法轉入秈稻品種日本晴中，轉化方法同實施例2。在轉基因T2代檢測GUS染色，結果顯示(圖8中B)，在葉、葉鞘、莖中能檢測到很高的GUS基因表達，而在根和幼穗中幾乎檢測不到，與qRT-PCR結果一致。表明YL1在綠色組織中有較高的表達量。

4、類囊體膜光合相關蛋白復合體亞基表達檢測

為研究YL1功能缺失對葉綠體光合相關蛋白復合體的影響，我們通過Western Blot方法檢測野生型和突變體類囊體膜上光合相關蛋白復合體部分核心亞基(PsaA[PSI]、PsbA和PsbO[PSII]、AtpA和AtpB[Atpase]、Cyt f[Cyt b₆f]、LHcb[LHC]、RbcL)的表達量。類囊體膜蛋白提取方法可參照Zhang等(Plant Methods,1999,7:30)方法。取相同重量的野生型和突變體植物葉片提取類囊體膜蛋白用于Western Blot分析，具體步驟如下：類囊體膜蛋白加入相同體積的2×SDS上樣緩沖液(125mM Tris-HCl[pH6.8]、2％SDS、20％甘油、0.02％溴酚藍、5％β-巰基乙醇)并煮沸5min，經10％SDS-PAGE膠電泳分離，電泳后的分離膠通過濕轉至PVDF膜上(90V，1h)，然后用5％的脫脂奶粉(用TBST緩沖液配置，緩沖液配方：10mM Tris-HCl，pH7.5、150mM NaCl、0.05％Tween20)室溫封閉1h，封閉結束后用TBST緩沖液漂洗3次，每次5min，之后加入上述光合蛋白復合體亞基的抗體(一抗，1:2000，抗體溶于5％的脫脂奶粉TBST溶液)孵育(4℃過夜或室溫1h)，結束后用TBST緩沖液漂洗3次，每次5min，隨后加入二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔HRP抗體，1:5000)室溫孵育1h，同樣用TBST緩沖液漂洗3次，每次5min，最后經ECL(購自Invitrogen公司)后通過化學發光成像系統檢測蛋白印跡(Bio-Rad)。結果顯示，相比于野生型，yl1-1突變體中所有檢測的光合蛋白亞基的表達量均顯著下降，特別是PSI中心亞基PsaA較野生型下降了～70％，如圖9所示。表明YL1基因對葉綠體光合作用相關蛋白復合體亞基的積累具有重要作用。

5、YL1蛋白與類囊體膜光合相關蛋白亞基互作研究

為了深入分析YL1影響葉綠體發育的分子機理，我們通過酵母雙雜交方法篩選YL1的互作蛋白。質粒構建采用實施例2中所述方法，首先通過PCR擴增YL1基因和部分編碼光合蛋白亞基基因(PsaA、D1、AtpA、AtpB、Cyt f)的CDS全長(所用引物見表3)，測序驗證后YL1基因片段克隆至pGAKT7載體(prey)，PsaA、D1、AtpA、AtpB、Cyt f等基因則分別克隆至pGADT7載體。酵母雙雜交的實驗采用Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System(購自Clontech)，參照說明書方法操作。蛋白互作結果如圖10所示，YL1基因與AtpB基因共轉化的酵母細胞能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+X-gal的培養基上生長而且能都變藍，而與其他幾個基因共轉化均不能生長，說明YL1與AtpB在體外具有相互作用。此外，通過雙分子熒光互補(BiFC,bimolecular fluorescence complementationn；方法可參照Waadt等,Plant J,2008,56:505-516)實驗分析進一步驗證了在體內YL1與AtpB也發生相互作用。

表3酵母雜交載體構建引物

為進一步證實YL1與AtpB互作是否影響葉綠體ATPase生物合成，我們檢測了野生型和yl1-1突變體葉綠體ATPase活性。酶活檢測采用Sigma公司的ATPase活性檢測試劑盒(Sigma-Aldrich)，檢測方法按試劑盒說明書操作。結果如圖11所示，yl1-1突變體的葉綠體ATPase活性相比于野生型下降了58.3％，表明YL1對維持葉綠體ATPase的活性具有重要的作用。