專利名稱：豬肺炎支原體dj-166株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于獸醫微生物技術領域，特別涉及豬肺炎支原體DJ-166株及其應用。
背景技術：
豬支原體肺炎又稱豬喘氣病，是由豬肺炎支原體引起的一種豬的接觸性慢性呼吸道疾病，呈世界普遍流行。據資料報道，世界各地分離的豬肺炎支原體均屬于同一血清型，但分離株之間抗原性有很大差異。1992年Frey首次證實了豬肺炎支原體分離株之間抗原性的差異；1996年,Artiushin和Minion進一步證實了 Frey的觀點；1999年,Kokotovic也同樣證實了這一結論。因此，分離出一株抗原性較好的豬肺炎支原體菌株進行疫苗和診斷試劑盒應用，對防治豬支原體肺炎至關重要，特別是分離出一株適合制備滅活疫苗的菌株，將填補國內無自主研發豬喘氣病滅活疫苗的空白。

發明內容
本發明的目的在于提供一株新的抗原性好的豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)。本發明的另一目的在于提供該株豬肺炎支原體在制備用于豬肺炎支原體感染引發疾病的預防用獸用生物制品或獸藥中的應用。本發明還提供了該株豬肺炎支原體在制備疫苗或免疫診斷用試劑盒中的應用。本發明的目的是通過如下技術方案實現的:本發明提 供一株豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)DJ-166株,其微生物保藏號為 CGMCC N0.4545。本發明的豬肺炎支原體DJ-166株可用于制備豬肺炎支原體感染引發疾病的預防用獸用生物制品或獸藥。進一步，本發明的豬肺炎支原體DJ-166株可用于制備疫苗。所述的疫苗包括:滅活疫苗、基因工程疫苗。本發明的豬肺炎支原體DJ-166株也可用于制備免疫診斷用試劑盒。所述的免疫診斷用試劑盒包括抗體檢測試劑盒、抗原檢測試劑盒。有益效果本發明的豬肺炎支原體DJ-166株CGMCC N0.4545為申請人自行分離得到，在制備的無細胞培養基中培養，活菌滴度可達IOltl 10nCCU/ml，降低生產成本；其免疫原性好，平均肺炎病變減少率可達80%以上。本發明的豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae) DJ-166株為申請人從山西養豬場35日齡二元雜交病豬肺臟組織分離得到，以江蘇省地方標準(DB32/T 1461-2009)豬肺炎支原體檢測PCR法，設計引物擴增出特異性豬肺炎支原體P36基因片段，經過基因測序后，初步確定為豬肺炎支原體。然后又經多重PCR(豬鼻支原體、豬絮狀支原體和豬肺炎支原體)、培養特性、生化特性和血清學特性鑒定，證明為豬肺炎支原體，純凈。菌株在人工合成培養基傳8代穩定后，經過3次克隆純化后制備得到該株豬肺炎支原體。本發明的豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)DJ-166株申請人已于2011年01月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，簡稱CGMCC，郵編:100101，保藏編號為=CGMCC N0.4545。


圖1豬肺炎支原體DJ-166株PCR鑒定其中，M =DNA標準DL 2000 ； 1:DJ_166株擴增產物；2:陽性對照；3:陰性對照圖2豬肺炎支原體DJ-166株多重PCR鑒定其中，M =DNA標準DL 2000 ；1:陰性對照；2:豬肺炎支原體陽性對照；3:組織樣品(DJ-166株)；4:豬鼻支原體陽性對照；5:豬絮狀支原體陽性對照；6:豬鼻支原體、豬絮狀支原體和豬肺炎支原體陽性對照·圖3豬肺炎支原體DJ-166株菌落間接表面熒光試驗結果
具體實施例方式通過下列實施例將更具體說明本發明，但是應理解所述實施例僅是為了說明本發明，而不是以任何方式限制本發明的范圍。實施例1本發明豬肺炎支原體DJ-166株分離鑒定I培養基及其配制液體培養基:A液:腦心浸出液2.0g、PPLO肉湯5.0g、去離子水300ml以上各成分混合，攪拌，使之完全溶解，116°C高壓滅菌20分鐘，冷卻后備用；B液:10XHank’ s液5.0ml、乳清蛋白水解物1.0g、酵母浸出液5.0g、丙酮酸鈉
0.8g、fe蛋白胨3.0g、硫代硫酸鈉0.lg、0.1%酹紅10ml、青霉素400U/ml、去離子水545ml。以上各成分混合，攪拌，使之完全溶解，用0.22 μ m濾膜過濾除菌，4°C保存備用；C液:健康馬血清140ml將A液、B液和C液充分混合均勻，lmol/L氫氧化鈉溶液調整pH至7.6，制得豬肺炎支原體液體培養基。固體培養基:在1000ml液體培養基的基礎上添加:瓊脂8.0g。2病肺組織采集用每毫升含2000個單位青霉素的生理鹽水洗去血液和組織碎片后，無菌操作剪取有豬喘氣病特征病變和健肺交界處肺組織塊。3病料PCR鑒定按照江蘇省地方標準(DB32/T 1461-2009)豬肺炎支原體檢測PCR法進行。3.1引物設計與合成Pl (序列 I):5，-TTACAGCGGGAAGACC-3’P2(序列 2):5，-CGGCGAGAAACTGGATA-3’預計擴增片段長度約為427bp。3.2病料DNA提取
取約1.0g病料，剪碎后勻漿器加5.0ml液體培養基研磨成糊狀，先低速4000r/min離心2min,上清再以12000r/min離心20min,棄上清,沉淀用250 μ ITE緩沖液重懸。煮沸IOmin, 12000r/min離心3min,取上清-20°C保存備用。3.3PCR 反應PCR 擴增體系為:10 X buffer 5.0 μ I，MgCl2 (25mM) 2.0 μ I，dNTP (2.5mM) 3.0 μ I，引物 Ρ1(50ρπιο1/μ 1)0.5 μ 1，引物 Ρ2(50ρπιο1/μ 1)0.5 μ I，模板 DNA 2.0 μ 1，Taq 酶(5U/μ 1)0.2μ 1，加雙蒸水至50μ I。反應條件為:95°C預變性8min，80°C Imin進行熱啟動后加酶，98°C變性ls，49°C退火lmin，72°C延伸2min，34個循環，72°C終延伸lOmin。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。病料組織擴增片段長度約為427bp，見圖1。4菌株馴化及克隆純化4.1病料處理及菌株馴化將豬肺炎支原體PCR檢測陽性病料用每毫升含2000個單位青霉素生理鹽水洗去血液和組織碎片后，將豬肺炎病灶及其鄰近健康組織剪成芝麻粒大顆粒，接入含50%豬鼻支原體特異性血清、0.001%醋酸鉈和每毫升含800單位青霉素的液體培養基中，共接種2管，每管放入10粒，置37°C培養。每間隔6日盲傳I次，每日觀察培養基pH變化，前3代均加入50%豬鼻支原體特異性血清。在傳至第5代時，培養基顏色發生改變，傳至8代后，即可出現PH規律性下降。4.2克隆純化將傳至第8代收獲的培養物進行10倍系列稀釋至10_1(1，將10' 10_4、10_53個稀釋度分別取出0.1ml接種于固體培養基平板上，置37±1°C 5% CO2培養箱培養10日，可見針尖大小菌落，在顯微鏡下挑取邊緣整齊、外周質地疏松、中央致密單個菌落，接種液體培養基，37±1°C培養7日。按以上方法對菌落連續克隆3次后的培養液作為第I代菌種，命名為 DJ-166 株。5PCR鑒定及測序5.1PCR 鑒定將克隆后收獲菌液提取的DNA按照上述3.3項進行PCR反應，結果均擴增出約427bp的目的片段。5.2多重PCR鑒定
5.2.1多重PCR引物序列mhp-f (序列 3):5’ -TTCAAAGGAGCCTTCAAGCTTC-3，；mhr-f (序列 4):5，-GGGAAGAAAAAAATTAGGTAGGG-3，；mfl-f (序列 5):5，-CGGGATGTAGCAATACATTCAG-3，；m-r (序列 6):5，-AGAGGCATGATGATTTGACGTC-3，；預計豬肺炎支原體擴增片段長度約為IOOObp ;豬鼻支原體擴增片段長度約為1129bp，豬絮狀支原體擴增片段長度約為754bp。5.2.2 多重 PCR 反應PCR 擴增體系為:10Xbuffer 5.0 μ I, MgCl2 75nM, dNTP ΙΟηΜ，上游引物均為8pmol,下游引物為 12pmol,模板 DNA 2.0 μ I, Taq 酶(5U/ μ I) 0.2 μ 1，加雙蒸水至 50 μ I。反應條件為:95°C預變性8min，94°C變性30s，54.6°C退火30s，68°C延伸lmin，30個循環，72°C終延伸lOmin。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。結果見圖2。篩選出無豬鼻支原體、豬絮狀支原體污染的豬肺炎支原體菌株。5.3PCR產物的回收與測序用凝膠回收試劑盒回收無豬鼻支原體、豬絮狀支原體污染的豬肺炎支原體菌株PCR擴增為427bp的目的片段，將其克隆入pEASY-Tl載體中，構建重組質粒，經PCR鑒定后由美國Invitrogen生命技術公司，用M13F引物測序,進行序列分析。測序結果(序列7)如下:CGGCGAGAAACTGGATATTCAAGTTCTTATTCGTAATTTGAGCTATCAATTCCGGTTAGTTTAGAATAAGCACAGAAACATTCACCGGCAATTTTAATATTTGAATAAGCAACAAAAGATGAATCACCATGTTCACCCATCACGTAGGCCTGAACCGAATTAGGCGATACTTTTGCTCTTTTTGCGATTGCAAATTGAAGCCTTGCTGTATCTAAAACAGTTCCACTACCGATAACTTTTTGATCGGAAAATCCAGATGCATCCCGGTAAGCCCTTGTAATTATATCAACAGGATTAGCAACAATAATACTTATTCCACTAAAGCCACTTTCTTTGACTTTTAGTGCAATTTCCCGGATAATTCGGATGTTATCAGCTACTAATTCAAGCCGAGTTTCACCCGGTTTTTGTGGTCTTCCCGCTGTAA應用DNAStar軟件將測序片段與豬肺炎支原體已公開序列的J株、168株、7448株和232株進行序列片段比對 ，豬肺炎支原體DJ-166株在堿基29位為A，J株為T ;在堿基47位，DJ-166株為C，168株為T ;在堿基48位，DJ-166株為A，7448株為G ;在堿基79位、258位和402位，DJ-166株分別為C、T、C，232株為T、A、T。經NCBI Blast分析結果顯示，DJ-166株與J株、168株、7448株、232株同源性為99 %，進一步證明分離株為豬肺炎支原體。實施例2本發明豬肺炎支原體DJ-166株生物學特性I培養特性將豬肺炎支原體DJ-166株接種于液體培養基中，37土 1°C 5% CO2條件下，培養5-9日，菌液呈輕度混濁，pH由7.6下降至6.5-7.0 ;在固體培養基上，生長緩慢，5% 二氧化碳、37土 1°C條件下培養7-10日，可見針尖大小菌落，顯微鏡下觀察可見邊緣整齊、外周質地疏松、中央致密菌落；將豬肺炎支原體DJ-166株菌液接種含青霉素和醋酸鉈的培養基中，菌液生長無抑制。2形態和生化特性菌液涂片姬姆薩染色后，油鏡觀察呈多形性，可見到環狀、絲狀、點狀、桿狀或兩極狀等無細胞壁菌體；具有代謝葡萄糖產酸的生化特性。3血清學特性3.1生長抑制試驗在含有豬肺炎支原體抗血清的固體培養基表面，37°C 5% CO2恒溫培養箱培養10，無菌落生長，呈現特異的豬肺炎支原體生長抑制。3.2代謝抑制試驗在含有豬肺炎支原體抗血清的液體培養基中，37°C恒溫培養箱培養15日，pH值不下降，呈現特異的葡萄糖代謝抑制。4間接菌落表面免疫熒光試驗菌落與支原體特異性抗體反應，與標記抗體結合后，熒光顯微鏡下觀察呈現明亮的黃綠色熒光，見圖3。5溶血試驗挑取菌落接種于含雞紅細胞的固體培養基上培養2-3，菌落周圍無溶血現象。6精氨酸利用試驗挑取菌落接種于含精氨酸及酚紅指示劑的液體培養基中，指示劑不變色，試驗為陰性。7薄膜和斑點形成試驗挑取菌落接種于含馬血清的固體培養基上，菌落表面和周圍不形成薄膜和斑點。8紅細胞吸附試驗

將0.25%雞紅細胞液滴加于菌落上，靜止后棄去紅細胞液，用生理鹽水沖洗2-3次，低倍鏡下菌落表面和周圍吸附有大量紅細胞。實施例3豬肺炎支原體DJ-166株活菌滴度測定豬肺炎支原體DJ-166株在制備的無細胞培養基中(配制原料及方法見實施例1)，活菌滴度測定結果為101(ι-10η(Χυ/πι1，見表I。表I豬肺炎支原體DJ-166株3次活菌濃度測定結果
權利要求
1.一株豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae) DJ-166 株，保藏號為 CGMCCN0.4545。
2.權I所述的豬肺炎支原體DJ-166株在制備用于豬肺炎支原體感染引發疾病的預防用獸用生物制品或獸藥中的應用。
3.權I所述的豬肺炎支原體DJ-166株在制備疫苗中的應用。
4.權I所述的豬肺炎支原體DJ-166株在制備滅活疫苗或基因工程疫苗中的應用。
5.權I所述的豬肺炎支原體DJ-166株在制備免疫診斷用試劑盒中的應用。
6.權I所述的豬肺炎支原體DJ-166株在制備豬肺炎支原體抗體檢測試劑盒中的應用。
7.權I所述的豬肺炎支 原體DJ-166株在制備豬肺炎支原體抗原檢測試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明屬于獸醫微生物技術領域，特別涉及豬肺炎支原體DJ-166株及其應用。該株豬肺炎支原體可用于制備成預防用獸用生物制品或獸藥。實驗證實本發明的豬肺炎支原體DJ-166株在制備的無細胞培養培養基中，活菌滴度高，均達到1010-11CCU/ml，可大大降低生產成本；其免疫原性好，平均肺炎病變減少率可達80％以上。
文檔編號C12R1/35GK103184171SQ201110450029
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者車艷杰, 王海燕, 王勇鶼, 張鋒, 高玉梅, 趙亞榮 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 福州大北農生物技術有限公司