專利名稱：木聚糖酶AnxB及其編碼基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及木聚糖酶AnxB及其編碼基因。
背景技術：
木聚糖(Xylan)是一類分子結構變化范圍很大的多糖，從僅由β _1，4糖苷鍵連接的多聚木糖線性分子到高度分支的異聚多糖。木聚糖是植物半纖維素的重要組分，約占植物總糖的三分之一，是自然界中除纖維素以外含量最豐富的再生生物資源。木聚糖酶(E.C
3.2.1.8)是一類以內切方式降解木聚糖分子中β_1，4-木糖苷鍵的酶系。近年來，木聚糖酶在食品、紡織、飼料、能源工業中都顯示了廣闊的應用前景。特別是在制漿造紙工業中該酶用于紙漿漂白，能夠增加紙張白度，改善紙張性能，降低漂白用化學物質的用量，從而有效減輕造紙業對環境的污染。根據木聚糖酶催化區域的氨基酸組成和疏水簇序列分析，可將其歸為F/10和G/11兩大家族。相比于F/10家族木聚糖酶，G/11家族木聚糖酶具有分子量較小，易于穿透纖維素網狀結構以及不含纖維素酶活性的特點，從而更適合應用于紙漿漂白工藝中。熱穩定性是木聚糖酶工業生產、儲藏、運輸以及應用過程中追求的又一重要特性。因此，獲得熱穩定性的木聚糖酶對于木聚糖酶的應用具有重要的實踐價值。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種熱穩定性高的木聚糖酶(蛋白質)及其編碼基因與應用。本發明所提供的蛋白質，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。
`
本發明所提供的蛋白質的編碼基因，為任何編碼上述蛋白的DNA，具體為核苷酸序列如序列表中序列3所示的DNA。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系、重組病毒或表達盒也屬于本發明的保護范圍。上述任一所述蛋白質在作為木聚糖酶中的應用也屬于本發明的保護范圍。實驗證明，本發明的木聚糖酶，在保持原有木聚糖酶特性的基礎上，其半衰期顯著延長，Tm值顯著增高，最適溫度也顯著提高。因此，本發明的木聚糖酶在木聚糖應用領域將有廣闊的應用前景。


圖1為AnxB與其突變體ΑηχΒ_Μ2熱穩定性比較。(A)AnxB與ΑηχΒ_Μ2在65°C熱穩定性比較；(B)AnxB與AnxB-M2Tm值比較。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。黑曲霉Aspergillus niger UV-1l CGMCC N0.4.4309購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。pET-28a(+)購自 Novagen，產品目錄號為 69865-3 ；實施例1、木聚糖酶AnxB及其熱穩定性的提高將黑曲霉Aspergillus niger UV-1l CGMCC N0.4.4309 產生的木聚糖酶 AnxB 中五個氨基酸相應地突變為Yll，H12，D13，Y15和F16，產生突變體AnxB_M2，并將其熱穩定性與其相應的野生型木聚糖酶進行比較。一、木聚糖酶AnxB的制備及穩定性檢測實驗組:1、PCR擴增木聚糖酶SlxB的編碼基因以黑曲霉Aspergillus niger UV-1l CGMCC N0.4.4309 的基因組 DNA 為模板，用弓丨物AnxB-Pl、AnxB- P2 (表I)進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。2、酶切、連接用Nde I和EcoRI雙酶切PCR擴增產物，與預先使用Nde I和EcoRI雙酶切的pET-28a(+)進行連接，得到重組載體；3、轉化、篩選以及測序驗證用氯化鈣化學轉化法將重組質粒轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)，用含有卡拉霉素(50 μ g/ml)的LB培養基進行篩選培養，挑取單菌落，并進行擴大培養和提取質粒，進行測序驗證.結果獲得的序列(即AnxB編碼基因)如序列表中序列I所示；該序列編碼序列2所示蛋白(即AnxB蛋白)。證明構建的質粒及重組菌正確。將陽性克隆記作BL21-pET-AnxB,陽性質粒記作pET-AnxB。4、酶的表達:挑取BL21-pET-AnxB單菌落接入含有卡拉霉素(50 μ g/ml)的LB培養基中，于37°C過夜培養。將過夜培養物接種于IL含有卡拉霉素(50 μ g/ml)的LB培養基，37°C劇烈振蕩(200rpm)培養，至發酵液的0D_值達到0.6-0.8左右，再向發酵體系中加入IPTG(終濃度0.5mM)，30°C條件下再培養6_8小時。發酵完畢后，5000rpm離心15分鐘，收集菌體；用pH6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液重懸菌體，超聲波破碎后12，OOOrpm離心15min。收集上清液，即為含有目的蛋白的粗酶液。5、酶的純化:采用鎳柱親和層析進行純化，在Amersham公司的AKTA FPLC系統中用Iml裝量的HiTrap chelating HP column(鎳柱)純化上清。非變性鎳柱結合緩沖液I用于平衡純化柱體和上樣。蛋白上樣量為10ml，流速設為lml/min。用20%非變性鎳柱洗脫緩沖液(即非變性鎳柱結合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的混合溶液，非變性鎳柱結合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的體積比為80: 20)進行洗滌，去除非特異性結合的雜蛋白。用80%非變性鎳柱洗脫緩沖液(即非變性鎳柱結合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的混合溶液，非變性鎳柱結合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的體積比為20: 80)進行洗脫，收集含洗脫峰的洗脫液，SDS-PAGE檢測洗脫液中樣品純度。
非變性鎳柱結合緩沖液1:0.02M磷酸鹽緩沖液，0.5M氯化鈉，pH7.4 ；非變性鎳柱洗脫緩沖液I1:0.02M磷酸鹽緩沖液，0.5M氯化鈉，0.5M咪唑，pH7.4。6、目的酶液的酶活檢測:木聚糖酶酶活的測定:木聚糖酶酶活的測定采用DNS法。取40 μ I適當稀釋的酶液，加入 360 μ I 1%木聚糖(Sigma birchwood xylan)溶液，50°C溫育 10η η』Λ 600μ IDNS溶液后，99°C溫育15min，冷卻到室溫后540nm處測定吸光值。酶活定義:每分鐘水解木聚糖產生I μ mo I木糖的酶量定義為一個酶活單位。1%木聚糖(Sigma birchwood xylan)溶液的組成:Ig 木聚糖溶于 10OmT, 20mM 朽1檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(PH6.0)中。DNS溶液的組成:50g 3，5_ 二硝基水楊酸溶于4L水中，不斷攪拌，緩緩加入80gNa0H,使之完全溶解，繼續攪拌，將1500g酒石酸鉀鈉分數次加入，并小心加熱，溶液最高溫度不超高45°C。冷卻至室溫后定容至5L。如果溶液不澄清，用Whatman I號濾紙過濾，然后棕色瓶室溫貯藏。 制作DNS標準曲線，將酶液測定結果與DNS標準曲線比對，得到酶液中酶活量。對照組:同時將空載體pET_28a(+)轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)，篩選驗證，得到含有空載體pET-28a(+)的陽性克隆，記作BL21-pET-28a(+)，作為對照菌。按照上述步驟將對照菌進行酶的表達和純化，對純化得到的液體進行酶活檢測。實驗設3次重復，實驗組檢測均具有木聚糖酶活性，而對照組均未檢測到木聚糖酶酶活。( 二)酶熱穩定性的檢測:取在特定溫度下處理不同時間的木聚糖酶酶液進行剩余酶活的測定。根據剩余酶活曲線計算其半衰期(t1/2)。剩余酶活) = P/PmaX*100%。其中P為木聚糖酶在70°C或80°C條件下分別處理不同時間，取樣后迅速置于冰上，在50°C，pH 6.0條件下測定的酶活。Pmax為木聚糖酶未進行熱處理在50°C，pH 6.0條件下測定的酶活。半衰期(t1/2)的定義:酶失活至原來活性一半時所需時間。實驗設3次重復。差示掃描量熱儀[Nano DSC (TA instruments)]測定木聚糖酶Tm值。酶蛋白的變性溫度(Tm值)定義:是在連續升溫的過程中，50%蛋白發生變性時所對應的溫度。DSC測定的升降溫速率為1°C/min,木聚糖酶蛋白濃度為1.0mg/mL。為防止在升溫過程中樣品的蒸發，所有的DSC實驗均維持3atm的壓力。實驗數據用Nano DSC自帶的DSCRun軟件進行分析處理。蛋白質DSC曲線的吸熱峰所指征的溫度即為該蛋白的Tm值。實驗設3次重復。(四)最適溫度比較木聚糖酶在不同溫度下的酶活，測定其最適溫度。最適溫度的測定是在20mM檸檬酸緩沖液(PH6.0)中于不同溫度下(30-90°C )進行酶促反應，測定木聚糖酶酶活。實驗設3次重復。二、木聚糖酶AnxB的突變體(AnxB_M2)的制備及穩定性檢測(一 )木聚糖酶突變體(AnxB_M2)的制備
實驗組:1、重疊延伸PCR擴增AnxB_M2基因(I)以pET-AnxB質粒為模板，以Pl和AnxB_P2為引物擴增AnxB_M2基因上游片段，以P2和AnxB-Pl為引物擴增AnxB_M2基因下游片段。(2)膠回收步驟(I)中擴增的上下游片段，并以回收的上下游片段為模板，以Pl和P2為引物，PCR擴增得到AnxB-M2全長基因片段。2、酶切、連接用NdeI和EcoRI雙酶切重疊延伸PCR擴增產物，與預先使用NdeI和EcoRI雙酶切的pET-28a(+)進行連接，得到重組載體；3、轉化、篩選以及測序驗證用氯化鈣化學轉化法將重組質粒轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)，用含有卡拉霉素(50 μ g/ml)的LB培養基·進行篩選培養，挑取單菌落，并進行擴大培養和提取質粒，進行測序驗證，結果獲得序列表中序列3所示基因(編碼序列4所示蛋白)，表明得到插入基因序列正確的陽性克隆；將陽性克隆記作BL21-pET-AnxB-M2，將陽性質粒記作pET-AnxB_M2。也可按照常規的其它方法制備得到序列3所示基因，如人工合成。序列4所示蛋白(即AnxB木聚糖酶5個氨基酸共同突變體)與序列2所示蛋白(即AnxB木聚糖酶)相比，存在以下差別:序列4自N端起第8位氨基酸突變成Y、自N端起第9位氨基酸突變成H，自N端起第10位氨基酸突變成D，自N端起第12位氨基酸突變成Y，自N端起第13位氨基酸突變成F。4、酶的表達:方法與實驗一中所述相同。5、酶的純化:方法與實驗一中所述相同。6、目的酶液的酶活檢測:方法與實驗一中所述相同。對照組:同時將空載體pET_28a(+)轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)，篩選驗證，得到含有空載體pET-28a(+)的陽性克隆，記作BL21-pET-28a(+)，作為對照菌。按照上述步驟將對照菌進行酶的表達和純化，對純化得到的液體進行酶活檢測。實驗設3次重復，實驗組檢測均具有木聚糖酶活性，而對照組均未檢測到木聚糖酶酶活。(二)酶熱穩定性的檢測方法與實驗一中所述相同。實驗設3次重復。(三)Tm值測定方法與實驗一中所述相同。實驗設3次重復。(四)最適溫度:方法與實驗一中所述相同。實驗設3次重復。結果表明AnxB_M2的熱穩定性得到的明顯的提高。木聚糖酶AnxB在引入這五個氨基酸殘基的突變后，在55°C的半衰期由原來的12.2min提高到75.6min(圖1A和表2)。Tm值也由原來的54.1°C提高到63.2 V (圖1B和表2)。表I用于克隆木聚糖酶及其突變基因的引物
權利要求
1.一種蛋白質，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。
2.權利要求1所述蛋白質的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因為核苷酸序列如序列表中序列3所示的DNA。
4.含有權利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系、重組病毒或表達盒。
5.權利要求1所 述蛋白質在作為木聚糖酶中的應用。
全文摘要
本發明公開了木聚糖酶AnxB及其編碼基因。該木聚糖酶SoxB為氨基酸序列如序列表中序列4所示的蛋白質。實驗證明，本發明木聚糖酶，在保持原有木聚糖酶特性的基礎上，其半衰期顯著延長，Tm值顯著增高，最適溫度也顯著提高。因此，本發明的木聚糖酶在木聚糖應用領域將有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/56GK103184203SQ20111045006
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者張山, 董志揚 申請人:中國科學院微生物研究所