專利名稱：一種錦鯉鰭條組織細胞系及構建方法
技術領域：
本發明屬于水產養殖病害防控技術領域，具體涉及一種錦鯉鰭條細胞系，同時還涉及一種錦鯉鰭條細胞系的構建方法，適用于淡水魚類細胞系建立與鯉皰疹病毒病原的分離培養及診斷。
背景技術：
錦鯉(Cryprinus carpiod)，以其絢麗的色彩、華麗的斑紋、雄健的身軀、溫順的習性而享譽世界，被人們稱為“水中瑰寶”、“會游泳的藝術品”，是世界上最受歡迎的大型觀賞魚之一。錦鯉除具觀賞價值外，還是營養豐富、肉質細嫩的食用魚。近年來，隨著環境污染的日益加劇和養殖業的過度膨脹，錦鯉的病害問題日趨嚴重，各種傳染性疾病尤其是病毒病的暴發，造成錦鯉死亡率逐年上升，極大地影響了錦鯉養殖業、觀賞業、國際貿易出口業，經濟損失嚴重。錦鯉皰疹病毒病由錦鯉皰疹病毒(Koi Herpesvirus, KHV)引起，主要感染錦鯉和鯉魚，是錦鯉和鯉魚養殖生產中發生的一種高致病性疾病，發病率和致死率均可高達80%-100%。1998年在以色列的Magan Michael地區暴發了錦鯉疾病，經鑒定其病原為KHV，導致漁場損失肉用鯉魚600噸，出口損失近400萬美元。隨后該病傳播與蔓延到美國、歐洲大陸、亞洲等；近年來我國已有該病毒病例的報道。 KHV非常特殊，只能在源自于原始宿主細胞中增殖，即在錦鯉細胞中增殖，很難在魚類病毒分離常用的細胞系中增殖。目前，國外常用錦鯉鰭條細胞系KF-I和普通鯉魚腦細胞系CCB 進行該病毒培養，但國內未見報道。

發明內容
本發明的目的是在于提供一種錦鯉鰭條組織細胞系的建立方法，即通過組織塊移植法建立一種錦鯉鰭條細胞系。組織塊的存在，為遷出細胞提供了良好的生長基質和環境， 對適應培養環境和促進細胞生長有重要作用，從組織塊中遷移出來的細胞貼壁穩定、生長迅速，可生長成穩定的單層細胞；該方法具有操作方便、快速、效率高等特點，是常用的細胞原代培養方法之一。目前錦鯉皰疹病毒不僅感染錦鯉，而且已經在我國較大的范圍內感染養殖鯉魚，造成重大經濟損失。在開展錦鯉皰疹病毒病原分離鑒定、疫病診斷與防控技術研究中，缺乏錦鯉皰疹病毒的敏感細胞系。本發明工藝科學合理，經這種方法建立的錦鯉鰭條細胞系，目前已傳至60多代，對錦鯉皰疹病毒敏感，可望今后應用于錦鯉皰疹病毒的分離鑒定、病毒體外擴增、疫病診斷、病毒疫苗制備以及錦鯉疹病毒病的基礎理論研究與免疫防治技術等方面的研究。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施一種錦鯉鰭條組織細胞系(Koi-Fin)的構建方法，其步驟是1.錦鯉鰭條組織塊的制備首先將錦鯉放置在濃度為15-25克/升的高錳酸鉀溶液中，消毒處理30-40min后再用70% (V/V)酒精擦拭魚體表面，在II級生物安全柜(新加坡，ESC0)里無菌取出背鰭、腹鰭組織。用含450-550單位/毫升青霉素(Sigma)、450_550微克/毫升鏈霉素(Sigma)、12. 0-13. 0微克/毫升兩性霉素B (Sigma)的磷酸緩沖液洗滌鰭條組織3 4次，用滅菌的眼科剪子將鰭條組織剪成約Imm3左右的碎塊，均勻移植到25 毫升細胞培養瓶Oaring)里，于23-25°C培養箱里倒置干貼1. 5-2. 5小時。2.錦鯉鰭條組織細胞專用增殖培養液的配置取6. 8-7. 2毫升pH值為7. 0-7. 4 的MEM培養基(Sigma)，加入Iml胎牛血清(Hyclone)，為了促進錦鯉鰭條組織細胞的分裂和快速增殖，在上述培養液中添加0.01%。-0.02%。(W/V)的堿性纖維生長因子、 0. 01%。-0. 02%。(W/V)表皮生長因子。3.錦鯉鰭條組織細胞的原代培養將每瓶干貼后鰭條組織中添加專用增殖培養液，于23-25°C培養箱里培養，待觀察到細胞從鰭組織周圍遷出后，每隔3-5天半量更換錦鯉鰭條組織專用增殖培養液，即用移液管從每個細胞培養瓶里吸出2. 5ml培養液，以去除未貼壁的組織塊以及死細胞，并添加2. 5ml新鮮的錦鯉鰭條組織細胞專用增殖培養液。4.錦鯉鰭條組織細胞的傳代培養待錦鯉鰭條組織細胞長成單層后，用移液管吸棄舊培養液，向每個細胞培養瓶里添加2毫升濃度為0.25-0. 4% (W/V)的胰蛋白酶消化液靜置消化2分鐘左右，待細胞解離后，用手輕拍細胞培養瓶，每瓶加入2ml錦鯉鰭條組織細胞專用培養液，輕輕吹打細胞；將細胞懸液吸至15毫升離心管(Coring)里，按照1000轉 /分鐘、離心5分鐘；吸棄離心管里上清液，添加5ml新鮮錦鯉鰭條組織細胞專用培養液，用移液管吹打細胞沉淀，制成細胞懸液，每個細胞培養瓶里添加2. 5毫升細胞懸液和2. 5毫升錦鯉鰭條組織細胞增殖培養液；待錦鯉鰭條組織細胞再次形成單層后，按照上述的錦鯉鰭條組織細胞的傳代培養方法進行下一次傳代培養。獲得了一種分離的錦鯉鰭條組織細胞系Koi-Fin。保藏單位中國典型培養物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2011年10月沈日，分類命名錦鯉鰭條組織細胞系Koi-Fin，保藏編號CCTCC NO C201199。錦鯉鰭條組織細胞系Koi-Fin，首次傳代細胞在4- 即可貼壁生長，大約5d能生長成匯合細胞單層，細胞呈典型的成纖維樣；連續傳代12次后，傳代細胞約2d即可匯合成細胞單層，5d可形成致密細胞單層。通過三個實驗分別比較了 Koi-Fin在四種不同培養基、四種不同培養溫度、四種不同血清濃度中的細胞數目、細胞單層穩定性、增值速度等，確定Koi-Fin細胞的最佳培養基為MEME，最適血清體積分數為10% (V/V)，最適培養溫度為 25°C。通過生長曲線，看到該細胞貼壁、生長、增殖前1. 5d為遲緩期，1. 5-3. 5d處于對數期， 3. 5-4. 5d為基本平臺期，4. 5d后進入衰退期，大概6d即可完成一個生長周期，公式計算群體倍增時間為43.證。Koi-Fin細胞經液氮冷凍后復蘇，通過染色，約80%的細胞具有細胞活性，并保持原有生長狀態，目前該細胞已經穩定傳代50多次。所用的錦鯉鰭條組織細胞專用增殖培養液的配方為pH值為7.0-7.4的 MEM培養基，30 % (V/V)胎牛血清，0. 01 0Z00 -0 . 0 2 0Z00 (W/V)的堿性成纖維生長因子、 0. Ol0Zoo -0. 02%。(W/V)表皮生長因子。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果經這種方法所獲得的傳代錦鯉鰭條組織細胞系可傳至60代以上，主要特點為細胞形態清晰，細胞單層穩定，可連續穩定傳代，能提供大量錦鯉鰭條組織細胞。細胞液氮凍存6個月以上復蘇培養生長旺盛。該細胞對錦鯉皰疹病毒敏感，病毒感染Koi-Fin細胞可產生典型細胞病變效應，病毒滴度可達108TCID50以上，為錦鯉皰疹病毒的增殖提供了一個理想的細胞材料，對于研究錦鯉皰疹病毒的分離鑒定、病原檢測、疫病診斷、疫苗制備與免疫預防技術研究有重要意義。
具體實施例方式實施例1 一種錦鯉鰭條組織細胞系的構建方法，其步驟是1.錦鯉鰭條組織塊的制備首先將錦鯉放置在濃度為20克/升的高錳酸鉀溶液中，消毒處理30min后再用70% (V/V)酒精擦拭魚體表面，在II級生物安全柜(新加坡， ESC0)里無菌取出背鰭、腹鰭組織。用含500單位/毫升青霉素、500微克/毫升鏈霉素、 12. 5微克/毫升兩性霉素B的磷酸緩沖液洗滌鰭條組織3次，用滅菌的眼科剪子將鰭條組織剪成約Imm3左右的碎塊，均勻移植到25毫升細胞培養瓶里，于23°C培養箱里倒置干貼 1. 5小時。2.錦鯉鰭條組織細胞專用增殖培養液的配置取6. 8-7. 2毫升pH值為7. 0-7. 4 的MEM培養基，加入Iml胎牛血清，為了促進錦鯉鰭條組織細胞的分裂和快速增殖，在上述培養液中添加了 0.01%。(W/V)的成纖維細胞生長因子、0.01%。(W/V)表皮細胞生長因子。3.錦鯉鰭條組織細胞的原代培養將每瓶干貼后的鰭條組織中添加專用增殖培養液，于23°C培養箱里培養，待觀察到細胞從鰭組織周圍遷出后，每隔3或4或5天半量更換錦鯉鰭條組織專用增殖培養液，即用移液管從每個細胞培養瓶里吸出2. 5ml培養液， 以去除未貼壁的組織塊以及死細胞，并添加2. 5ml新鮮的錦鯉鰭條組織細胞專用增殖培養液。4.錦鯉鰭條組織細胞的傳代培養待錦鯉鰭條組織細胞長成單層后，用移液管吸棄舊培養液，向每個細胞培養瓶里添加2毫升濃度為0.25% (W/V)的胰蛋白酶消化液靜置消化2分鐘左右，待細胞解離后，用手輕拍細胞培養瓶，每瓶加入2ml錦鯉鰭條組織細胞專用培養液，輕輕吹打細胞；將細胞懸液吸至15毫升離心管里，按照1000轉/分鐘離心5分鐘；吸棄離心管里上清液，添加5ml新鮮錦鯉鰭條組織細胞專用培養液，用移液管吹打細胞沉淀，制成細胞懸液，每個細胞培養瓶里添加2. 5毫升細胞懸液和2. 5毫升錦鯉鰭條組織細胞增殖培養液；待錦鯉鰭條組織細胞再次形成單層后，按照上述的錦鯉鰭條組織細胞的傳代培養方法進行下一次傳代培養。傳代細胞約2天或3天即可鋪滿細胞培養瓶底部70%左右即形成匯合細胞單層，5天或6天可形成致密細胞單層，即可進行下次傳代培養。通過錦鯉鰭條組織細胞的原代培養與傳代培養，獲得了可連續傳代培養的錦鯉鰭條組織細胞系。 獲得了一種分離的錦鯉鰭條組織細胞系Koi-Fin。保藏單位中國典型培養物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2011年10月沈日，分類命名錦鯉鰭條組織細胞系 Koi-Fin，保藏編號=CCTCC NO :C201199。實施例2:一種錦鯉鰭條組織細胞系的構建方法，其步驟是1.錦鯉鰭條組織塊的制備首先將錦鯉放置在濃度為20克/升的高錳酸鉀溶液中，消毒處理30min后再用70% (V/V)酒精擦拭魚體表面，在II級生物安全柜里無菌取出背鰭、腹鰭組織。用含500單位/毫升青霉素、500微克/毫升鏈霉素、12. 5微克/毫升兩性霉素B的磷酸緩沖液洗滌鰭條組織3次，用滅菌的眼科剪子將鰭條組織剪成約Imm3左右
5的碎塊，均勻移植到25毫升細胞培養瓶里，于培養箱里倒置干貼2小時。2.錦鯉鰭條組織細胞專用增殖培養液的配置取7毫升pH值為7. 0或7. 1或7. 2 或7. 3或7. 4的MEM培養基，加入Iml胎牛血清，為了促進錦鯉鰭條組織細胞的分裂和快速增殖，在上述培養液中添加了 0. 01%。(W/V)的堿性成纖維生長因子、0. 01%。(W/V)表皮生長因子。3.錦鯉鰭條組織細胞的原代培養將每瓶干貼后的鰭條組織中添加專用增殖培養液，于培養箱里培養，待觀察到細胞從鰭組織周圍遷出后，每隔3或4或5天半量更換錦鯉鰭條組織專用增殖培養液，即用移液管從每個細胞培養瓶里吸出2. 5ml培養液， 以去除未貼壁的組織塊以及死細胞，并添加2. 5ml新鮮的錦鯉鰭條組織細胞專用增殖培養液。4.錦鯉鰭條組織細胞的傳代培養待錦鯉鰭條組織細胞長成單層后，用移液管吸棄舊培養液，向每個細胞培養瓶里添加2毫升濃度為0.3% (W/V)的胰蛋白酶消化液靜置消化2分鐘左右，待細胞解離后，用手輕拍細胞培養瓶，每瓶加入2ml錦鯉鰭條組織細胞專用培養液，輕輕吹打細胞；將細胞懸液吸至15毫升離心管里，按照1000轉/分鐘離心5分鐘；吸棄離心管里上清液，添加5ml新鮮錦鯉鰭條組織細胞專用培養液，用移液管吹打細胞沉淀，制成細胞懸液，每個細胞培養瓶里添加2. 5毫升細胞懸液和2. 5毫升錦鯉鰭條組織細胞增殖培養液；待錦鯉鰭條組織細胞再次形成單層后，按照上述的錦鯉鰭條組織細胞的傳代培養方法進行下一次傳代培養。傳代細胞約2天或3天即可鋪滿細胞培養瓶底部70% 左右即形成匯合細胞單層，5天或6天可形成致密細胞單層，即可進行下次傳代培養。獲得了一種分離的錦鯉鰭條組織細胞系Koi-Fin。保藏單位中國典型培養物保藏中心，地址 中國.武漢.武漢大學，保藏日期2011年10月沈日，分類命名錦鯉鰭條組織細胞系 Koi-Fin，保藏編號=CCTCC NO :C201199。實施例3 一種錦鯉鰭條組織細胞系的構建方法，其步驟是1.錦鯉鰭條組織塊的制備首先將錦鯉放置在濃度為20克/升的高錳酸鉀溶液中，消毒處理40min后再用70% (V/V)酒精擦拭魚體表面，在II級生物安全柜里無菌取出背鰭、腹鰭組織。用含500單位/毫升青霉素、500微克/毫升鏈霉素、12. 5微克/毫升兩性霉素B的磷酸緩沖液洗滌鰭條組織3 4次，用滅菌的眼科剪子將鰭條組織剪成約Imm3 左右的碎塊，均勻移植到25毫升細胞培養瓶里，于25°C培養箱里倒置干貼2. 5小時。2.錦鯉鰭條組織細胞專用增殖培養液的配置取7毫升pH值為7. 0或7. 1或7. 2 或7. 3或7. 4的MEM培養基，加入Iml胎牛血清，為了促進錦鯉鰭條組織細胞的分裂和快速增殖，在上述培養液中添加了 0. 02%。(W/V)的堿性成纖維生長因子、0. 02%。(W/V)表皮生長因子。3.錦鯉鰭條組織細胞的原代培養將每瓶干貼后的鰭條組織中添加專用增殖培養液，于25°C培養箱里培養，待觀察到細胞從鰭組織周圍遷出后，每隔3或4或5天半量更換錦鯉鰭條組織專用增殖培養液，即用移液管從每個細胞培養瓶里吸出2. 5ml培養液， 以去除未貼壁的組織塊以及死細胞，并添加2. 5ml新鮮的錦鯉鰭條組織細胞專用增殖培養液。4.錦鯉鰭條組織細胞的傳代培養待錦鯉鰭條組織細胞長成單層后，用移液管吸棄舊培養液，向每個細胞培養瓶里添加2毫升濃度為0.4% (W/V)的胰蛋白酶消化液靜置消化2分鐘左右，待細胞解離后，用手輕拍細胞培養瓶，每瓶加入2ml錦鯉鰭條組織細胞專用培養液，輕輕吹打細胞；將細胞懸液吸至15毫升離心管里，按照1000轉/分鐘離心5分鐘；吸棄離心管里上清液，添加5ml新鮮錦鯉鰭條組織細胞專用培養液，用移液管吹打細胞沉淀，制成細胞懸液，每個細胞培養瓶里添加2. 5毫升細胞懸液和2. 5毫升錦鯉鰭條組織細胞增殖培養液；代錦鯉鰭條組織細胞再次形成單層后，按照上述的錦鯉鰭條組織細胞的傳代培養方法進行下一次傳代培養。傳代細胞約2天或3天即可鋪滿細胞培養瓶底部70% 左右即形成匯合細胞單層，5天或6天可形成致密細胞單層，即可進行下次傳代培養。獲得了一種分離的錦鯉鰭條組織細胞系Koi-Fin。保藏單位中國典型培養物保藏中心，地址 中國.武漢.武漢大學，保藏日期2011年10月沈日，分類命名錦鯉鰭條組織細胞系 Koi-Fin，保藏編號=CCTCC NO :C201199。
權利要求
1.一種分離的錦鯉鰭條組織細胞系，其特征在于錦鯉鰭條組織細胞系Koi-Fin， CCTCC NO: C201199。
2.權利要求1所述的一種錦鯉鰭條組織細胞系的構建方法，其步驟是A、錦鯉鰭條組織塊的制備將錦鯉放置在濃度為15-25克/升的高錳酸鉀溶液中，消毒處理30-40 min后再用70%V/V酒精擦拭魚體表面，在柜里無菌取出背鰭、腹鰭組織，用含 450-550單位/毫升青霉素、450-550微克/毫升鏈霉素、12. 0-13. 0微克/毫升兩性霉素B 的磷酸緩沖液洗滌鰭條組織3 4次，用滅菌的眼科剪子將鰭條組織剪成1 mm3的碎塊，均勻移植到25毫升細胞培養瓶里，于23-25°C培養箱里倒置干貼1. 5-2. 5小時；B、錦鯉鰭條組織細胞專用增殖培養液的配置取6.8-7. 2毫升pH值為7. 0-7. 4的MEM 培養基，加入Iml胎牛血清，在培養液中添加0. 01%。-0. 02%。W/V的成纖維細胞生長因子、 0. 01%。-0. 02%。W/V表皮細胞生長因子；C、錦鯉鰭條組織細胞的原代培養將每瓶干貼后鰭條組織中添加專用增殖培養液，于 23-25°C培養箱里培養，細胞從鰭組織周圍遷出后，每隔3-5天半量更換錦鯉鰭條組織專用增殖培養液，即用移液管從每個細胞培養瓶里吸出2. 5ml培養液，去除未貼壁的組織塊以及死細胞，并添加2. 5ml新鮮的錦鯉鰭條組織細胞專用增殖培養液；D、錦鯉鰭條組織細胞的傳代培養待錦鯉鰭條組織細胞長成單層后，用移液管吸棄舊培養液，向每個細胞培養瓶里添加2毫升濃度為0. 25-0. 4%ff/V的胰蛋白酶消化液靜置消化2分鐘，待細胞解離后，每瓶加入2ml錦鯉鰭條組織細胞專用培養液，吹打細胞；將細胞懸液吸至15毫升離心管里，1000轉/分鐘、離心5分鐘；吸棄離心管里上清液，添加5ml錦鯉鰭條組織細胞專用培養液，用移液管吹打細胞沉淀，制成細胞懸液，每個細胞培養瓶里添加 2. 5毫升細胞懸液和2. 5毫升錦鯉鰭條組織細胞增殖培養液；待錦鯉鰭條組織細胞再次形成單層后，按照上述的錦鯉鰭條組織細胞的傳代培養方法進行下一次傳代培養。
全文摘要
本發明公開了一種錦鯉鰭條組織細胞系及構建方法，步驟A、錦鯉鰭條組織塊的制備將錦鯉放置在高錳酸鉀溶液中，消毒處理，取鰭條組織轉移至培養皿內，抗生素清洗，將鰭條組織塊移植到細胞培養培養瓶里；B、錦鯉鰭條組織細胞專用增殖培養液的配置加入胎牛血清，在培養液中添加堿性成纖維生長因子、表皮生長因子；C、錦鯉鰭條組織細胞的原代培養將每瓶干貼后鰭條組織中添加專用增殖培養液，于培養箱里培養，添加錦鯉鰭條組織細胞專用增殖培養液；D、錦鯉鰭條組織細胞的傳代培養待錦鯉鰭條組織細胞長成單層后，制成細胞懸液，傳代培養。方法易行，操作簡便，工藝科學合理，建立的錦鯉鰭條細胞系，目前已傳至60多代。
文檔編號C12R1/91GK102399743SQ201110424748
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月16日 優先權日2011年12月16日
發明者周勇, 張輝, 徐進, 曾令兵, 肖藝, 范玉頂 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所